Дипептидный лиганд транслокаторного белка ГД-23 проявляет анксиолитическую и ноотропную активности

Полный текст

ВВЕДЕНИЕ Эпидемиологические данные свидетельствуют о широком распространении тревожных расстройств [1]. В качестве анксиолитиков быстрого действия применяются бензодиазепины, связывающиеся с αи γ-субъединицами ГАМКА-рецептора и вызывающие аллостерически усиление трансмиссии ГАМКА [2]. Наряду с высокой эффективностью бензодиазепины обладают рядом побочных эффектов - седацией, миорелаксацией, когнитивными нарушениями, а при их длительном применении возникают толерантность и зависимость. В настоящее время существуют две основные стратегии разработки анксиолитиков быстрого действия, свободных от побочных эффектов. Первая состоит в создании высокоселективных агонистов α2и α3-субъединиц ГАМКА-рецепторов, опосредующих анксиолитический эффект [2]. Вторая стратегия [1] заключается в разработке фармакологически активных лигандов транслокаторного белка (TSPO), также известного как периферический бензодиазепиновый рецептор. TSPO локализован на внешней мембране митохондрий в основном в клетках, продуцирующих стероидные гормоны, включая клетки центральной и периферической нервной системы [3]. TSPO участвует в трансмембранном транспорте холестерина из цитоплазмы в митохондриальный матрикс, этот процесс считается ключевым этапом синтеза нейростероидов [4]. Как известно, нейростероиды являются эндогенными лигандами ГАМКА-рецепторов, вызывающими анксиолитическое действие. Анксиолитические свойства некоторых нейростероидов, например прегнанолона, хорошо изучены [5]. TSPO и нейростероиды вовлечены в патогенез тревожных расстройств. Так, содержание TSPO в клетках крови, а также нейростероидов в крови и спинномозговой жидкости снижено у людей с тревожными расстройствами [6, 7]. Нейростероиды и бензодиазепины связываются с разными сайтами ГАМКА-рецептора [1], что определяет различия в их фармакологическом действии. Многочисленные исследования in vitro и in vivo показали, что лиганды TSPO стимулируют нейростероидогенез [5]. Лиганды TSPO изучают в качестве селективных анксиолитиков быстрого действия [5, 8]. В НИИ фармакологии им. В.В. Закусова РАМН с использованием стратегии создания коротких пептидов с заданной фармакологической активностью на основе структур непептидных лекарственных препаратов [9] был сконструирован топологический аналог анксиолитика Алпидема (первого соединения из группы пиразолпиримидиновых лигандов TSPO), представляющий собой замещенный дипептид амид N-карбобензокси-L-триптофанил-Lизолейцина (ГД-23). Этот дипептид, как и Алпидем, содержит два ароматических фармакофора и один алифатический, сходным образом расположенные в пространстве относительно друг друга. ГД-23 был получен методом классического пептидного синтеза в растворе с использованием активированных N-оксисукцинимидных эфиров. Цель данной работы состояла в выявлении фармакологического спектра действия ГД-23, включающего анксиолитический и ноотропный эффекты. Для подтверждения вовлеченности TSPO в эффекты дипептида ГД-23 анализировали его антагонизм со специфическим лигандом-антагонистом TSPO - соединением PK11195. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ Вещества Амид N-карбобензокси-L-триптофанил-Lизолейцина (ГД-23) синтезирован в НИИ фармакологии им. В.В. Закусова как описано ранее [10]. Тпл. 214-216оС, [α]D 20 - 23° (c 1; DMF), cпектр 1H-ЯМР (DMSO-d6) δ, м.