В синхронной и асинхронной секреции медиатора принимают участие одни и те же синаптические везикулы

Полный текст

ВВЕДЕНИЕ Секреция медиатора в химическом синапсе осуществляется порциями (квантами) посредством слияния мембраны синаптической везикулы с пресинаптической мембраной. Процесс слияния может происходить в покое (спонтанная секреция), а также в ответ на пресинаптический потенциал действия и вход ионов Са2+ в нервное окончание через потенциал-зависимые Са-каналы (вызванная секреция). В вызванной секреции медиатора выделяют два компонента - синхронный, при котором высвобождение квантов медиатора осуществляется в течение нескольких миллисекунд после потенциала действия, и асинхронный, который продолжается десятки и сотни миллисекунд [1-3]. В большинстве синапсов основным компонентом является синхронная секреция медиатора, посредством которой при низкочастотном раздражении может освобождаться более 90% квантов [4, 5]. Однако при увеличении частоты раздражения отмечается рост доли асинхронной секреции медиатора [6]. Один из экспериментальных подходов к изменению соотношения синхронной и асинхронной секреции - использование растворов, содержащих ионы различных щелочноземельных металлов. Так увеличение доли асинхронной секреции происходит при замене ионов Са2+ на Sr2 и Ba2+ [2, 7, 8]. Считают, что синхронность освобождения квантов медиатора реализуется благодаря нескольким пресинаптическим механизмам, таким, как быстрое кратковременное открытие Са-каналов в ответ на деполяризацию мембраны, свойства белковой «машины» секреции, запускающей выделение квантов медиатора только при высокой внутриклеточной концентрации кальция, а также малое расстояние между Саканалом и Са-сенсором экзоцитоза [9]. Механизмы асинхронной секреции медиатора остаются недостаточно изученными. Предполагают, что Са2+-сенсор асинхронной секреции располагается на большем расстоянии от Са-канала и характеризуется другой динамикой связывания ионов Са2+ [10-13]. В то же время можно предположить, что везикулы, участвующие в синхронной и асинхронной секреции медиатора, различны и могут представлять самостоятельные популяции. Такое предположение не лишено оснований. Во-первых, изучение процессов экзои эндоцитоза синаптических везикул в двигательных нервных окончаниях позволило выделить два функционально различных пула (рециклирующий и резервный). Рециклирующий пул представлен докированными в области активных зон везикулами, он быстро истощается при высокочастотной активности и восполняется за счет мобилизации везикул и быстрого эндоцитоза. Резервный, более крупный, пул везикул участвует в восстановлении рециклирующего пула при высокочастотном раздражении, включается в процесс секреции позднее и восполняется посредством медленного эндоцитоза [14, 15]. Во-вторых, получены данные, позволяющие предположить существование обособленных популяций везикул, обеспечивающих спонтанную [16, 17] и асинхронную секрецию медиатора [18, 19], но не участвующих в вызванной, синхронной секреции. В настоящей работе с использованием электрофизиологического подхода и флуоресцентной конфокальной микроскопии делается попытка оценить идентичность пулов везикул, принимающих участие в синхронной и асинхронной секреции, в двигательном нервном окончании. