Внеклеточные нуклеиновые кислоты мочи: источники, состав, использование в диагностике

Полный текст

ИСТОЧНИКИ ВНЕКЛЕТОЧНЫХ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ МОЧИ (РИСУНОК) Внеклеточные нуклеиновые кислоты (НК) могут появляться в моче в результате транспорта внНК крови через почки и непосредственно из клеток, контактирующих с этой биологической жидкостью. Механизмы генерации и общие свойства внеклеточных или циркулирующих НК крови суммированы в обзорах [1, 2]. Считается, что основной источник внНК - апоптоз клеток. В крови НК циркулируют в составе комплексов с биополимерами и могут быть упакованы в мембранные структуры [1, 3]. Циркулирующая ДНК сильно фрагментирована, а размер фрагментов пропорционален нуклеосоме [1]. В крови обнаруживаются как мРНК, рибосомная РНК, так и некодирующие РНК, микроРНК, которые могут циркулировать как в составе нуклеопротеиновых комплексов, так и в составе покрытых мембранами микрочастиц, в том числе экзосом [4-6]. Транспорт нуклеиновых кислот из крови в первичную мочу подразумевает транспорт компонентов из приносящей артерии в полость почечного тельца. Отвечающая за этот процесс клубочковая фильтрация веществ из плазмы крови ограничена проницаемостью базальной мембраны и щелевых мембран между «ножками» подоцитов. Так, в просвет нефрона могут проходить комплексы диаметром не более 6.4 нм [7] и молекулярной массой не более 70 кДа [8], что соответствует ДНК размером около 100 п.н. Размер пор гломерулярного барьера равен примерно 30 Å, хотя обнаружены и шунтоподобные поры радиусом 110-115 Å, однако их количество очень мало [9]. Важную роль в прохождении веществ через юкстагломерулярный аппарат играют отрицательно заряженные молекулы: полианионы, входящие в состав базальной мембраны, и сиалогликопротеины в выстилке, лежащей на поверхности подоцитов и между их «ножками» [7]. Как известно, ДНК [10-12] и РНК [13-15] в крови находятся преимущественно в составе надмолекулярных комплексов, таких, как нуклеосомы [1], комплексы РНК с липопротеинами крови [16, 17], или более крупных, защищенных мембраной микрочастиц и экзосом [4] или апоптотических телец. Однако размер мононуклеосомы превышает просвет даже самых больших пор почечного барьера и, поэтому, в своей классической конфигурации мононуклеосомы пройти сквозь барьер не могут. На транспорт молекул нуклеиновых кислот из крови может влиять и общее состояние здоровья пациента. Еще в 1967 году обнаружили увеличение количества ДНК в моче больных острым панкреатитом [18], а в 2012 году показали, что моча курящих людей содержит больше ДНК, чем моча некурящих (9.46 и 9.04 нг/мкл - у женщин соответственно; 4.96 и 2.93 нг/мкл - у мужчин соответственно) [19]. Эксперименты, проведенные на мышах, показали, что действительно часть ДНК гибнущих клеток, введенных внутрибрюшинно, избегает внутриклеточной деградации и фагоцитоза и циркулирует в крови в форме полимеров, а также частично выводится с мочой в виде кислотонерастворимой формы [20]. Изучение продуктов деградации меченной [32Р] ДНК фага λ, введенной в брюшную полость мыши, показало, что большая часть этих продуктов используется клетками повторно или гидролизуется до кислоторастворимых фрагментов, только ~3.2% выводится с мочой в течение 3 дней. Небольшая часть введенной ДНК (0.06%) появляется в кислотонерастворимой фракции нуклеиновых кислот мочи (длиной ≥15-20 п.н.). Необходимо обратить внимание и на тот факт, что выведение «незащищенных», очищенных от примесей ДНК/РНК и ДНК/РНК из умирающих клеток может быть различным. Некротическая и тем более апоптотическая ДНК связана с белками и защищена от нуклеаз несравненно лучше, чем чистая ДНК, используемая в модельной системе. При этом ДНК/РНК-связывающие белки могут оказывать как положительное, так и отрицательное влияние на транспорт ДНК/РНК через почечный барьер. В пользу этих предположений может свидетельствовать и то, что в моче мышей, в брюшную полость которых ввели клетки лимфомы человека Raji, апоптоз в которых был индуцирован γ-излучением, обнаружены человеческие Alu-последовательности, отсутствующие в моче контрольных животных (не получавших инъекции