Использование терминаторов транскрипции для создания трансгенных линий клеток яичников китайского хомячка (СНО) со стабильным и высоким уровнем экспрессии репортерного гена

Полный текст

ВВЕДЕНИЕ В настоящее время все большее число лекарственных препаратов получают в биореакторах, основанных на культурах клеток, и, прежде всего, клеток яичников китайского хомячка (СНО) [1, 2]. Однако основную проблему при производстве рекомбинантных белков в культурах клеток представляет крайне высокая себестоимость продукта. Один из способов оптимизации производства - усовершенствование векторов для получения трансгенов, что позволяет значительно снизить затраты в процессе получения и поддержания эффективных клеточных линий-продуцентов. В биотехнологии наибольшее распространение для получения клеточных линий-продуцентов целевых белков получил метод трансфекции линеаризованной плазмидной ДНК [3, 4]. С помощью этого метода можно получить клеточные линии, которые содержат много копий экспрессионного вектора, обычно встроенных в одно, реже - в несколько геномных сайтов. Для экспрессии трансгена обычно применяют вирусные промоторы - цитомегаловирусный (CMV) и ранний промотор вируса SV40, а также сильные клеточные промоторы генов «домашнего хозяйства» [5]. С целью повышения эффективности трансфекции и стабильности экспрессии трансгена с начала 1990-х годов широко используют последовательности ДНК, обычно А/Т-богатые, которые, как показано в экспериментах in vitro, взаимодействуют с фракцией ядерного матрикса (MAR, matrix attachment region) [6-8]. Существующая модель предполагает, что МАR-элементы, взаимодействуя с белками ядерного скелета, снижают зависимость уровня экспрессии генов, фланкированных MAR, от негативного эффекта окружающего хроматина. Кроме этого, для защиты транскрипции трансгена от репрессии и негативного эффекта окружающего генома широко используют известные инсуляторы [9-11]. В биотехнологии наиболее часто применяют инсулятор HS4 (1.2 т.п.н.), найденный на границе β-глобинового домена в геноме курицы. Обычно в конструкцию перед целевым геном встраивают две копии инсулятора HS4. В некоторых случаях используют комбинации известных MAR и HS4-инсулятора либо мультимеризуют его коровую часть (500 п.н.) [9]. Такие элементы увеличивают как эффективность получения трансгенов, так и уровень экспрессии самого трансгена. Однако далеко не во всех культурах клеток и организмах HS4-инсулятор работает эффективно. В биотехнологии также используют протяженные участки ДНК, включающие промоторы генов «домашнего хозяйства» (UCOE) [12, 13], и регуляторные элементы, обладающие способностью блокировать распространение зон гетерохроматина [12, 14]. В целом, можно констатировать, что пока не найдены универсальные регуляторные элементы с понятным механизмом действия, которые можно эффективно использовать в составе векторных конструкций всех типов, предназначенных для получения высокопродуктивных клеточных линийпродуцентов различных белков. Очевидно, что механизмы супрессии «чрезмерной» транскрипции должны существовать даже у самых сильных промоторов. Один из таких механизмов ограничения транскрипции - РНК-интерференция [15, 16]. Часто эффекты репрессии при встройке трансгена связаны с транскрипцией, проходящей через трансген. Например, транскрипция через энхансер приводит к инактивации его активности [17]. Длинные некодирующие РНК могут также рекрутировать на регуляторные элементы репрессионные комплексы [18]. На основе фактов, указывающих на негативную роль транскрипции, идущей через регуляторные элементы, в экспрессии трансгена, можно предположить, что прерывание транскрипции на границах трансгена должно позитивно влиять на процесс стабилизации экспрессии трансгена. В то же время только часть исследованных инсуляторов эффективно терминирует транскрипцию [19]. В данной работе с целью тестирования роли прерывания транскрипции в защите экспрессии трансгена использовали последовательности хорошо изученных терминаторов транскрипции из β- (βt) и Gγ- (γt) глобиновых генов [20, 21]. В качестве контроля использовали две копии наиболее хорошо описанного инсулятора HS4 (2×Ins) из β-глобинового локуса кур [22]. Показано, что терминаторы транскрипции способны значительно увеличивать стабильность экспрессии репортерного гена в клеточных пулах. При выведении отдельных стабильных клеточных линий конструкции с терминаторами характеризовались более высоким уровнем наработки продукта трансляции репортерного гена. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ Создание конструкций Для получения серии конструкций в вектор pEGFPN1 по сайту рестрикции PciI, расположенному перед геном EGFP выше цитомегаловирусного промотора на расстоянии 640 п.н. от точки старта транскрипции, встраивали различные последовательности: две тандемные копии коровой части инсулятора HS4 из β-глобинового локуса курицы (2×Ins) длиной 476 п.н., терминатор транскрипции SV40 (SV40pA) длиной 868 п.н., терминатор транскрипции из β-глобинового локуса человека (βt) длиной 1130 п.н., комбинированный элемент, состоящий из βt и 2×Ins. Для получения конструкции βt_EGFP_γt в конструкцию βt_EGFP по сайту рестрикции AflII был встроен терминатор из Gγ-глобинового гена человека (γt) длиной 1336 п.н. Получение трансфицированных клеточных линий Экспрессию репортерного гена анализировали на культуре клеток яичников китайского хомячка (CHO-K1), наиболее широко применяемой в биотехнологической практике для наработки целевых белков. Клетки CHO-K1 культивировали на среде DMEM, содержащей 10% инактивированной эмбриональной телячьей сыворотки, 2 мМ L-глутамина, 35 мг/л L-пролина, а также коммерческий антибиотик Mycokill-AB (PAA Laboratories) в рабочей концентрации. Клетки пересевали 1 раз в 5 дней при концентрации 105 клеток/см2 с разведением 1 : 20. Клетки культивировали при температуре 370C в атмосфере 5% CO2 и высокой влажности. Культуру клеток трансфицировали рекомбинантными плазмидами. С целью более эффективной интеграции трансгенной конструкции плазмиды линеаризовали рестриктазой ApaLI. Трансфекцию проводили согласно следующему протоколу. Клетки, достигшие 70-80% от монослоя (8 × 104 клеток/см2), промывали культуральной средой, не содержащей сыворотки. Подготавливали смесь для трансфекции: 3-4 мкг линеаризованной плазмидной ДНК смешивали с 375 мкл культуральной среды, не содержащей сыворотки. В отдельной пробирке с таким же количеством аналогичной среды смешивали коммерческий трансфицирующий реагент Lipofectamine 2000, количество которого рассчитывали исходя из соотношения 3 мкл реактива на 1 мкг плазмидной ДНК. После этого растворы объединяли и инкубировали при комнатной температуре в течение 30-40 мин. Трансфекционную смесь наслаивали на промытые клетки. Через 4-6 ч после начала трансфекции трансфекционную смесь заменяли на культуральную среду DMEM с сывороткой. Анализ уровня экспрессии репортерного гена оценивали по интенсивности флуоресценции на вторые сутки после трансфекции (36-48 ч) при помощи проточной цитофлуориметрии на приборе MACSQuant Analyzer VYB (Miltenyi Biotec). В качестве отрицательного контроля использовали нетрансфицированные клетки линии CHO-K1. Цитофлуориметрический анализ Для проведения цитофлуориметрического анализа клетки промывали фосфатно-солевым буфером, обрабатывали трипсином и снимали с чашек Петри. Затем дважды отмывали от трипсина и тщательно ресуспендировали в фосфатно-солевом буфере. Полученную суспензию (106 клеток в 1 мл буфера) переносили в 5 мл круглодонные пробирки. Напряжение каналов проточного цитофлуориметра подбирали таким образом, чтобы не учитывать аутофлуоресценцию нетрансфицированных клеток. После