Мутации в гене PARK2, ассоциированном с болезнью Паркинсона, сопровождаются разбалансировкой систем программируемой клеточной гибели

Обложка

Цитировать

Полный текст

Аннотация

Болезнь Паркинсона обусловлена дегенерацией дофаминергических нейронов среднего мозга. Причиной редкой рецессивной формы этого заболевания могут быть мутации гена PARK2, продукт которого, паркин, контролирует процессы митофагии и программируемой клеточной гибели. Определен уровень про- и антиапоптотических факторов семейства Bcl-2 в дофаминергических нейронах, полученных из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток здорового донора и пациента с болезнью Паркинсона - носителя мутаций PARK2. Методом Вестерн-блотинга проанализированы соотношения белков Bax, Bak, Bcl-2, Bcl-XL и Bcl-W. Показано, что уровень проапоптотического белка Bak в PARK2-нейронах вдвое ниже по сравнению со здоровыми клетками. Напротив, экспрессия антиапоптотических факторов Bcl-XL, Bcl-W и Bcl-2 статистически значимо увеличена в мутантных клетках по сравнению со здоровыми дофаминергическими нейронами. Полученные результаты показывают, что мутации PARK2 сопровождаются разбалансировкой систем программируемой клеточной гибели, в которой ведущая роль принадлежит неапоптотическим молекулярным механизмам.