клеток Raji) [20]. Другое доказательство транспорта циркулирующей ДНК крови в мочу - специфические ДНК Y-хромосомы, обнаруженные в моче женщин, которым перелили кровь доноров-мужчин [20]. Кроме того, в моче женщин, вынашивающих плод мужского пола, также обнаружены специфические ДНК Y-хромосомы [20, 21]. При этом показано, что эмбриональная ДНК в моче матери значительно короче, чем в плазме ее крови [21]. Еще одно подтверждение транспорта полимерной ДНК из крови в мочу получено при анализе внДНК онкологических больных. Известно, что в 80-90% опухолей поджелудочной железы и кишечника обнаруживаются мутантные формы гена K-ras, найденные Botezatu и соавт. [20] в составе внеклеточных ДНК в моче больных раком поджелудочной железы (стадия IV) и кишечника (стадии III-IV). Концентрация опухолевой ДНК в моче достаточно высока - мутантный ген K-ras обнаружен во внДНК мочи у пяти из восьми больных раком поджелудочной железы и у четырех из пяти больных раком кишечника [20]. Возможность поступления ДНК в мочу из крови доказывают результаты опытов по выявлению в моче больных туберкулезом ДНК Mycobacterium tuberculosis [22, 23]. Таким образом, встречающиеся в крови фрагменты ДНК размером 50-100 п.н., по-видимому, частично защищенные гистонами, тем не менее, потенциально могут проникать в мочу из крови. Кроме того, высказано предположение, что связывание ДНК с гистонами, например с H3K27me2, может способствовать экспорту внеклеточной ДНК [24]. Очевидно, что еще одним и, по-видимому, основным источником внДНК и внРНК в моче является апоптоз/некроз клеток мочеполового тракта. Действительно, в норме за сутки в мочу может попадать до 3 × 106 клеток эпителия мочевого пузыря и мочевыводящих путей (подсчет по методу Каковского-Аддиса) [25]. Очевидно, что эти клетки и клетки эндотелия частично могут вступать в апоптоз, и фрагментированная апоптотическая ДНК/РНК из этих клеток неизбежно будет попадать в мочу [20]. Действительно, после трансплантации женщинам почек от доноров мужчин концентрация Y-хромосомной ДНК в моче увеличивается при развитии отторжения и возвращается к нормальному уровню при ингибировании иммунной реакции против трансплантата [26-28]. Во внеклеточной ДНК мочи при помощи MALDI-TOF-масс-спектрометрии также обнаружены SNP-аллели донорной почки [29]. Во внеклеточной ДНК мочи больных раком мочеполовой системы выявлены мутации и микросателлитные нарушения, характерные для злокачественных опухолей почки [30] и мочевого пузыря [31-33], аберрантно метилированные ДНК, характерные для опухолей предстательной железы [34, 35] и мочевого пузыря [33, 36-40]. В моче больных с гинекологическими, урологическими заболеваниями или с ВИЧинфекцией присутствует ДНК папилломавируса, который поражает глубокие слои кожи и слизистые оболочки внутренних органов [41]. При раке мочевого пузыря во внеклеточной ДНК мочи обнаруживаются последовательности не только геномной, но и митохондриальной ДНК [42]. Концентрация РНК в моче человека составляет 20-140 нг/мл [43, 44]. Доказательством того, что внРНК в моче появляется в результате апоптоза/некроза клеток мочеполового тракта, может служить обнаружение в моче больных раком мочевого пузыря и пациентов с инфекциями мочевыводящих путей мРНК сурвирина, цитокератина 20, муцина 7 и Ki-67 [45, 46]. Данные о транспорте циркулирующей РНК из крови в мочу нам обнаружить не удалось. Строго говоря, данные о присутствии в моче онко/плодоспецифических НК не позволяют получить прямой ответ на вопрос о том, какая часть внНК образуется за счет апоптоза/некроза клеток, выстилающих мочеполовые пути (следует отметить, что клетки простатического происхождения составляют не более 10% от суммарного пула клеток мочи [47]). Данные о концентрации опухолеспецифических НК в моче и крови больных онкологическими заболеваниями мочеполовой системы свидетельствуют о том, что транспорт опухолеспецифических внНК из крови не является процессом, определяющим концентрацию этих внНК в моче. Действительно, метилированные формы генов GSTP1 и RASSF1A обнаруживаются в моче 15 и 65% больных раком почки и в крови 6 и 11% пациентов соответственно [48], т.