проведения калибровки все образцы измеряли при постоянных значениях напряжений. Так, если в клетках детектировалась флуоресценция EGFP, на логарифмической шкале по соответствующему каналу фиксировалось появление клеток в области, превышающей значение «10», и все количественные значения уровня экспрессии гена измеряли именно в этой области. Поддержание пулов трансфицированных клеток После проведения трансфекции пулы клеток культивировали согласно приведенному выше протоколу. Клетки, не содержащие трансген, удаляли путем селекции пулов трансфицированных клеток при помощи коммерческого антибиотика генетицина (Geneticin, Invitrogen), вводимого в концентрации 800 мкг/мл. Поскольку в результате подавления транскрипционной активности трансгена выработка продукта гена устойчивости к антибиотику с течением времени снижается, после культивирования клеток в течение 77 сут концентрация антибиотика была постепенно снижена до 200 мкг/мл. Получение индивидуальных клонов Пулы культивируемых клеток снимали с планшетов и разводили в 10 мл культуральной среды. После этого подсчитывали концентрацию клеток при помощи автоматического счетчика Scepter (Millipore) и разводили их таким образом, чтобы в 1 мл среды содержалось 2-3 клетки. Полученную суспензию переносили в 24-луночные планшеты (1 мл на лунку). После 2 недель культивирования на среде DMEM, содержащей антибиотик Geneticin в концентрации 800 мкг/мкл, проводили цитофлуориметрический анализ выживших клонов. Дальнейшее поддержание полученных линий и определение уровня экспрессии EGFP осуществляли согласно методике для пулов трансфицированных клеток. Интенсивность флуоресценции EGFP измеряли через каждые 15 сут. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ При изучении потенциальной роли терминаторов транскрипции в стабилизации уровня экспрессии трансгена в СНО-клетках в качестве репортерного использовали ген усиленного зеленого флуоресцентного белка (EGFP) под контролем СMV-промотора. Все опытные конструкции сравнивали с контролем, плазмидой pEGFPN1 (Clontech), содержащей в своем составе ген EGFP под контролем CMV-промотора (CMVpr) и терминатора транскрипции вируса SV40 (SV40pA) (конструкция EGFP на рис. 1). Помимо репортерного гена, данная плазмида содержит ген устойчивости к антибиотику неомицину (NeoR) под контролем промотора SV40 (SV40pr) и терминатора транскрипции гена тимидинкиназы вируса простого герпеса (HSVpA). В данном случае ген неомицинустойчивости необходим для селекции трансфицированных клеток. С целью оценки влияния процесса прерывания транскрипции, инициируемой перед встроенным трансгеном, на экспрессию репортерного гена использовали хорошо изученные терминаторы транскрипции гена β-глобина (βt) и SV40pA. В конструкциях (SV40_EGFP и βt_EGFP) эти терминаторы были встроены в прямой ориентации непосредственно выше CMV-промотора (рис. 1). Для полной изоляции репортерного гена от транскрипции, инициируемой в окружающем хроматине, создана производная конструкции βt_EGFP (рис. 1), в которой в дополнение к β-глобиновому терминатору с 3’-стороны репортерного гена EGFP был встроен в обратной ориентации терминатор транскрипции из гена Gγ-глобина (βt_EGFP_ γt). В такой конструкции репортерный ген защищен с обеих сторон от транскрипции, инициируемой из окружающего хроматина. Для сравнения эффективности терминаторов транскрипции с известными на данный момент регуляторными элементами, стабилизирующими экспрессию трансгена в CHO-клетках, использовали элемент, состоящий их двух копий коровой части инсулятора HS4, встроенного непосредственно перед СMV-промотором (2×Ins_EGFP, рис. 1). Наконец, для изучения кооперативного эффекта разных по функциям регуляторных элементов, инсулятора и терминатора транскрипции, была создана конструкция βt_2×Ins_EGFP, в которой перед двумя копиями инсулятора