Производные 5-ариламиноурацила как потенциальные фармакологические агенты двойного действия

Полный текст

ВВЕДЕНИЕ На сегодняшний день ВИЧ-инфекция и туберкулез (ТБ) считаются основными причинами смертности от инфекционных заболеваний в мире. Согласно последним оценкам ВОЗ, в 2013 году туберкулезом заболели 9 млн человек, умерли - 1.5 млн (из них у 360000 ТБ был ассоциирован с ВИЧ) [1]. В 2013 году в мире насчитывалось 35 млн больных СПИДом. В 2013 году ВИЧ-инфекция была выявлена у 2.1 млн человек, от СПИДа умерли 1.5 млн, причем ТБ остается основной причиной смерти больных с двойным инфицированием (66.5%) [2]. У ВИЧ-инфицированных повышен риск реактивации латентной формы туберкулеза (50% по сравнению с 10%), у больных ТБ ВИЧ-инфицированных отмечается высокий риск летального исхода. ВИЧинфицированные лица, принимающие противотуберкулезные препараты в стандартном 6-месячном режиме, имеют больший риск развития рецидива, чем больные туберкулезом, получающие более длительный курс терапии [3]. Таким образом, одновременное заражение ТБ и ВИЧ представляет собой очень серьезную проблему и делает актуальным поиск препаратов двойного действия. Недавно нами было показано, что определенные производные 5-ариламиноурацила обладают способностью влиять на активное деление клеток Mycobacterium tuberculosis. Полное ингибирование роста микобактерий соединениями (2), (3), (6), (7), (10), (15)-(17) и (19) (рис. 1) наблюдалось в концентрациях 5-40 мкг/мл, причем одно из них (19) проявило более высокую активность против штамма MS-115 с множественной лекарственной устойчивостью, включая пять основных противотуберкулезных препаратов первой линии (изониазид, рифампицин, стрептомицин, этамбутол и пиразинамид), чем в отношении чувствительного лабораторного штамма H37Rv [4]. Данная работа посвящена оценке производных 5-ариламиноурацила в качестве ННИОТ ВИЧ и более детальному изучению токсичности представителей соединений данной группы. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ Соединения (1)-(20) были синтезированы как описано ранее [4]. 1-(4’-Гидрокси-2’-циклопентен-1’-ил)-3-бензил-5(фениламино)урацил (21) К раствору соединения (11) (50 мг, 0.18 ммоль) в 5 мл диметилформамида (ДМФА) добавляли K2CO3 (36 мг, 0.26 ммоль) и BnBr (42 мкл, 0.35 ммоль). Реакционную массу перемешивали в течение 24 ч при комнатной температуре. Ход реакции контролировали при помощи ТСХ. Растворитель удаляли в вакууме масляного насоса. Остаток очищали колоночной хроматографией на силикагеле, элюировали системой СHCl3-CH3OH (98 : 2). Получили 43 мг продукта (21) (66%) в виде желтоватого порошка. Rf = 0.32 (СHCl3-CH3OH, 98 : 2). 1H-ЯМР (CHCl3): 7.50-7.49 (2H, м, H3, H5-Bn), 7.32-7.23 (6H, м, H2”, H3”, H5”, H6”, H2, H6-Bn), 6.95-6.93 (2H, м, H5, H4-Bn), 6.90-6.88 (1H, т, H4”), 6.20- 6.18 (1Н, м, H2’), 6.01 (1Н, с, NH), 5.84-5.82 (1H, м, H3’), 5.61-5.58 (1H, м, H1’), 5.23-5.16 (2H, д, J = 13.70, СН2), 4.84-4.83 (1H, м, H4’), 2.86-2.85 (1H, м, Hа5’), 1.70-1.66 (1H, м, Hb5’). 13C-ЯМР (CHCl3): 160.80, 149.73 (C-4, C-2), 142.34 (C-4’’), 139.24 (C-2’), 138.19 (C-4 Bn), 132.40 (C3’), 129.63 (C-3’’, C-5’’), 129.34 (C-3, C-5 Bn), 128.63 (C2’’, C-6’’), 127.91 (C-1’’), 121.18 (C-1 Bn), 119.50 (C-5), 117.19 (C-6), 113.11 (C-2, C-6, Bn), 74.99 (C-1’), 61.05 (C-4’), 45.49 (C-5’), 39.94 (CH2). 1-(4’-Гидрокси-2’-циклопентен-1’-ил)-3-бензил-5(п-метилфениламино)урацил (22) Синтез проводили аналогично (21) исходя из соединения (12). Получили 35 мг продукта (22) (68%) в виде бело-желтого порошка. Rf = 0.43 (СHCl3-CH3OH, 98 : 2). 1H-ЯМР (CHCl3): 7.50-7.48 (2H, м, H3, H5-Bn), 7.31-7.23 (4H, м, H2, H4, H6-Bn, H5), 7.06-7.04 (2H, м, H3”, H5”), 6.87-6.85 (2H, м, H2”, H6”), 6.18-6.16 (1Н, м, H2’), 5.94 (1Н, с, NH), 5.83-5.81 (1H, м, H3’), 5.58-5.56 (1H, м, H1’), 5.23-5.16 (2H, д, J = 13.76, СН2), 4.84-4.82 (1H, м, H4’), 2.87-2.83 (1H, м, Hа5’), 2.26 (3Н, с, СН3), 1.69-1.65 (1H, м, Hb5’). 13C-ЯМР (CHCl3): 160.75, 149.66 (C-4, C-2), 139.57 (C-4’’), 139.14 (C-2’), 138.19 (C-4 Bn), 132.40 (C-3’), 130.14 (C-3’’, C-5’’), 129.33 (C-3, C-5, Bn), 128.67 (C-2’’, C-6’’), 127.88 (C-1’’), 120.23 (C-1, Bn), 117.86 (C-2, C-6, Bn), 117.66 (C-5), 114.39 (C-6), 75.02 (C-1’), 61.12 (C-4’), 45.45 (C-5’), 39.94 (CH2), 20.76 (СН3). Анти-ВИЧ-активность Выделение рекомбинантной обратной транскриптазы ВИЧ-1 (гетеродимер р66/р51) и определение ее активности проводили как описано ранее [5, 6]. В качестве количественной характеристики ингибиторной активности соединений использовали константу ингибирования (Ki), рассчитанную по методу Диксона [7], для неконкурентных ингибиторов. В качестве контроля использовали ННИОТ первого поколения - невирапин. Цитотоксичность in vitro Препараты испытывали на цитотоксичность на культурах клеток МТ-4 с использованием автоматической системы подсчета клеток (ChemoMetec). Число жизнеспособных и мертвых