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ Объект исследования, растворы Эксперименты проведены на изолированных нервно-мышечных препаратах кожно-грудинной мышцы травяных лягушек (Rana temporaria) в зимний (декабрь-февраль) период. Работа проведена в соответствии с международными правилами работ с использованием экспериментальных животных. Использовали стандартный раствор Рингера следующего состава (в мМ): 115.0 NaCl, 2.5 KCl, 1.8 CaCl2, 2.4 NaHCO3; рН поддерживали на уровне 7.2-7.4; температура 20°С. Все исследования проводили только на поверхностно расположенных синапсах. Наряду со стандартным раствором (Са-раствор) использовали растворы, в которых CaCl2 был заменен на SrCl2 или BaCl2 в концентрации 1.8 мМ (Sr-, Ba-растворы). Вызванную секрецию медиатора и экзоцитоза везикул инициировали длительным высокочастотным (20 имп/с) раздражением двигательного нерва прямоугольными электрическими импульсами длительностью 0.1-0.2 мс сверхпорогововой силы, подаваемыми с помощью стимулятора DS3 (Digitimer Ltd., Великобритания). Сокращения препарата блокировали поперечным рассечением мышечных волокон. Использовали реактивы фирмы Sigma (США). Электрофизиология Многоквантовые потенциалы концевой пластинки (ПКП) и одноквантовые асинхронные сигналы регистрировали с помощью стеклянных микроэлектродов с диаметром кончика менее 1 мкм и сопротивлением 2-10 МОм, заполненных 3 М раствором KCl. Микроэлектрод вводили в мышечное волокно в области нервных окончаний под визуальным контролем. Уровень мембранного потенциала покоя контролировали при помощи милливольтметра. Эксперименты, в которых происходило уменьшение мембранного потенциала покоя, не учитывались. Оцифровывание сигналов производили с помощью платы АЦП Ла-2USB. Для регистрации и анализа сигналов применяли оригинальную компьютерную программу Elph (разработчик А.В. Захаров). Количественная оценка синхронной секреции медиатора Для количественного расчета квантового состава ПКП использовали модифицированный метод вариаций, детально описанный нами ранее [20]. Для этого рассчитывали площадь каждого ПКП в серии. Далее на графике динамики снижения площади ПКП при высокочастотном раздражении находили участок, в котором средняя площадь ПКП практически не менялась (обычно 10-30 с раздражения). По колебаниям площади ПКП в этом участке можно рассчитать квантовую величину, т.е. среднюю величину площади ПКП, производимую одним квантом медиатора (q): q = σ2/, (1) где σ - дисперсия площади ПКП, - средняя площадь ПКП на данном участке. Далее можно определить квантовый состав каждого ПКП в серии: mi = Vi/q, (2) где mi - квантовый состав i-го ПКП, Vi - площадь i-го ПКП. Количественная оценка асинхронной секреции медиатора в Са- и Sr-растворах Асинхронную секрецию медиатора оценивали путем подсчета количества одноквантовых сигналов, возникающих после ПКП, в период между раздражениями (50 мс), рассчитывая их частоту (количество квантов в секунду). Одноквантовые сигналы подсчитывали как автоматически, так и при визуальном просмотре регистраций. Количественная оценка асинхронной секреции медиатора в Ba-растворах Раздражение в Ва-растворах вызывает квантовую секрецию большого количества медиатора, приводящую к развитию устойчивой деполяризации концевой пластинки, что подтверждено биохимическими методами [21]. Высокочастотное раздражение в Ва-растворах приводит к появлению огромного количества асинхронно возникающих одноквантовых сигналов, которые накладываются друг на друга и не поддаются подсчету [7, 22]. Поэтому секрецию медиатора (частота одноквантовых асинхронных потенциалов) оценивали по производимому асинхронными сигналами деполяризационному изменению мембранного потенциала с коррекцией на нелинейность их суммации с использованием формулы [22]: (3) где V - деполяризация постсинаптической мембраны, мВ, Е - мембранный потенциал покоя, мВ, a - средняя амплитуда асинхронных одноквантовых сигналов, мВ, τ - временная постоянная асинхронных одноквантовых сигналов, мс, ε - равновесный ацетилхолиновый потенциал (≈ -15 мВ). Флуоресцентная микроскопия Процессы экзо- и эндоцитоза