Термодинамика конформационных переходов АP-эндонуклеазы человека APE1 при взаимодействии с ДНК

Полный текст

ВВЕДЕНИЕ Одними из наиболее часто встречающихся повреж дений ДНК являются апуриновые/апиримидино вые сайты (АР-сайты) [1, 2], которые образуются в ДНК при спонтанном или катализируемом ДНК гликозилазами гидролизе N-гликозидных связей [3]. Ежедневно в каждой клетке организма челове ка может возникать до 10 000 АР-сайтов. Высокая мутагенность АР-сайтов связана как с отсутствием кодирующего азотистого основания, так и с их по вышенной способностью вызывать одноцепочечные разрывы рибозофосфатного остова ДНК. Ключевой фермент системы эксцизионной репа рации оснований (ЭРО) - апуриновая/апиримиди новая эндонуклеаза человека APE1 - отвечает за по иск и инициирование процесса удаления АР-сайтов из ДНК [4, 5]. Основной физиологической функцией фермента является гидролиз фосфодиэфирной связи в ДНК с 5′-стороны от АР-сайта, в результате чего происходит разрыв рибозофосфатного остова с обра зованием фрагментов цепи, содержащих 3′-гидрок сильную группу и 2′-дезоксирибозо-5′-фосфат [6, 7]. Анализ кристаллических структур свободного фермента APE1 [8-10] и его ковалентных комплек сов с ДНК [11-13] показал, что для осуществления катализа в комплексе АРЕ1•ДНК образуются кон такты, которые приводят к выворачиванию AР сайта из двойной спирали. На рис. 1 представлена APE1 с ДНК, содержащей F-сайт, у которого отсут ствует OH-группа в положении С1′ дезоксирибозы (PDB ID 1DE8). Видно, что аминокислотные остатки фермента взаимодействуют преимущественно с од ной цепью дуплекса, как правило, с образованием водородных связей и электростатических контактов между фосфатными группами ДНК и боковыми ради калами аминокислот, а также с амидными группами пептидных связей белка. Активный центр фермента образован остатками Asp308, His309, Glu96, Asp210, Tyr171, Asn212 и Asn174. Стабилизация внеспираль ной конформации АР-сайта осуществляется остат ками Met270 и Arg177. Меt270 встраивается в малую бороздку ДНК, тем самым вытесняя основание, распо ложенное напротив АР-сайта. Остаток Arg177 встраи вается со стороны большой бороздки ДНК и образует водородную связь с фосфатной группой, расположен ной с 3′-стороны от AР-сайта. В фермент-субстрат ном комплексе, находящемся в каталитически компе тентном состоянии, остаток фосфата, расположенный с 5′-стороны от АР-сайта, координирован остатками Asn174, Asn212 и His309. Каталитическая реакция на чинается с нуклеофильной атаки молекулы воды, ко ординированной прямо или опосредованно через ион Mg2+ остатком Asp210 [11, 13], по 5'-фосфатной группе. Ранее методом «остановленного потока» с реги страцией изменения интенсивности флуоресцен ции остатков триптофана [14, 15], входящих в состав фермента, и 2-аминопурина [16], расположенно го с 3′- или 5′-стороны от АР-сайта, был установ лен кинетический механизм взаимодействия АРЕ1 с ДНК-субстратами (схема). В качестве субстратов использовали ДНК-дуплексы, содержащие натив ный АР-сайт или его аналог (F-сайт) без OH-группы в положении С1′ дезоксирибозы. Показано, что вза имодействие АРЕ1 с субстратами включает, как ми нимум, две стадии связывания ДНК и узнавания АР-сайта, которые приводят к образованию катали тически компетентного комплекса. В этом комплек се происходит необратимая стадия каталитическо го гидролиза 5’-фосфодиэфирной связи АР-сайта. Последняя стадия кинетического механизма харак теризует равновесный процесс диссоциации ком плекса фермента с продуктом реакции. Схема. Кинетический механизм взаимодействия АРЕ1 с ДНК-субстратом , где Е - фермент, S - субстрат, (E•S)1 и (E•S)2 - ком плексы фермента с субстратом, Р - продукт пре вращения субстрата, E•P - комплекс фермента с продуктом, ki и k-i - константы скорости прямых и обратных реакций равновесных стадий, kcat - кон станта скорости каталитической стадии, Kp - равно весная константа диссоциации комплекса Е•Р. Следует отметить, что согласно рентгеноструктур ным данным связывание ДНК приводит лишь к не значительным структурным перестройкам APE1 (рис. 2). Сравнение структуры свободного APE1 (PDB ID 4LND) и комплекса APE1 с ДНК, содержащей F-сайт (PDB ID 1DE8), показывает, что один из семи остатков триптофана молекулы фермента, Trp280, расположен