клеток подсчитывали в контрольных и обработанных препаратами (6), (7) или (19) культурах. Препараты (6) и (7) тестировали в концентрациях 0.136-33 мкM (0.035-9 мкг/мл), а препарат (19) - в концентрациях 0.272-66 мкМ (0.119-28 мкг/мл). Жизнеспособные и мертвые клетки различали по накоплению йодата пропидия согласно инструкции производителя. Данные накапливали и анализировали с помощью программы Nucleoview (версия 1.0 ChemoMetec). Токсичность ex vivo Цитотоксичность препаратов (6), (7) и (19) определяли в тканях миндалин человека. Для каждой экспериментальной точки 27 тканевых фрагментов инкубировали с препаратом (19) (20 мкг/мл) или с препаратами (6) или (7) (5 мкг/мл). Фрагменты ткани культивировали в течение 12 дней. Затем из контрольных и опытных образцов выделяли клетки, которые окрашивали комбинациями флуоресцентно меченных антител против CD3-QD605, CD4-QD655, CD8-QD705, CD25-APC, CD38-PE, HLA-DR-APC-Cy7, CXCR4-Brilliant violet 421, CCR5-PR-Cy5 CD45RA-FITC и CCR7-PE-Cy7 (Caltag Laboratories; Biolegend). Количество клеток различных фенотипов в выделенных суспензиях определяли с помощью проточной цитофлуорометрии как описано ранее [8]. Объем анализированной суспензии контролировали с помощью бусинок Trucount (Becton Dickinson), подсчитанное число клеток нормировали по весу тканевых фрагментов, из которых они были выделены. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Структурное подобие соединений (1)-(20) синтезированным нами ранее производным урацила, которые являются ННИОТ ВИЧ [9, 10], дало нам основание предположить, что и эти вещества могут обладать сходными свойствами. Соединения (1)-(20) принадлежат к двум группам: (1)-(10) представляют собой 5-ариламинопроизводные урацила, а (11)-(20) содержат один или два дополнительных 4’-гидроксициклопентеновых фрагмента и могут, таким образом, рассматриваться как 5’-норкарбоциклические аналоги 2’,3’-дидезокси-2’,3’-уридина. Несмотря на известную структурную близость с нуклеозидами, 5’-норкарбоциклические аналоги способны ингибировать обратную транскриптазу ВИЧ по неконкурентному механизму, связываясь в так называемом гидрофобном «центре связывания ненуклеозидных ингибиторов» [9, 10]. Однако соединения (1)-(20), ингибирующие рост M. tuberculosis, не обладали способностью ингибировать обратную транскриптазу ВИЧ1 (Ki >> 200 мкМ). Единственным исключением стало соединение (15) (Ki = 119 мкМ), относящееся к классу 5’-норкарбоциклических аналогов уридина. С целью повышения анти-ВИЧ-активности представителей данного класса путем увеличения их гидрофобности были синтезированы N3бензилпроизводные (21) и (22) (рис. 2). Эти соединения были получены с приемлемыми выходами (61-69%) реакцией исходных карбоциклических аналогов (11) и (12) с бензилбромидом в присутствии поташа. Структуры и чистота синтезированных соединений были подтверждены методами 1Н- и 13С-ЯМР-спектроскопии и ТСХ. Ингибиторная активность производного (22) в отношении обратной транскриптазы ВИЧ-1 оказалась несколько выше, чем у (21) (Ki = 60 и >100 мкМ соответственно) и исходных соединений (11) и (12). Ранее мы оценили цитотоксичность синтезированных соединений на культурах клеток Vero, A549, Huh7 и показали, что они нетоксичны вплоть до концентрации 50 мкг/мл (CD50 >> 100 мкM). Токсичность соединений (6), (7) и (19), проявивших наиболее выраженные противотуберкулезные свойства, мы дополнительно исследовали in vitro на культуре клеток МТ-4 и ex vivo на системе ткани миндалин человека. На клетках МТ-4 соединения не проявили ни цитотоксических, ни цитостатических свойств в концентрациях вплоть до максимальных: 66 мкМ для (19), 33 мкМ для (6) и (7). Оценка цитотоксичности соединений (20 мкг/мл для (19) и 5 мкг/мл для (6) и (7)) на разных типах клеток в тканевой системе показала отсутствие существенной гибели T-клеток (CD3+), B-клеток (CD3-), CD4+ и CD8+ T-лимфоцитов, а также подгрупп CD4+ лимфоцитов: наивных (CD45RA+/CCR7+), центральных клеток памяти (CD45RA-/CCR7+), эффекторных клеток памяти (CD45RA-/CCR7-), дифференцированных эффекторных клеток памяти (Temra, CD45RA+/CCR7-), а также актированных CD4+ Т-лимфоцитов. Последние определяли как CD4+/CD25+, CD4+/CD38+ Т-клетки или CD4+/HLA-DR+. Во всех этих группах число клеток в обработанных препаратами и контрольных тканях не различалось. Таким образом, хотя новые производные 5-ариламиноурацила и не показали значительной антиВИЧ-активности, однако, даже слабая активность соединений (15) и (22) говорит о наличии их сродства к обратной транскриптазе ВИЧ-1. Структурное подобие соединений такого типа многим высокоактивным противовирусным агентам ненуклеозидной природы, применяемым при ВИЧ-инфекции в качестве компонентов комплексной высокоинтенсивной антиретровирусной терапии [11], в сочетании с выраженной противотуберкулезной активностью делает их интересными для дальнейших модификаций.