синаптических везикул изучали с использованием флуоресцентного красителя FM 1-43 (SynaptoGreen С4, фирма Sigma, США) в концентрации 6 мкМ. Краситель обратимо связывается с пресинаптической мембраной и во время эндоцитоза (после стимуляции экзоцитоза) оказывается внутри образующихся синаптических везикул («загружается» в нервные окончания) [23]. Поскольку процессы эндоцитоза продолжаются и некоторое время после окончания экзоцитоза, в наших экспериментах краситель присутствовал в растворе как во время раздражения (20 имп/с), так и в течение 5 мин после его окончания. Далее препарат отмывали в растворе без красителя в течение 20 мин для устранения связанного с поверхностной мембраной красителя. В этом случае в нервном окончании наблюдались ярко светящиеся пятна, отражающие скопления синаптических везикул, содержащих краситель в области активных зон. Стимуляция экзоцитоза предварительно загруженных везикул вызывает освобождение («выгрузку») красителя из нервных окончаний [23]. Флуоресценцию наблюдали с помощью моторизованного микроскопа BX51W1 (Olympus, Германия), оснащенного конфокальным сканирующим диском DSU и CCD-камерой OrcaR2 (Hamamatsu, Япония), совмещенной с персональным компьютером через специализированный софт Olympus Cell^P. Оптика для анализа свечения FM 1-43 включала набор светофильтров Olympus U-MNB2 и водно-иммерсионный объектив Olympus LUMPLFL 60хw (1.0 NA). Свечение анализировали в центральном участке нервного окончания протяженностью 20 мкм. Интенсивность свечения оценивали, используя программу ImagePro, в относительных единицах (о.е.) свечения пикселя за вычетом фоновой флуоресценции. Фоновое значение флуоресценции определяли как среднюю интенсивность свечения в квадрате 50 × 50 пикселей в участке изображения без нервных окончаний [12, 24, 25]. Профиль свечения в нервной терминали рассчитывали как среднюю интенсивность свечения рядов пикселей, расположенных перпендикулярно продольной оси терминали с шагом в 1 пиксель. Статистический анализ проводили с использованием программы Origin Pro. Количественные результаты исследования представлены в форме среднее значение ± стандартная ошибка, n - число независимых опытов. Статистическую значимость определяли с помощью критерия Стьюдента и ANOVA. РЕЗУЛЬТАТЫ Секреция медиатора при высокочастотном раздражении в Ca-, Sr- и Ba-растворах При высокочастотном раздражении в Са-растворе регистрировались многоквантовые ПКП (синхронная секреция медиатора), сопровождавшиеся редкими одноквантовыми асинхронными сигналами (рис. 1А). Квантовый состав первого многоквантового ПКП в серии составлял 321 ± 120 квантов (n = 6). В процессе высокочастотного раздражения наблюдалось снижение квантового состава, который к концу 3-й минуты раздражения составлял 44.3 ± 9.0% (n = 6) от исходного уровня (рис. 1Б). Асинхронная секреция в течение первой секунды высокочастотного раздражения была незначительной (5.9 ± 1.4 кванта с-1, n = 7), но к концу 3-й минуты раздражения возрастала до 40.0 ± 9.7 с-1 (n = 7) (рис. 1Б). После окончания раздражения одноквантовые асинхронные сигналы исчезали в течение 1 с. Произведенные расчеты показали, что за 3 мин раздражения в Са-растворе посредством синхронной секреции высвобождается 880251 ± 275892 квантов (n = 6), а асинхронной - 6751 ± 1476 квантов (n = 7). В Sr-растворе при высокочастотном раздражении также регистрировались многоквантовые ПКП, за которыми следовали одноквантовые асинхронные сигналы (рис. 1А). Исходный квантовый состав оказался значительно ниже, чем в Ca-растворе - 4.7 ± 0.8 кванта (n = 4). К окончанию первой минуты раздражения квантовый состав ПКП возрастал до 34.3 ± 9.1 (n = 4) и поддерживался на относительно стабильном