в ДНК-связывающем центре фермента и образует водородную связь с фосфатной группой ДНК. Таким образом, наблюдаемые изменения флуо ресценции Trp, скорее всего, характеризуют конфор мационные изменения фермента в области Trp280. Цель нашей работы состояла в определении тер модинамических параметров конформационных перестроек АРЕ1 при специфическом узнавании поврежденного участка ДНК и осуществлении ка талитической стадии ферментативной реакции в условиях эксцизионной репарации оснований с ис пользованием кинетических данных ферментатив ного процесса, полученных для различных темпера тур. Использованный подход позволил определить термодинамические параметры стадий образования каталитически активной формы фермента, включая фермент-субстратный комплекс, в отличие от данных [17], полученных ранее для не активной формы АРЕ1. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ Олигодезоксирибонуклеотиды Олигонуклеотиды очищали с помощью ВЭЖХ на ио нообменной колонке (PRP-X500 Hamilton Company 3.9 × 300 mm particle size 12-30 μm) и последующей обращенно-фазовой хроматографии (Nucleoprep 100-20 C18 10 × 250 mm, Macherey-Nagel, Германия). Чистоту олигонуклеотидов проверяли с помощью денатурирующего электрофореза в 20% полиакри ламидном геле (ПААГ). Концентрацию олигонукле отидов измеряли по оптической плотности раство ров на длине волны 260 нм в электронных спектрах поглощения и рассчитывали по закону Бугера- Ламберта-Бера, исходя из коэффициентов молярной экстинкции, определенных в приближении метода «ближайших соседей» [18]. ДНК-субстрат фермен та APE1 (F-субстрат) представлял собой 17-звенный дуплекс, состоящий из дезоксирибоолигонуклеоти дов 5′-TCTCTCTCFCCTTCCTT-3′ и 3′-AGAGAGAGGGGAAGGAA-5′. Фермент APE1 Фермент АРЕ1 был выделен из линии клеток Escherichia coli Rosetta 2, трансформированных плазмидой pET11а, несущей ген AP-эндонуклеазы человека. Культуру клеток E. coli Rosetta 2 вы ращивали в среде LB (1 л), содержащей 50 мкг/мл ампициллина, при температуре 37°С до оптической плотности 0.6-0.7 при длине волны 600 нм. После этого температуру понижали до 20°С и индуциро вали транскрипцию добавлением изопропил-β-D тиогалактопиранозида до 0.2 мМ. После индукции культуру клеток инкубировали в течение 16 ч. Затем клетки осаждали центрифугированием (10 мин, 12000 об/мин) и готовили суспензию клеток в 30 мл буферного раствора I (20 мМ HEPES-NaOH, pH 7.8), содержащего 40 мМ NaCl. Клетки лизировали при помощи френч-пресса. Все последующие проце дуры проводили при 4°С. Лизат клеток центрифуги ровали (40 мин при 30 000 об/мин), супернатант нано сили на колонку I (Q-Sepharose Fast Flow, Amersham Biosciences, Швеция) и промывали буферным рас твором I (20 мМ HEPES-NaOH, pH 7.8), содержащим 40 мМ NaCl. Фракции, содержащие белок APE1, со бирали и наносили на колонку II (HiTrap-Heparin™, Amersham Biosciences, Швеция). Хроматографию проводили в буферном растворе I и линейном гради енте 40 → 600 мМ NaCl, оптическую плотность раство ра регистрировали на длине волны 280 нм. Степень чистоты белка APE1 определяли с помощью гель электрофореза. Фракции, содержащие белок APE1, диализовали в буфере 20 мМ HEPES-NaOH, pH 7.5, 1 мМ EDТА, 1 мМ дитиотреит, 250 мМ NaCl, 50% гли церин и хранили при -20°С. Концентрацию фермен та рассчитывали из значений оптической плотности белка на длине волны 280 нм и коэффициента моляр ной экстинкции 56818 М-1см-1 [19]. Кинетические исследования методом «остановленного потока» Кинетические кривые флуоресценции регистриро вали с использованием спектрометра остановленной струи SX.20 (Applied Photophysics, Великобритания). Длина волны возбуждения флуоресценции составля ла 290 нм. Флуоресценцию регистрировали на длинах волн более 320 нм (Schott filter WG 320). Поскольку молекула АРЕ1 содержит семь остатков Trp и 11 остатков Tyr, то в использованных условиях реги страции интенсивность флуоресценции белка более чем на 90% определялась остатками Trp. «Мертвое» время прибора составляло 1.1 мс, максимальное время регистрации сигнала равно 200 с. Все экспе-рименты выполняли в буферном растворе, соответ ствующем условиям ЭРО: 50 мМ трис-HCl, pH 7.5, 50 мМ KCl, 5 мМ MgCl2, 1 мМ дитиотреит, 7% глице рин при 10-37°С. Каждую кинетическую кривую ус редняли, как