е. эти маркерные ДНК не могут поступать из крови в мочу, а, скорее всего, транспортируются непосредственно в мочу. На основании этих и ряда других [49, 50] данных можно уверенно утверждать, что при онкологических заболеваниях мочеполового тракта основная доля онкоспецифических внеклеточных НК поступает в мочу не из крови, а, по-видимому, непосредственно при попадании опухолевых клеток или продуктов их распада в мочевыделительные пути либо в результате диффузии через ткани почки. ОСОБЕННОСТИ СТРОЕНИЯ И СОСТАВА НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ МОЧИ По размеру фрагментов внДНК мочи можно условно поделить на две группы: гетерогенная высокомолекулярная (1 т.п.н. и выше) и относительно гомогенная низкомолекулярная ДНК (150-250 п.н.) [20, 43, 51, 52]. В моче обнаружена также низкомолекулярная ДНК размером 10-150 и 150-200 п.н. [53]. Изучению ДНК и РНК бесклеточной фракции мочи посвящены отдельные работы, тогда как в основной массе исследований проводится поиск онкоспецифических маркеров в суммарной моче или только в клетках мочи. В составе внДНК обнаружены практически такие же изменения, характерные для опухолевых ДНК, как и в ДНК, циркулирующих в крови, а именно, точечные мутации, нарушения состава микросателлитов, характерный профиль метилирования онкогенов, присутствие вирусной ДНК [30, 33, 36, 41]. ДНК-маркеры анализировали преимущественно методом ПЦР. Микросателлитные перестройки (в одном или нескольких из 28 маркеров: D1S251, HTPO, D3S1317, D3S587, D3S1560, D3S1289, D3S1286, D3S1038, D4S243, FGA, CSF, ACTBP2, D8S348, D8S307, D9S747, D9S242, IFNa, D9S162, D11S488, THO, vWA, D13S802, MJD, D17S695, D17S654, D18S51, MBP, D21S1245) обнаружены в моче 76% больных с опухолями почек [30]. Хотя бы одно из нарушений микросателлитной ДНК (D4S243, D9S747, D9S171, D17S695, D17S654) обнаружено у 27% больных с опухолями мочевого пузыря [31]. Внеклеточные ДНК с мутациями в гене FGFR3 обнаружены в моче 34.5% больных раком мочевого пузыря [33], Р53 - у 52.9% больных раком печени [54], K-ras - у 95% больных раком кишечника [55]. Аберрантно метилированные ДНК, характерные для клеток опухолей предстательной железы (ген GSTP1), найдены в моче 36% больных раком предстательной железы [34, 56] и у 3.2% лиц с доброкачественной гиперплазией предстательной железы [35]. Изменения метилирования обнаружены в ряде генов внДНК мочи больных раком мочевого пузыря: CDKN2A (46.7%), ARF (26.7%), GSTP1 (46.7%), MGMT (26.7%), RARβ2 (60%), TIMP3 (46.7%), CDH1 (66.7%), RASSF1A (53%) и АРС (53%) [37]. Кроме того, определение статуса метилирования одновременно четырех генов: MYO3A, CA10, NKX6, SOX11 или MYO3A, CA10, NKX6, DBC1, внДНК мочи позволяет детектировать рак мочевого пузыря c высокой чувствительностью (81.3%) и специфичностью (97.3%), а определение статуса метилирования одновременно пяти генов: MYO3A, CA10, NKX6, DBC1, SOX11 или MYO3A, CA10, NKX6, DBC1, PENK, позволяет выявлять рак мочевого пузыря с чувствительностью 85.2% и специфичностью 94.5% [40]. В моче женщин с патологиями шейки матки ДНК папилломавируса человека типа 16 была обнаружена у 88.8% больных раком, 76.5% пациенток, имеющих поражения высокой степени, и у 45.5% больных с поражениями низкой степени [57]. В моче больных раком предстательной железы, получивших хирургическое лечение, папилломавирусная ДНК обнаружена в 50% случаев [58]. Что касается маркерной внеклеточной РНК, то у двух из четырех больных раком мочевого пузыря и у двух из четырех пациентов с инфекциями мочевыводящих путей при помощи количественной ОТ-ПЦР обнаружена специфическая мРНК Ki-67, не найденная в моче пяти здоровых доноров [46]. Кроме того, методом ОТ-ПЦР в моче больных раком мочевого пузыря обнаружены мРНК сурвирина (чувствительность 90.4%, специфичность 94.7%), цитокератина 20 (чувствительность 82.6%, специфичность 97.4%) и муцина 7 (чувствительность 62.6%, специфичность 94.7%) (Р < 0.001). Комбинация этих трех маркеров позволяет выявлять рак мочевого пузыря с чувствительностью 100% при специфичности анализа 89.5% [45]. Определение концентрации мРНК CD147, BIGH3, STMN1 в бесклеточном супернатанте мочи (после центрифугирования