уровне до окончания стимуляции (рис. 1Б). В Sr-растворе асинхронная секреция оказалась более значимой, чем в Ca-растворе. В первую секунду раздражения частота одноквантовых сигналов составляла 32.6 ± 5.8, а к концу 3-й минуты - 185.2 ± 10.7 квантов/с (n = 5) (рис. 1Б). После окончания раздражения одноквантовые асинхронные сигналы исчезали в течение 1 с. Оказалось, что за 3 мин раздражения в Sr-растворе количество выделенных синхронной и асинхронной секрецией квантов медиатора составляет 126359 ± 29687 (n = 4) и 31633 ± 1912 (n = 5) соответственно. Возникающая в Са- и Sr-растворах асинхронная секреция медиатора не приводила к изменению мембранного потенциала покоя. Высокочастотное раздражение двигательного нерва в Ва-растворе вызывало появление одно-трехквантовых ПКП и огромного количества асинхронных одноквантовых сигналов. Квантовый состав ПКП быстро возрастал к 2-3 с и последовательно снижался к окончанию раздражения до 1.85 ± 0.47 (n = 7) (рис. 1Б). Продолжительное раздражение в течение первых нескольких секунд приводило к деполяризации мышечных волокон с уровня покоя -45 ± 2.9 мВ до -37 ± 3.1 мВ (n = 7), сохранявшейся все время раздражения. После окончания раздражения мембранный потенциал в течение 3-7 с возвращался к исходному уровню. Расчет по формуле 3 (см. раздел «Экспериментальная часть») позволил заключить, что такая деполяризация может вызываться асинхронными одноквантовыми сигналами с частотой 6131 ± 455 с-1 (n = 7). Дальнейшие расчеты показали, что 30-секундное раздражение в Ва-растворе приводит к освобождению синхронной секрецией 1224 ± 180 квантов (n = 7), а асинхронной - 189648 ± 41712 квантов (n = 7). Представленные данные свидетельствуют о том, что при высокочастотном раздражении в Caрастворах практически все кванты медиатора освобождаются синхронно (примерно 99.2%), а доля асинхронной секреции незначительна. Применение Sr-растворов приводит к уменьшению доли синхронно освобождающихся квантов до 80% и увеличению асинхронно освобождающихся до 20%. В Ва-растворах обнаружено практически только асинхронное выделение квантов (примерно 99.4%). В дальнейшем для изучения процессов экзо- и эндоцитоза синаптических везикул при синхронной и асинхронной секреции медиатора мы применяли Са- и Ва-растворы. Экзо- и эндоцитоз синаптических везикул при синхронной и асинхронной секреции медиатора Эффективность эндоцитоза синаптических везикул оценивали по загрузке красителя FM 1-43 при длительном высокочастотном раздражении в Са- и Baрастворах. Известно, что эффективность захвата красителя FM 1-43 определяется интенсивностью процессов экзоцитоза синаптических везикул и секреции медиатора. Поэтому для загрузки красителя в Са- и Ba-растворах необходимо, чтобы за время раздражения освобождалось одинаковое количество квантов медиатора. Анализ кумулятивных кривых (сумма квантов, освободившихся синхронно и асинхронно, рис. 2А) показал, что 180000 квантов медиатора в Са- и Ba-растворах освобождаются примерно за 30 с раздражения. Именно такую продолжительность раздражения использовали для загрузки красителя в наших опытах. В этих условиях в Ca- и Ва-растворах наблюдались ярко светящиеся пятна (интенсивность свечения нервных терминалей - 0.114 ± 0.008 (n = 23) и 0.119 ± 0.011 о.