Об авторах

E. С. Матюгина

Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН

Email: khandazhinskaya@bk.ru
Россия

M. С. Новиков

Волгоградский государственный медицинский университет

Email: khandazhinskaya@bk.ru
Россия

Д. A. Бабков

Волгоградский государственный медицинский университет

Email: khandazhinskaya@bk.ru
Россия

В. T. Валуев-Элистон

Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН

Email: khandazhinskaya@bk.ru
Россия

К. Ванпуль

Eunice Kennedy-Shriver National Institute of Child Health and Human Development

Email: margolil@helix.nih.gov
США

С. Зикари

Eunice Kennedy-Shriver National Institute of Child Health and Human Development

Email: margolil@helix.nih.gov
США

A. Корона

University of Cagliari

Email: khandazhinskaya@bk.ru
Италия

E. Трамонтано

University of Cagliari

Email: khandazhinskaya@bk.ru
Италия

Л. Б. Марголис

Eunice Kennedy-Shriver National Institute of Child Health and Human Development

Email: margolil@helix.nih.gov
США

A. Л. Хандажинская

Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН

Автор, ответственный за переписку.
Email: khandazhinskaya@bk.ru
Россия

С. Н. Кочетков

Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН

Email: khandazhinskaya@bk.ru
Россия

Список литературы

Дополнительные файлы