минимум, по трем экспериментальным кривым. Анализ степени гидролиза 5′-фосфодиэфирной связи в АР-сайте Для получения зависимостей степени гидроли за 5′-фосфодиэфирной связи в АР-сайте от вре мени смешивали растворы фермента и мечен ного 32P субстрата. Метку вводили по 5′-концу F-cодержащего олигонуклеотида с помощью Т4 полинуклеотидкиназы («СибЭнзим», Новосибирск) и [γ-32P]ATP («Биосан», Новосибирск) согласно [20, 21]. Далее из реакционной смеси отбирали аликво ты объемом 2 мкл, которые помещали в предвари тельно подготовленные пробирки, содержащие 3 мкл раствора 7 М мочевины, 0.1% бромфенолового сине го и 0.1% ксиленцианола FF. Электрофорез в ПААГ проводили при напряжении 50 В/см. Гель радиоав тографировали на рентгеновскую пленку Agfa CPBU New (Agfa-Geveart, Бельгия) в течение 12-60 ч при -20°С. Анализ кинетических кривых Для расчета констант скорости конформационных переходов получали набор кинетических кривых для разных концентраций субстрата при разных температурах. Регистрацию проводили в усло виях, близких к «одному обороту фермента», т.е. при концентрациях фермента и субстрата одно го порядка. Для определения минимальной кине тической схемы, описывающей взаимодействие фермента с субстратом, и расчета констант ско рости всех элементарных стадий данной схемы использовали программу DynaFit (BioKin, США) [22]. Количественную обработку результатов экс периментов проводили путем оптимизации значе ний параметров, входящих в кинетические схемы, как описано ранее [23-25]. Используя полученные значения констант скоро сти отдельных стадий, рассчитывали константы рав новесия (Ki) этих стадий (ki/k-i, где i - номер стадии) при разных температурах. Стандартные термодина мические параметры i-й равновесной стадии опреде ляли с помощью уравнения Вант-Гоффа (1) [26, 27] ln(Ki) = -ΔGi/RT = -ΔHi/RT + ΔSi/R. (1) Зависимости ln(Ki) от 1/T имели линейный вид. Анализ температурной зависимости констан ты скорости химической реакции kcat по уравнению Эйринга (2) позволил рассчитать стандартную эн тальпию активации (ΔH‡) и стандартную энтропию активации (ΔS‡) переходного состояния [26] ln(kcat/T) = ln(kB/h) + (ΔSo,‡/R) - (ΔHo,‡/RT), (2) где kB и h - постоянные Больцмана и Планка соот ветственно, R - газовая постоянная, Т - абсолютная температура в градусах Кельвина. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Для уточнения природы процессов, происходящих на последовательных стадиях узнавания F-сайта в ДНК-субстрате, катализа и диссоциации комплекса фермента с продуктом, был выполнен постадийный термодинамический анализ взаимодействия APE1 с F-субстратом. Методом «остановленного потока» с регистрацией интенсивности флуоресценции остат ков Trp в АРЕ1 получены кинетические кривые, ха рактеризующие взаимодействие APE1 с 17-звенным F-субстратом в условиях одного оборота фермен та при температуре от 10 до 37°С (рис. 3). Видно, что взаимодействие APE1 с F-субстратом приводит к многофазным изменениям интенсивности флуо ресценции Trp. Согласно полученным ранее данным [14, 15], уменьшение интенсивности флуоресценции на начальном участке кинетических кривых харак теризует образование каталитически компетентного комплекса. Каталитическая стадия процесса, приво дящая к образованию продуктов и последующей дис социации комплекса фермент-продукт, сопровожда ется увеличением интенсивности флуоресценции Trp на более поздних временах (начиная примерно от 1 с). Как видно из кинетических кривых (рис. 4), обе фазы изменения интенсивности флуоресценции зависят от температуры. Анализ кинетических кривых изменения интен сивности флуоресценции белка показал, что мини мальный кинетический механизм взаимодействия АРЕ1 с ДНК-субстратом, содержащим в качестве повреждения F-сайт, включает двухстадийное равновесное связывание, необратимое образование комплекса фермент-продукт и равновесную диссо циацию этого комплекса, который, как и ранее [14- 16], описывается схемой. Константы скорости прямых и обратных реакций, характеризующие взаимодействие APE1 с ДНК субстратом при разных температурах, рассчиты вали методом нелинейной регрессии, включающим численное интегрирование дифференциальных уравнений, соответствующих схеме, как описано ранее [28, 29]. Используя полученные константы скорости, определяли