е. (n = 20) соответственно) (рис. 2Б, 3В). Полученные данные свидетельствуют о том, что как при синхронном, так и асинхронном экзоцитозе везикул идут эффективные процессы рециклизации с образованием новых синаптических везикул посредством эндоцитоза. Следующие эксперименты были направлены на оценку способности везикул, участвующих в асинхронной секреции медиатора, подвергаться синхронному экзоцитозу. Для этого нервные окончания предварительно загружали FM 1-43 в Ba- или Сa-растворе (стимуляции асинхронного или синхронного экзоцитоза соответственно), а затем сравнивали динамику выгрузки красителя при высокочастотном раздражении в Сарастворе (стимуляция синхронного экзоцитоза). Показано (рис. 3Б), что в этих условиях динамика выгрузки красителя была одинаковой. Через 1 мин раздражения предварительно загруженных нервных окончаний в Ва- и Са-растворах интенсивность свечения снижалась до 80.1 ± 1.2 (n = 7) и 76.0 ± 1.2% (n = 7) соответственно, а через 15 мин - до 55.9 ± 2.2 (n = 7) и 55.3 ± 5.4% (n = 7) соответственно, а флуоресцирующие пятна исчезали (рис. 2В). Таким образом, синаптические везикулы, участвовавшие в асинхронном экзоцитозе и секреции медиатора, были способны подвергаться синхронному экзоцитозу. В нескольких экспериментах проводили детальный анализ светящихся пятен в нервных окончаниях одного и того же препарата, возникающих при стимуляции синхронной и асинхронной секреции. Для этого сначала анализировали пятна, возникающие при загрузке красителя в Ca-растворе. Затем краситель выгружали (раздражение в течение 15 мин) и нервные окончания повторно загружали красителем в Ва-растворе с анализом пятен. Пространственный анализ светящихся пятен одного и того же нервного окончания в Ca- и Ва-растворах выявил их идентичность (рис. 2Б). Полученные данные свидетельствуют о том, что как при синхронном, так и асинхронном экзоцитозе везикул процессы рециклизации происходят в одних и тех же участках нервного окончания, прилегающих к активным зонам. Оценка участия везикул рециклирующего и резервного пула в асинхронной секреции медиатора В данной части работы производили изолированную загрузку везикул либо рециклирующего, либо резервного пулов красителем FM 1-43 в Ca-растворе с последующей оценкой способности их участия в асинхронной секреции медиатора. Для загрузки везикул рециклирующего пула использовали кратковременное (12 с) высокочастотное (20 имп/с) раздражение [26]. При этом в нервном окончании появлялись слабосветящиеся пятна, отражающие скопления везикул рециклирующего пула в области активных зон. В последующем анализировали динамику выгрузки красителя при стимуляции синхронной (Ca-раствор) и асинхронной (Ba-раствор) секреции медиатора. Различий в динамике снижения свечения не выявлено. Так, через 1 мин стимуляции в Ca- и Ba-растворах интенсивность свечения нервных терминалей падала до 74.2 ± 4.3 (n = 4) и 72.2 ± 3.4% (n = 5) соответственно, а через 5 мин - до 60.8 ± 4.3 (n = 4) и 61.4 ± 4.3% (n = 5) соответственно (рис. 4Б,В). Для загрузки резервного пула использовали модификацию протокола [26]. Первоначально проводили высокочастотное раздражение препарата в Ca-растворе с FM 1-43 продолжительностью 3 мин. Данный протокол приводит к окрашиванию везикул рециклирующего и резервного пулов. После отмывки препарата снова производили высокочастотное раздражение, но в течение 25 с, что приводило к выбросу красителя везикулами рециклирующего пула. В результате оставшиеся в нервном окончании окрашенные синаптические везикулы принадлежали преимущественно резервному пулу [26]. Последующее высокочастотное раздражение окрашенных препаратов в Са-растворе (стимуляция синхронной секреции медиатора) и Ba-растворе (стимуляция асинхронной секреции медиатора) приводило к идентичному падению свечения нервных окончаний (рис. 4Д). Через 1 мин стимуляции в Ca- и Baрастворах интенсивность свечения нервных терминалей снижалась до 83.1 ± 2.2 (n = 7) и 76.9 ± 4.1% (n = 6) соответственно, а через 15 мин - до 44.3 ± 2.9 (n = 7) и 42.3 ± 2.7% (n = 6) соответственно (рис. 4Д,Е). Представленные данные свидетельствуют о том, что везикулы как