Полный текст

Болезнь Паркинсона (БП) - распространен ное нейродегенеративное заболевание, об условленное поражением пигментирован ных нейронов компактной части черной субстанции среднего мозга и дегенерацией дофаминергического нигростриатного пути. Лечение при БП носит лишь симптоматический характер и не предотвращает дальнейшей гибели нигральных клеток, что дикту ет необходимость идентификации ключевых звеньев патогенетического каскада болезни [1]. В развитии БП важная роль принадлежит гене тике. Примерно 10% всех случаев БП представлены моногенными формами [1, 2], а остальные (спора дические) случаи имеют многофакторную природу. На сегодняшний день известно 20 генетических ло кусов БП [2]. Один из вовлекаемых генов, PARK2, расположен на хромосоме 6q25.2-27 и связан с раз витием особой формы болезни - аутосомно-рецес сивной БП, манифестирующей в раннем возрасте [3]. Мутации PARK2 обусловливают около 15% семейных и 4% спорадических случаев БП с дебютом до 40 лет [3-5]. Ген PARK2 кодирует белок паркин - цитозоль ную убиквитин-E3-лигазу. Основная роль паркина состоит в регуляции митофагии, осуществляемой вместе с митохондриальным белком PINK1 - про дуктом еще одного гена аутосомно-рецессивного паркинсонизма [6]. Последовательность молеку лярных событий выглядит следующим образом: не функциональная митохондрия деполяризируется и тем самым стабилизирует PINK1, после чего тот захватывает паркин из цитозоля и активирует его при доставке к митохондрии за счет PINK1-киназной активности; далее активированный паркин обеспе чивает селективную аутофагию поврежденной ор ганеллы [7]. Таким образом, взаимодействуя друг с другом, паркин и PINK1 осуществляют контроль состояния митохондрий. В настоящее время паркин рассматри вается в качестве поливалентного нейропротектор ного агента, имеющего ключевое значение для выжи вания дофаминергических нейронов при воздействии различных нейротоксинов [8]. Изучение клеточной биологии и нейрохимии PARK2/паркина является чрезвычайно актуальным направлением современной неврологии. Объектом наших исследований стал мутантный паркин, экс прессируемый в клетках пациента с редкой PARK2 ассоциированной формой БП. В качестве модельной системы была выбрана культура обогащенных дофа минергическими нейронами нервных клеток, полу ченных в результате репрограммирования фибро бластов кожи в индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (ИПСК) и их последующей направ ленной дифференцировки [9, 10]. С целью уточнения патогенеза болезни мы изучали динамику ряда про и антиапоптотических факторов в мутантной куль туре в сопоставлении с культурой нейронов, полу ченных от здорового донора. В работе использовали культуры клеток здорово го донора и пациента с аутосомно-рецессивной юве нильной БП, носителя компаунд-гетерозиготных му таций в гене PARK2 (del202-203AG и IVS1+1G/A). Из биоптатов кожи донора и пациента ранее нами были получены фибробласты, которые репрограм мировали при помощи оригинальных лентивирусных векторов с факторами плюрипотентности (LeGOhOCT4, LeGO-hSOX2-IRES-GFP, LeGO-hc-Myc, LeGO-hKLF4) с целью получения клонов ИПСК. Далее клетки были дифференцированы по нейро нальному типу с использованием факторов диффе ренцировки. Методики получения фибробластов и их репрограммирования, а также индукции дифферен цировки ИПСК в специализированные дофаминерги ческие нейроны описаны ранее [10]. Дифференцировку клеток в нейроны подтвержда ли с помощью иммуноцитохимического окрашивания антителами к β-III-тубулину и тирозингидроксилазе (TH). Вестерн-блотинг для определения содержания белков в клеточных культурах проводили по стан дартной методике. Результаты обрабатывали в программах Microsoft Exсel и GraphPad Prism 6. Клеточные линии Po2 и Tr5 при дифференциров ке экспрессировали нейрональные маркеры, кото рые выявляли при помощи иммуноцитохимического окрашивания (рис. 1). Белок β-III-тубулин является классическим маркером ранней нейрональной диф ференцировки, а TH традиционно рассматривает ся как специфический маркер дифференцировки нейронов по дофаминергическому пути. Как видно из рис. 1, дифференцировке подвергаются все ИПСК, поскольку все ядра клеток, окрашенные DAPI, на ходятся в нейронах (позитивных по β-III-тубулину и TH). Количество нейронов, дифференцированных по дофаминергическому пути, составляет около 80% от общего количества клеток, позитивных по β-III тубулину. Оказалось, что соотношение про- и антиапоп тотических факторов в клеточных культурах Po2 и Tr5, полученных соответственно от здорового