д.: 0.80 (3 H, т, CδH3 Ile), 0.83 (3 H, д, Cγ°H3 Ile), 1.07 и 1.44 (2 H, два м, CγH2 Ile), 1.72 (1 H, м, CβH Ile), 2.92 и 3.11 (2 H, два дд, CβH Trp), 4.17 (1 H, дд, CαH Ile), 4.34 (1 H, м, CαH Trp), 4.93 и 4.98 (2 Н, 2 д, -ОСН2С6Н5), 6.95-7.28 (10 H, м, -ОСН2С6Н5, индол), 7.46 (1 H, д, NH Trp), 7.77 (1 H, д, NH Ile), 7.41 и 7.13 (2 H, два с, NH2 амид), 10.80 (1 H, c, NH индол). Элементный анализ соответствует брутто-формуле C25H30N4O4, данные отклоняются от теоретических не более чем на 0.4%. Хроматографическая гомогенность подтверждена методом тонкослойной хроматографии и ВЭЖХ. Скополамин и ингибитор PK11195 (N-метил-N-(1-метил-пропил)амид 1-(2-хлорфенил)-изохинолин-3-карбоновой кислоты) получены в компании Sigma-Aldrich (США). Дипептид ГД-23 и соединение PK11195 суспендировали в 0.05% водном растворе Твин-80 из расчета 2 мл/кг массы тела крыс и вводили внутрибрюшинно (в/б). ГД-23 вводили в дозах 0.05; 0.5; 0.1; 1 и 5 мг/кг (мышам и крысам), а PK11195 в дозах 10 (мышам) и 3 мг/кг (крысам) [5]. Скополамин разводили в физиологическом растворе из расчета 1 мл/кг массы тела крыс и вводили подкожно (п/к) в дозе 2 мг/кг. Контрольным животным вместо ГД-23 и/или PK11195 вводили 0.05% водный раствор Твин80 (в/б), а вместо скополамина - физраствор (п/к). Животные Эксперименты были выполнены на 107 беспородных крысах-самцах массой 350-480 г, полученных в филиале «Столбовая» Научного центра биомедицинских технологий Федерального медико-биологического агентства, и 80 мышах-самцах СD1 массой 19-25 г, полученных в питомнике лабораторных животных «Пущино» при Филиале Института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН. Животных содержали в контролируемых условиях вивария (температура 20-22°C, 12-часовой цикл освещения) при свободном доступе к пище и воде. Эксперименты выполняли в светлое время суток с 10.00 до 14.00 ч по местному времени. Животных распределяли по группам произвольным образом по критерию массы тела. Перед опытом животных выдерживали в экспериментальной комнате в «домашних» клетках в течение 24 ч. При работе соблюдали требования, сформулированные в Директивах Совета Европейского сообщества 86/609/ЕЕС об использовании животных для экспериментальных исследований. Все манипуляции с животными были одобрены биоэтической комиссией Института (протокол заседания № 1 от 15.09.2014). ИЗУЧЕНИЕ АНКСИОЛИТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ ГД-23 Тест «Приподнятый крестообразный лабиринт» (ПКЛ) Метод ПКЛ широко используется в настоящее время для оценки анксиолитического действия [11]. Установка ПКЛ для мышей была выполнена из поливинилхлорида серого цвета и представляла собой две пересекающиеся под прямым углом горизонтальные дорожки 65 × 5 см. Два противоположных отсека имели непрозрачные вертикальные стенки высотой 15 см. Лабиринт был приподнят от пола на 40 см. В месте перекрестья плоскостей находилась открытая центральная платформа размером 5 × 5 см. Животное помещали в центр установки. В течение 5 мин регистрировали число заходов и время пребывания в закрытых и открытых рукавах. Анксиолитическую активность ГД-23 оценивали на основе следующих параметров: времени, проведенного в открытых рукавах; числа заходов в открытые рукава, а также наиболее адекватного параметра (не зависящего от уровня двигательной активности и времени, проведенного в центре установки) - времени в открытых рукавах и числа заходов в открытые рукава в процентах по отношению соответственно к суммарному времени и к числу заходов в открытые и закрытые рукава [11]. Дизайн исследования Дипептид ГД-23 вводили животным за 30 мин до теста. В эксперименте по изучению антагонизма ГД23 с блокатором TSPO соединение PK11195 вводили за 30 мин до ГД-23. ИЗУЧЕНИЕ НООТРОПНОЙ АКТИВНОСТИ ГД-23 Тест распознавания нового объекта Тест распознавания нового объекта основан на естественном для животных предпочтении новизны и позволяет оценить рабочую память [12]. Крысу сажали в клетку T4 с опилками, идентичную ее домашней клетке, и давали ей 5 мин для адаптации. В качестве объектов использовали банки с жидкостью объемом 0.33 л: металлические, герметично закрытые металлическими крышками, желто-оранжевого цвета, и стеклянные, герметично закрытые, зеленого цвета. Критериями выбора объектов служили различия по форме, цвету и материалу при примерно одинаковом размере; вес, достаточный для того, чтобы крыса не могла их легко уронить и перемещать по