суммарной мочи при 10000 об/мин) показало, что у пациентов с уротелиальным раком мочевого пузыря концентрация этих мРНК в 2-67 раз выше, чем у здоровых доноров [59]. Перспективный маркер, специфически экспрессирующийся при раке предстательной железы, - мРНК AMACR (α-methylacyl coenzyme A racemase). Детекция мРНК AMACR в осадке мочи 92 мужчин, из которых у 43 диагностирован рак предстательной железы, позволяет выявлять больных с чувствительностью 70% и специфичностью 71%, тогда как определение мРНК PCA3 обеспечивает чувствительность 72% и специфичность 59% [60]. Одновременное определение мРНК AMACR и PCA3 повышает чувствительность и специфичность теста до 81 и 84% соответственно. Анализ соотношения мРНК ETS2 (v-ets erythroblastosis virus E26 oncogene homolog 2) и мРНК uPA (urokinase plasminogen activator) во внеклеточной РНК в суммарной моче (без центрифугирования/осаждения клеток) позволил диагностировать рак мочевого пузыря со 100% специфичностью и 75.4% чувствительностью [61]. Однако использование мРНК мочи для разработки систем диагностики различных заболеваний до сих пор представляет довольно сложную задачу, поскольку моча содержит большое количество нуклеаз, в том числе и РНКаз (их разнообразие описано в следующей главе). Высокая концентрация ферментов, гидролизующих РНК, осложняет работу с внеклеточными РНК, в том числе и на стадии выделения. В отличие от длинных молекул мРНК, микроРНК более устойчивы к атакам нуклеаз в связи со своим небольшим размером (20-25 нуклеотидов), способностью формировать прочные комплексы с биополимерами или упаковываться в различные микрочастицы, например, экзосомы [4]. Действительно в моче обнаружены m-, sca-, sno-, sn-, pi-, miРНК, в том числе и в составе экзосом [4, 62]. Основываясь на этих данных, все больше исследователей пытаются разработать тест-системы для диагностики различных онкологических заболеваний путем анализа микроРНК в моче. Так, например, показано, что соотношение концентрации микроРНК-126 и микроРНК-152 в моче позволяет обнаружить рак мочевого пузыря со специфичностью 82% и чувствительностью 72% [63]. Определение концентраций микроРНК-210, -10b и -183 повышает специфичность детекции рака мочевого пузыря до 91% при чувствительности не менее 71% [64]. В моче здоровых доноров, онкологических больных и беременных женщин обнаружено более 204 микроРНК, отличающихся в этих группах, часть из которых может быть потенциальными маркерами (например, miR-515-3p, 335, 892a, 509-5p, 223*, 873, 302d, 616*, 134) [44]. Обнаружено, что уровень экспрессии микроРНК 483-5p в бесклеточной фракции мочи статистически значимо повышен (критерий Манна-Уитни, Р = 0.013) при раке предстательной железы [65]. Исследование микроРНК, относящихся к эпителиально-мезенхимальному переходу (EMT, epithelialmesenchymal transition) [66], в осадке и супернатанте мочи у 51 больного раком мочевого пузыря и 24 здоровых доноров выявило уменьшение количества семейства микроРНК-200, микроРНК-192 и -155 в осадке, а также снижение экспрессии микроРНК-192 и повышение экспрессии микроРНК-155 в супернатанте мочи больных. Кроме того, уровень экспрессии семейства микроРНК-200, микроРНК-205 и микроРНК-192 в осадке мочи больных статистически значимо коррелировал с экспрессией маркеров ЕМТ в моче, включая мРНК Е-бокссвязывающего гомеобокса 1 с цинковыми пальцами (zinc finger E-boxbinding homeobox 1), виментина, трансформирующего фактора роста 1 и гена гомолога семейства Ras (член А). Обнаружено, что уровни микроРНК-200с и микроРНК-141 в осадке мочи больных нормализуются после удаления опухоли мочевого пузыря. ДНК- И РНК-ГИДРОЛИЗУЮЩИЕ ФЕРМЕНТЫ МОЧИ Моча человека представляет собой подходящую среду для функционирования НК-гидролизующих ферментов: суточная моча взрослого человека содержит 2.0-4.0 г калия, 100-400 мг кальция, 50-150 мг магния, 3-6 г натрия, 270-850 мкг цинка [25], величина рН мочи в норме варьирует от 5.0 до 7.0. Основным ДНК-гидролизующим ферментом в моче, как и в крови [1], является ДНКаза I [67-70], причем ее активность в моче превышает активность в сыворотке крови более чем в 100 раз [71] и составляет 400÷1200 ед. акт./л (удельная активность ДНКазы I - 2000 ед. акт./мг, в крови 4.4 ± 1.8 ед. акт./л). Внеклеточную ДНК в моче могут гидролизовать все изоформы ДНКазы I, которые, как известно, отличаются по значению pI, первичной структуре и/или по содержанию сиаловой кислоты [72]. Кроме того, сообщалось о генетическом полиморфизме ДНКазы I в моче [69]. На мышиной модели показано, что концентрация ДНКазы I в моче может значительно повышаться при развитии системной красной волчанки (от 24 до 521 нг/мл), тем самым косвенно отражая нарушения, происходящие в организме [73]. В крови активность ДНКазы I ингибируется актином [68, 74, 75], однако в моче концентрация актина, по-видимому, существенно ниже, чем в крови (концентрацию актина определяют по концентрации 3-метилгистидина, специфического метаболита актина и миозина) [76]. ДНКаза II [70, 71, 77] также обнаруживается в моче. Активность ДНКазы II в моче человека приблизительно в 30 раз ниже, чем ДНКазы I [77]. При этом активность этого фермента примерно в 1.5-5 раз выше, чем в крови [78], и составляет примерно 13-40 ед. акт./л мочи. Наряду с ДНКазами в моче присутствует и фосфодиэстераза I, имеющая pH-оптимум 9.0 (фермент стабилен при рН от 3.0 до 11.0) [71, 79]. Что же касается РНК-гидролизующих ферментов мочи, то, к сожалению, работы по их исследованию велись, в основном, в прошлом веке (70-е-90-е гг.). РНКаза 2 - наиболее представлена в моче человека, где ее примерно в 20 раз больше, чем РНКазы I. Молекулярная масса РНКазы 2, определенная методами электрофореза в SDS-PAGE и гельфильтрацией, составляет 32 и 38 кДа соответственно, рН-оптимум находится в диапазоне 7.2-7.6 [80]. Рибонуклеаза I (РНКаза I) - второй по представленности РНК-гидролизующий фермент мочи [81]. Молекулярная масса этого фермента составляет ~16 кДа, фермент активен при рН 7.0 и ингибируется ионами Cu2+, Hg2+ и Zn2+. РНКаза I является пиримидин-специфичным ферментом, более эффективно гидролизует поли(С) и поли(U), в отличие от поли(А) и поли(G). Кроме того, РНКаза I способна гидролизовать гетеродуплексы РНК:ДНК [82]. Наряду с РНКазами 2 и I в моче человека обнаружены РНКазы С и U с рН-оптимумами 8.5 и 7.0 соответственно [83], а также РНКазы 7, UL, US, UpI-1 и UpI-2. РНКаза С (33 кДа) представляет собой гликопротеин, предпочтительно гидролизующий синтетический гомополимер поли(С), аналогичный РНКазам поджелудочной железы млекопитающих. РНКаза U (18 кДа) также является гликопротеином, использует в качестве субстрата РНК, но практически не активна в отношении поли(С) и обладает меньшей гомологией с РНКазами поджелудочной железы. По аминокислотному составу этот фермент сходен с РНКазой селезенки человека. РНКазы с молекулярной массой 33 [84] и 21.5 кДа [85], рН-оптимумом 6.5 и более эффективным гидролизом поли(С) обнаружены в моче человека и другими исследователями. РНКаза 7 (14.5 кДа) присутствует в моче в концентрации 235-3467.2 мг/л [86]. РНКаза 7 проявляет антибактериальную активность при щелочных значениях рН. Пиримидин-специфичные РНКазы UL (38 кДа) и US (13 кДа), имеющие рН-оптимумы 8.0 и 6.75 соответственно, обнаружены в моче взрослых индивидов [87]. В моче беременных женщин обнаружены РНКазы UpI-1 (34 кДа) и UpI-2 (38 кДа) c pH-оптимумами 7.7 и 6.6 соответственно [88]. Таким образом, внеклеточные ДНК и РНК гетерогенны по своему размеру и составу. В мочу они могут поступать как из крови, так и из клеток мочеполовой системы преимущественно в результате апоптоза, некроза, онкоза и активной секреции (в составе экзосом). Биологические функции внеклеточных нуклеиновых кислот мочи не исследованы, однако ДНК, РНК и малые РНК представляют интерес для ранней неинвазивной диагностики онкологических заболеваний различной этиологии.

Об авторах

O. E. Брызгунова

Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН

Автор, ответственный за переписку.
Email: olga.bryzgunova@niboch.nsc.ru
Россия

П. П. Лактионов

Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН; Новосибирский научно-исследовательский институт патологии кровообращения им. академика Е.Н. Мешалкина

Email: olga.bryzgunova@niboch.nsc.ru
Россия

Список литературы

Дополнительные файлы