донора и носителя мутаций в гене PARK2, различается (рис. 2). Концентрация проапоптотического белка Bak в мутантных дофаминергических нейронах Tr5 была статистически значимо ниже (на 58%), чем в клет ках здорового донора в культуре Po2 (p < 0.001). Значимых различий в содержании проапоптоти ческого белка Bax в изучаемых культурах клеток не обнаружено. Содержание антиапоптотических белков Bcl-2, Bcl-W и Bcl-XL оказалось статистически значимо более высоким в клетках Tr5, экспрессирующих му тантный PARK2. Так, концентрация белка Bcl-2 в му тантных клетках была на 222% выше, чем в клетках дикого типа, белка Bcl-W - на 150.5% (в обоих случа ях p < 0.01), а белка Bcl-XL - на 55% (p < 0.05). Каждая проба содержала 20 мкг общего бел ка. Равномерность нанесения белка на гель допол нительно контролировали с использованием белка GAPDH, уровень сигнала которого во всех образцах был одинаковым (рис. 2Б). Описано несколько вариантов программируемой клеточной гибели при БП и других нейродегенера тивных заболеваниях - классический апоптоз, ау тофагический путь, AIF/PARP-зависимый путь, параптоз и др. [11, 12]. В ряде случаев, однако, за кономерности клеточной гибели не соответствуют какому-то одному механизму и имеют комплексный характер. Важную роль в клеточной гибели играет высвобождение из митохондрий цитохрома с [13]. Цитохром с активирует цитозольный белок Apaf-1 и прокаспазу-9 по пути формирования апоптосо мы, и его выброс строго регулируется соотношени ем в клетке про- и антиапоптотических факторов. Дисбаланс в данной системе, выявленный нами в PARK2-скомпромитированных нейронах, может быть связан с функциональными свойствами дефект ного паркина, но это предположение нуждается в до полнительном подтверждении на культурах с нор мальным и мутантным генотипами. Белок паркин действует как митохондриальный нейропротектор. Установлено, в частности, специфи ческое автономное влияние паркина на митохондри альные механизмы, определяющие высвобождение цитохрома с и запуск реакций апоптоза [14]. Недавно идентифицирован паркиноподобный цитоплазма тический белок, ассоциированный с р53 (PARC): как и паркин, он является E3-лигазой и инициирует протеасомную деградацию цитохрома с [15]. Важным этапом защитного действия паркина может быть протеасомная деградация ARTS - митохондриально го белка, инициирующего ранний (до выделения ци тохрома с) этап каспазного пути [16]. Тем не менее де тальные молекулярные механизмы ейропротекции, ассоциированные с паркином, остаются не до конца ясными. Особенность культуры Tr5 состоит в отсутствии нормального паркина, поскольку нейроны данной культуры несут две инактивирующие рецессивные мутации гена PARK2 (делецию со сдвигом рамки del202-203AG и мутацию сплайсинга IVS1+1G/A). Таким образом, в мутантной культуре нарушен се лективный процессинг митохондриальных белков и цитохрома с, осуществляемый паркином. При этом в культуре Tr5 вместо ожидаемой инициации апоп тоза нами выявлено статистически значимое сни жение концентрации проапоптотического белка Bak и, напротив, повышение уровня всех исследо ванных антиапоптотических белков семейства Bcl. Полученные результаты сходны с данными о по вышении уровня Bcl-XL in vivo и in vitro в модели индуцированного паракватом паркинсонизма [17]. Одной из функций паркина считается предотвраще ние транслокации апоптотического белка Bax в ми тохондрии [18], однако нарушение регуляции этого процесса в PARK2-мутантных клетках не затрагивает экспрессию Bax и может не сопровождаться из менением его уровня в культуре. В последние годы большое значение в митохондриальном цитотоксическом каскаде при БП придается микроглиальной активации и воспалению [19], причем эти процессы не требуют индукции митохондриального апоптоза [20], что косвенно подтверждается и нашими данны ми. ВЫВОДЫ 1. Нами представлены характеристики системы Bax/Bak/Bcl при аутосомно-рецессивном паркинсонизме со сложной мутацией PARK2: установлено, что му тации PARK2 приводят к сложной разбалансировке систем программируемой клеточной гибели, ведущая роль в которой принадлежит, по-видимому, неапоп тотическим молекулярным механизмам. 2. Полученные предварительные данные должны быть подтверждены на дофаминергических нейро нах, полученных от других гомозиготных и гетерози готных носителей мутаций гена PARK2. 3. Результаты нашей работы показывают, что раз рабатываемые подходы к терапии нейродегенера тивных заболеваний, связанные с подавлением апоптоза [11, 12], могут оказаться неэффективными при PARK2-ассоциированной БП.