встроен β-глобиновый терминатор (рис. 1). Уровень экспрессии репортерного гена при трансфекции разных вариантов конструкции определяли на культуре клеток яичников китайского хомячка (CHO-K1), наиболее широко применяемой в биотехнологической практике для наработки целевых белков. При этом трансфекцию проводили традиционным методом с помощью липосом. Для определения степени подавления трансгена в пулах клеток, трансфицированных контрольными (pEGFP_N1 и 2×Ins_EGFP) и экспериментальными (SV40_EGFP, βt_pEGFP, βt_2×Ins_EGFP, βt_EGFP_γt) конструкциями, каждые 15 сут при помощи проточной цитофлуориметрии оценивали уровень экспрессии репортерного гена (рис. 2). Средний уровень экспрессии гена EGFP в пуле клеток в определенный момент времени определяли по процентному содержанию клеток, значение интенсивности флуоресценции которых было больше «10» по логарифмической шкале, т.е. клеток, нарабатывающих значимое количество данного белка. При этом в данном эксперименте показателем эффективности того или иного регуляторного элемента для достижения высокого и стабильного уровня наработки белка служило отношение процентного содержания клеток, экспрессирующих EGFP, в пуле клеток, несущих конструкцию с данным элементом, к процентному содержанию экспрессирующих EGFP клеток с контрольной плазмидой (EGFP). Результаты определения уровня экспрессии EGFP на протяжении 150 сут культивирования суммарной популяции трансфицированных клеток (что соответствует примерно 30 пассажам) свидетельствуют о том, что использование терминатора транскрипции перед промотором целевого гена значительно повышает эффективность наработки белка в ходе длительного культивирования: более чем в 3 раза - с терминатором SV40, в 5 раз - с терминатором βt в конце периода испытаний (рис. 2). Аналогичный эффект оказывал и регуляторный элемент, состоящий из двух копий инсуляторов. Несколько более значительное увеличение уровня экспрессии EGFP наблюдалось в пуле клеток, трансфицированных плазмидой βt_EGFP_γt, в которой репортерный ген окружен терминаторами транскрипции (рис. 2). Таким образом, защита репортерного гена (с двух сторон) от транскрипции, инициируемой вне трансгена, повышает стабильность и эффективность экспрессии. Наконец, самые лучшие результаты (12-кратное увеличение) получены при комбинации терминатора транскрипции и двух копий инсулятора в плазмиде βt_2×Ins_EGFP (рис. 2). Можно сделать вывод, что два регуляторных элемента с разным механизмом действия аддитивно влияют на стабильность и эффективность экспрессии репортерного гена. На практике рекомбинантные белки нарабатывают, отбирая стабильные клеточные линии, полученные из одной трансфицированной клетки и, следовательно, имеющие однородный генотип, что позволяет исключить влияние различных негативных факторов и выделить самый эффективный клон с оптимальным местом интеграции конструкции в геноме. Из суммарных клеточных популяций методом лимитирующих разведений после 30 сут культивирования были получены индивидуальные клеточные клоны. Основным количественным показателем экспрессионной активности репортерного гена в данном случае служила медиана распределения клеток по интенсивности флуоресценции. Исходно получили 10 индивидуальных клонов с конструкцией EGFP, 17 - с конструкцией 2×Ins_EGFP, 10 - с конструкцией SV40_EGFP и 10 - с конструкцией βt_EGFP. Из них достаточно высокий уровень экспрессии EGFP имели два клона с конструкцией EGFP, пять клонов - 2×Ins_EGFP, пять - SV40_EGFP и шесть - βt_EGFP. Необходимо отметить, что клоны с контрольной конструкцией исходно экспрессировали белок EGFP значительно слабее, чем клоны с конструкциями 2×Ins_EGFP, SV40_EGFP, βt_EGFP (см. таблицу). После культивирования в течение 2.5 месяцев уровень экспрессии EGFP в стабильных клеточных клонах с конструкциями EGFP и 2×Ins_EGFP снизился