клетке; относительно простая форма, не предполагающая предпочтительность для животного одного объекта перед другим. Тест состоял из фазы ознакомления и тестовой фазы. В фазу ознакомления в два ближайших угла клетки помещали два одинаковых незнакомых для крысы объекта. В течение 4 мин регистрировали время исследования крысой каждого объекта, после чего объекты убирали. Перерыв между фазой ознакомления и тестом - 3 мин, в это время животное оставляли в клетке, где проводился тест. В фазу теста в те же углы клетки, что и в фазу ознакомления, помещали новую пару объектов, в которой один объект был идентичен объектам, предъявлявшимся ранее, а второй был незнакомым. В течение 4 мин регистрировали время исследования знакомого и нового объектов. Позиции знакомого и нового объектов (правый и левый угол) меняли от животного к животному. Перед каждым тестом объекты протирали спиртом для уничтожения меток, оставленных предыдущим животным. Исследованием считали обнюхивание, когда нос животного находился на расстоянии не более 2 см от объекта. Для оценки рабочей памяти крыс использовали коэффициент дискриминации (Кд) [13], который рассчитывали по формуле: Кд = (время (нов) - время (знаком))/(время (нов) + время (знаком)) × 100%, где «время (нов)» и «время (знаком)» - время исследования нового и знакомого объектов в фазу теста соответственно. Дизайн исследования Амнезия, вызванная блокатором центральных м-холинорецепторов скополамином, используется в качестве модели для выявления ноотропных свойств фармакологических соединений [14, 15]. ГД-23 вводили за 1 ч до скополамина. Через 30 мин после введения скополамина проводили тест распознавания нового объекта. В эксперименте по изучению антагонизма ГД-23 с блокатором TSPO соединение PK11195 вводили через 30 мин после ГД-23. Через 30 мин после инъекции скополамина проводили тест распознавания нового объекта. Статистическая обработка Межгрупповые различия анализировали с помощью непараметрического U-критерия Манна-Уитни с поправкой Бонферрони. Результаты считали статистически значимыми при p < 0.05. Данные представляли в виде средних и стандартных отклонений или в виде медиан и интерквартильных интервалов. РЕЗУЛЬТАТЫ ГД-23 проявляет анксиолитическую активность в тесте ПКЛ В тесте ПКЛ дипептид ГД-23 в дозе 0.1 и 0.5 мг/кг статистически значимо увеличивал как время пребывания мышей в открытых рукавах (в 5-6 раз по сравнению с контролем), так и число заходов в открытые рукава (в 2-3 раза). Кроме того, ГД-23 в 5-6 раз увеличивал время (%) пребывания в открытых рукавах по отношению к суммарному времени в открытых и закрытых рукавах, что считается наиболее адекватным критерием анксиолитического действия (табл. 1). Таким образом, ГД-23 в дозе 0.1 и 0.5 мг/кг проявлял выраженную анксиолитическую активность. Анксиолитический эффект ГД-23 зависит от взаимодействия с TSPO Предварительное введение антагониста TSPO - соединения PK11195 - в дозе 10.0 мг/кг практически полностью блокировало анксиолитический эффект объектов, что выражалось в уменьшении Кд в группе «скополамин» примерно в 4 раза по сравнению с контролем. Дипептид ГД-23 в дозе 0.05, 0.1 и 0.5 мг/кг статистически значимо противодействовал скополаминовой амнезии с наиболее выраженным эффектом в дозе 0.1 мг/кг, а в дозе 1.0 мг/кг вызывал тенденцию к снижению эффекта скополамина (рисунок). Ноотропный эффект ГД-23 в условиях скополаминовой амнезии у крыс обусловлен взаимодействием с TSPO Введение антагониста TSPO PK11195 полностью блокировало ноотропный эффект ГД-23. Коэффициенты дискриминации (отражающие рабочую память) у крыс, получивших ГД-23 и PK11195 на фоне скополаминовой амнезии, и у животных, получивших только скополамин, не отличались (табл. 3). Сам PK11195 не влиял на поведение животных в данном тесте. Таким образом, как и в случае анксиолитического эффекта, ноотропный эффект ГД-23 обусловлен, по-видимому, его взаимодействием с TSPO. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ Установлено, что дипептидное соединение ГД-23, сконструированное на основе первого представителя группы пиразолпиримидиновых лигандов TSPO Алпидема, обладает выраженной анксиолитической и ноотропной активностями в интервале доз 0.05-0.5 мг/кг при в/б введении. Анксиолитическая и ноотропная активности ГД-23 практически полностью блокируются антагонистом TSPO PK11195, что свидетельствует об участии TSPO в фармакологических эффектах ГД-23. Лиганды TSPO с анксиолитической активностью разрабатываются рядом научных групп. Так, в Институте фармакологии и токсикологии Пекина (КНР) разрабатывается соединение YLIPA08 [N-этил-N-(2-пиридинилметил)-2-(3,4ихлорфенил)-7-метилимидазо-[1, 2-a]-пиридин3-ацетамидгидрохлорид], которое проявляет анксиолитическую и антидепрессивную активности при пероральном введении на модели постстрессового тревожного расстройства у мышей, а также увеличивает содержание аллопрегнанолона в коре головного мозга и плазме крови у крыс на той же модели [8]. В настоящее время это соединение находится на этапе доклинических исследований. В компании Dainippon Pharmaceutical (Осака, Япония) изучено соединение AC-5216 (XBD173, [N-бензил-N-этил-2(7,8-дигидро-7-метил-8-оксо-2-фенил-9H-пурин-9ил)ацетамид]), обладающее при пероральном применении анксиолитической и антидепрессивной активностью в ряде тестов, при этом не оказывающее миорелаксирующего эффекта и не ухудшающее память [5]. К сожалению, клинические испытания соединения XBD173 были прекращены на фазе II в связи отсутствием выраженного терапевтического эффекта [ClinicalTrials.gov identifier: NCT00108836]. Известные на настоящий момент лиганды TSPO - это изохинолиновые карбоксамиды, бензоксазепины, производные индола, имидазопиридины, производные феноксифенилацетамида, пиразолопиримидины [16]. Нами впервые создан лиганд TSPO пептидной природы. Преимуществами пептидных препаратов являются высокая активность, низкая токсичность, меньшая вероятность развития толерантности и зависимости. Соединение ГД-23 проявляет не только выраженную анксиолитическую активность, но и ноотропный эффект на модели скополаминовой амнезии. Этот эффект ГД-23 можно предположительно объяснить, как и его анксиолитический эффект, стимуляцией синтеза нейростероидов, характерной для агонистов TSPO. Известно, что некоторые нейростероиды, в частности аллопрегнанолон, дегидроэпиандростерон, кортизол и кортикостерон, стимулируют память и обучение, а снижение их содержания при различных патологических состояниях или при старении коррелирует с когнитивным дефицитом [17]. Таким образом, в отличие от бензодиазепинов, одним из побочных эффектов которых является ухудшение когнитивных функций, ГД-23 обладает ноотропными свойствами. Причем эти свойства ГД-23 проявляет в тех же дозах, что и анксиолитические. Кроме того, ГД-23 не влияет на спонтанную двигательную активность мышей (данные не приводятся), что свидетельствует об отсутствии у ГД-23 в изученом диапазоне доз седативных свойств. Полученные данные свидетельствуют о перспективности разработки дипептидного лиганда TSPO ГД-23 в качестве потенциального анксиолитика быстрого действия, не обладающего побочными эффектами бензодиазепинов.

Об авторах

П. Ю. Поварнина

Научно-исследовательский институт фармакологии им. В.В. Закусова РАМН

Автор, ответственный за переписку.
Email: povarnina@gmail.com
Россия

С. A. Ярков

Научно-исследовательский институт фармакологии им. В.В. Закусова РАМН

Email: povarnina@gmail.com
Россия

T. A. Гудашева

Научно-исследовательский институт фармакологии им. В.В. Закусова РАМН

Email: povarnina@gmail.com
Россия

M. A. Яркова

Научно-исследовательский институт фармакологии им. В.В. Закусова РАМН

Email: povarnina@gmail.com
Россия

С. Б. Середенин

Научно-исследовательский институт фармакологии им. В.В. Закусова РАМН

Email: povarnina@gmail.com
Россия

Список литературы

Дополнительные файлы