рециклирующего, так и резервного пулов способны наряду с синхронной секрецией участвовать и в асинхронной секреции медиатора. ОБСУЖДЕНИЕ Недавно появились экспериментальные данные, указывающие на различия в механизмах синхронной и асинхронной секреции медиатора. Предположили, что запуск обоих видов вызванной секреции медиатора может осуществляться в области различных пресинаптических Са-каналов [9, 19, 27] с использованием различных белковых молекул, обеспечивающих процессы докирования и слияния синаптических везикул. Наиболее вероятными кандидатами на роль Са-сенсора синхронной секреции являются Са-связывающие белки синаптотагмины 1, 2, 9, а асинхронной секреции - синаптотагмин 7 и Doc2 [9]. В процессах регуляции синхронной секреции принимают участие белки комплексины и синаптобревин 2, а асинхронной - VAMP4 и синапсин 2 [28-30]. Эти данные поднимают вопрос об идентичности пулов везикул, принимающих участие в синхронной и асинхронной секреции. Полученные нами данные свидетельствуют о том, что одни и те же синаптические везикулы способны участвовать как в синхронной, так и в асинхронной секреции медиатора с одинаковыми процессами рециклизации. На это указывает способность везикул, прошедших цикл экзоцитоз-эндоцитоз, при синхронной секреции медиатора (Са-растворы) вовлекаться в асинхронный экзоцитоз в Ва-растворах (рис. 4). И наоборот, везикулы, которые первоначально участвовали в асинхронной секреции (Варастворы), способны в последующем участвовать в синхронной секреции (Са-растворы) (рис. 3Б,В). Эффективный захват красителя при стимуляции секреции в Ва-растворах (рис. 2Б, 3Б) свидетельствует о том, что асинхронный выброс медиатора, так же как и синхронный, осуществляется посредством полного экзоцитоза везикул с последующим образованием новых везикул за счет эндоцитоза. Синхронный и асинхронный экзоцитоз происходит в одних и тех же участках нервного окончания в области активных зон, о чем свидетельствует полная идентичность расположения и конфигурации светящихся пятен при стимуляции секреции в Са- и Варастворах (рис. 2Б). Способность везикул, относящихся к различным функциональным пулам нервного окончания, участвовать в асинхронной секреции медиатора была проверена в опытах с изолированной загрузкой красителем везикул рециклирующего и резервного пулов. Показано, что динамика выгрузки красителя из везикул как рециклирующего, так и резервного пулов при синхронной и асинхронной секреции медиатора абсолютно идентична, а интенсивность свечения снижалась до одинакового уровня (рис. 4Б,Д). Следовательно, оба пула везикул в одинаковой степени принимают участие как в синхронной, так и в асинхронной секреции медиатора. Наши исследования не подтвердили предположение некоторых авторов, что в нервном окончании может существовать обособленная популяция везикул, обеспечивающая асинхронную секрецию медиатора [18, 19], но не участвующая в вызванной, синхронной секреции. ЗАКЛЮЧЕНИЕ Таким образом, полученные нами данные позволяют считать, что источником для обоих видов вызванной секреции медиатора в нервно-мышечном синапсе служат одни и те же синаптические везикулы. Можно предполагать, что синаптическая везикула содержит набор белков, необходимый как для синхронной, так и для асинхронной секреции, а выбор вида вызванной секреции, в котором будет принимать участие синаптическая везикула, определяется динамикой ионов Са2+ около везикулы, а также расположением везикулы по отношению к кальциевому каналу и свойствами Са-сенсоров экзоцитоза.

Об авторах

П. Н. Григорьев

Email: zefiroval@rambler.ru
Россия

A. Л. Зефиров

Автор, ответственный за переписку.
Email: zefiroval@rambler.ru
Россия

Список литературы

Дополнительные файлы