×

Об авторах

Е. В. Коновалова

Научный центр неврологии

Email: snillario@gmail.com
Россия

О. М. Лопачева

Научный центр неврологии; Международный учебно-научный биотехнологический центр Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова

Email: snillario@gmail.com
Россия

И. А. Гривенников

Институт молекулярной генетики РАН

Email: snillario@gmail.com
Россия

О. С. Лебедева

Институт молекулярной генетики РАН

Email: snillario@gmail.com
Россия

Э. Б. Дашинимаев

Институт биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН

Email: snillario@gmail.com
Россия

Л. Г. Хаспеков

Научный центр неврологии

Email: snillario@gmail.com
Россия

Е. Ю. Федотова

Научный центр неврологии

Email: snillario@gmail.com
Россия

С. Н. Иллариошкин

Научный центр неврологии

Автор, ответственный за переписку.
Email: snillario@gmail.com
Россия

Список литературы

  1. Jenner P., Morris H.R., Robbins T.W., Goedert M., Hardy J., Ben-Shlomo Y., Bolam P., Burn D., Hindle J.V., Brooks D. // J. Parkinson’s Dis. 2013, V.3, P.1-11
  2. Bonifati V. // Parkinsonism Relat. Disord. 2014, V.20, S1, P.S23-S28
  3. Zagorovskaya T.B., Illarioshkin S.N., Slominskii P.A., Ivanova-Smolenskaya I.A., Markova E.D., Limborskaya S.A., Levin O.S., Miloserdova O.V., Proskokova T.N., Bagyeva G.H., Bris A. // S.S. Korsakov zhurn. nevrologii i psikhiatrii. 2004, V.8, P.66-72
  4. Periquet M., Lücking C.B., Vaughan J.R., Bonifati V., Dürr A., De Michele G., Horstink M.W., Farrer M., Illarioshkin S.N., Pollak P. // Am. J. Hum. Genet. 2001, V.68, P.617-626
  5. Kilarski L.L., Pearson J.P., Newsway V., Majounie E., Knipe M.D., Misbahuddin A., Chinnery P.F., Burn D.J., Clarke C.E., Marion M.H. // Mov. Disord. 2012, V.27, P.1522-1529
  6. Park J., Lee S.B., Lee S., Kim Y., Song S., Kim S., Bae E., Kim J., Shong M., Kim J.M., Chung J. // Nature 2006, V.441, P.1157-1161
  7. Matsuda N., Sato S., Shiba K., Okatsu K., Saisho K., Gautier C.A., Sou Y.S., Saiki S., Kawajiri S., Sato F. // J. Cell Biol. 2010, V.189, P.211-221
  8. Lim K.L., Ng X.H., Grace L.G., Yao T.P. // Antioxid. Redox. Signal. 2012, V.16, P.935-949
  9. Takahashi K., Yamanaka S. // Cell. 2006, V.126, P.663-676
  10. Lebedeva O.S., Lagarkova M.A., Kisilev S.L., Mukhina I.V., Vedunova M.V., Usova O.V., Stavrovskaya A.V., Yamschikova N.G., Fedotova E.Yu., Grivennikov I.A. // Neirokhimiya 2013, V.3, P.233-241
  11. Esposito E., Cuzzocrea S. // Curr. Med. Chem. 2010, V.17, P.2764-2774
  12. Lockshin R.A., Zakerib Z. // J. Cell Mol. Med. 2007, V.11, P.1214-1224
  13. Kim J., Yang Y., Song S.S., Na J.H., Oh K.J., Jeong C., Yu Y.G., Shin Y.K. // Biophys. J. 2014, V.107, P.1601-1608
  14. Berger A.K., Cortese G.P., Amodeo K.D., Weihofen A., Letai A., LaVoie M.J. // Human Molecular Genetics 2009, V.18, P.4317-4328
  15. Gama V., Swahari V., Schafer J., Kole A.J., Evans A., Huang Y., Cliffe A., Golitz B., Sciaky N., Pei X.H. // Sci. Signal. 2014. 2014, V.7(334), doi: 10.1126/scisignal, P.ra67
  16. Kemeny S., Dery D., Loboda Y., Rovner M., Lev T., Zuri D., Finberg J.P., Larisch S. // PLoS One. 2012, V.7, e38837
  17. Fei Q., McCormack A.L., Di Monte D.A., Ethell D.W. // J. Biol. Chem. 2008, V.283, P.3357-3364
  18. Charan R.A., Johnson B.N., Zaganelli S., Nardozzi J.D., LaVoie M.J. // Cell Death Dis. 2014. V. 5. P. e1313. doi: 10.1038/cddis.2014.278. 2014, V.5, doi: 10.1038/cddis.2014.278, P.e1313
  19. Yan J., Fu Q., Cheng L., Zhai M., Wu W., Huang L., Du G. // Mol. Med. Rep. 2014, V.10, P.2223-2233
  20. Allam R., Lawlor K.E., Yu E.C., Mildenhall A.L., Moujalled D.M., Lewis R.S., Ke F., Mason K.D., White M.J., Stacey K.J. // EMBO Rep. 2014, V.15, P.982-990

Дополнительные файлы

Доп. файлы
Действие
1. JATS XML
Скачать

© Коновалова Е.В., Лопачева О.М., Гривенников И.А., Лебедева О.С., Дашинимаев Э.Б., Хаспеков Л.Г., Федотова Е.Ю., Иллариошкин С.Н., 2015

Creative Commons License
Эта статья доступна по лицензии Creative Commons Attribution 4.0 International License.

Данный сайт использует cookie-файлы

Продолжая использовать наш сайт, вы даете согласие на обработку файлов cookie, которые обеспечивают правильную работу сайта.

О куки-файлах