приблизительно в 10 раз. При этом экспрессионная активность клонов, содержащих конструкции SV40_pEGFP и βt_рEGFP, составила в среднем около 75% от исходной. Результаты измерения стабильных клеточных пулов показали, что наиболее эффективные клетки, характеризующиеся стабильной экспрессией репортерного гена, отбираются приблизительно после 90 сут культивирования. Поэтому с целью более детального изучения клонов, полученных из стабилизированной популяции клеток, провели еще одну процедуру выведения индивидуальных клеточных клонов из суммарных популяций методом лимитирующих разведений после 90 сут культивирования стабильных пулов. Как и в предыдущем эксперименте, основным количественным показателем экспрессионной активности репортерного гена служила медиана распределения клеток по интенсивности флуоресценции. Исходно получено по 12 индивидуальных клонов с конструкциями EGFP, 2×Ins_EGFP, βt_EGFP, βt_2×Ins_EGFP, βt_EGFP_γt. К концу эксперимента (300 суток культивирования клеточного клона) часть клонов погибла, поэтому представлены данные для пяти клонов с конструкцией EGFP, 12 - с конструкцией 2×Ins_EGFP, 9 - с βt_EGFP, 9 - с βt_2×Ins_EGFP, пять - с βt_EGFP_γt (рис. 3). Результаты измерений показывают, что полученные клоны EGFP имеют стабильный, но крайне низкий уровень флуоресценции (значения в среднем колеблются около 10). Чуть выше значения у клонов 2×Ins_EGFP, среди которых только один клон имеет низкую активность, в то время как остальные попадают в район от 10 до 100. Клоны βt_EGFP характеризуются еще более высокими средними значениями по сравнению с 2×Ins_EGFP. Кроме этого, один из клонов βt_EGFP показал сверхвысокие уровни флуоресценции (попал в район от 100 до 1000). Клоны βt_2×Ins_EGFP неожиданно разделились на две группы: одна (два клона) имела низкие значения флуоресценции, сравнимые со значениями клонов с конструкцией EGFP, тогда как у второй группы значения оказались гораздо более высокими (около 100), в среднем большими, чем у клонов 2×Ins_EGFP и βt_EGFP. Возможно, полученные различия в результатах связаны с использованием более сложной комбинации регуляторных элементов, нестабильной в определенных участках генома. Сходным образом проявилась активность и у клонов βt_EGFP_γt, среди которых один клон имел крайне низкий уровень флуоресценции, при этом остальные оказались в области высокой флуоресценции (в районе 100). По результатам данной серии опытов можно сделать вывод о высокой эффективности терминаторов транскрипции в процессе установления и поддержания выcокого уровня синтеза целевого белка. При этом комбинированный элемент (терминатор, соединенный с инсулятором) и вариант с репортерным геном, окруженным терминаторами, характеризуются более высокими показателями эффективности синтеза целевого белка. Однако эти конструкции требуют более внимательного отбора клонов, так как некоторые клоны оказались по неизвестным причинам неэффективными. ЗАКЛЮЧЕНИЕ В представленной работе показано, что терминаторы транскрипции, которые потенциально могут изолировать трансген от транскрипционных сигналов, обладают способностью поддерживать уровень транскрипции трансгена на стабильно высоком уровне на протяжении достаточно длительного периода культивирования клеточных линий CHO-K1. Установлено также, что терминатор более эффективно по сравнению с инсулятором поддерживает стабильный уровень экспрессии трансгена в клонах. Более того комбинация терминатора транскрипции и инсулятора обладает аддитивным эффектом, усиливающим и стабилизирующим экспрессию трансгена.

Об авторах

Н. Б. Гасанов

Email: mog@genebiology.ru
Россия

С. В. Тощаков

Email: mog@genebiology.ru
Россия

П. Г. Георгиев

Email: mog@genebiology.ru
Россия

O. Г. Максименко

Автор, ответственный за переписку.
Email: mog@genebiology.ru
Россия

Список литературы

Дополнительные файлы