константы равновесия Ki и Kp (табл. 1). Как показано на рис. 5, зависимости ln(Ki) и ln(kcat/Т) от 1/Т имеют линейный вид, что позво ляет рассчитать термодинамические параметры равновесных стадий по уравнению Вант-Гоффа (1) и параметры переходного состояния каталитической стадии по уравнению Эйринга (2) (табл. 2). Согласно полученным данным, образование первичного фермент-субстратного комплекса (первая стадия в схеме) характеризуется поло жительным значением стандартной энтальпии (14.3 ккал/моль) и положительным значением энтро пии (79.0 кал/(моль × К)). Известно, что увеличение энтропии при взаимодействии ДНК-связывающих белков с ДНК, как правило, обусловлено двумя фак торами: десольватацией полярных групп в области контакта белок-ДНК [30] и вытеснением высокоупо рядоченных «кристаллических» молекул воды из бо роздок ДНК [31]. Можно предположить, что на этой стадии происходит образование связей между ами нокислотными остатками ДНК-связывающего цен тра и ДНК-дуплексом. Среди них можно отметить взаимодействие между фосфатными группами ДНК дуплекса с 5′- и 3′-стороны от F-сайта и остатками Arg73, Ala74, Lys78, Trp280, Asn222, Asn226 и Asn229 (рис. 1). Кроме того, в этот момент времени, вероят но, происходят встраивание остатка Arg177 в ДНК дуплекс со стороны большой бороздки и образование водородной связи с фосфатной группой, расположен ной с 3′-стороны от F-сайта. Остаток Met270 встра ивается в ДНК-дуплекс со стороны малой бороздки и также может вытеснять «кристаллическую» воду. Ранее, на примере ДНК-гликозилаз Fpg E. coli [28] и hOGG1 человека [29], принадлежащих к разным структурным классам и, как следствие, образую щих с ДНК отличающиеся по своей природе кон такты, было показано, что стадии образования фер мент-субстратного комплекса и его изомеризации в каталитически компетентное состояние характе ризуются значительным ростом энтропии, также, по видимому, вызванному десольватацией взаимодей ствующих поверхностей белка и ДНК. Вторая стадия взаимодействия APE1 c F-субстратом, представляющая собой специфиче скую перегруппировку комплекса (E•S)1, характери зуется отрицательным значением изменения как эн тальпии (ΔH°2 = -6.8 ккал/моль), так и энтропии (-24.6 кал/(моль×К)). Отрицательное значение ΔH°2 свиде тельствует о стабилизации комплекса при образова нии новых, энергетически выгодных связей между взаимодействующими атомами, а отрицательное значение ΔS°2 - об увеличении его жесткости, т.е. об уменьшении внутренних степеней свободы. Эта стадия, по-видимому, включает процесс выворачи вания F-сайта в активный центр фермента и стаби лизации этого состояния с помощью остатков Arg177 и Met270, которые встраиваются в большую и малую бороздки ДНК соответственно. Кроме того, в этот мо мент происходит, вероятно, образование связей меж ду фосфатной группой, расположенной в 5′-направ лении от F-сайта (рис. 1), остатками Asn174, Asn212 и His309 и ионом Mg2+, расположенными в активном центре фермента. Для третьей, каталитической, стадии были рассчи таны значения энтальпии (ΔH≠) и энтропии (ΔS≠) ак тивации процесса образования переходного комплекса. Полученное значение энтальпии активации равно 12.2 ккал/моль. Необходимо отметить, что это значе ние относится к стадии гидролиза фосфодиэфирной связи ферментом APE1 и лежит в диапазоне величин 6.0-18.6 ккал/моль, полученных ранее для каталити ческих стадий реакций разрыва N-гликозидной свя зи и β-элиминирования фосфатных групп, осущест вляемых ДНК-гликозилазами Fpg и hOGG1 [28, 29]. Термодинамические параметры образования ком плексов АРЕ1 с АР-содержащей ДНК были опреде лены ранее методом SPR, т.е. в гетерофазных услови ях, для каталитически неактивной формы фермента в отсутствие ионов Mg2+ [17]. Использованный же нами подход [28, 29] позволяет получать термодина мические данные для процессов, протекающих в во дном растворе, т.е. в гомофазных условиях, с участи ем каталитически активных форм ферментов, в том числе короткоживущих фермент-субстратных про межуточных комплексов. Интересно отметить, что термодинамические па раметры стадии образования комплекса фермента с продуктом реакции коррелируют с параметра ми образования первичного комплекса. Как и пер вая стадия, этот процесс характеризуется поло жительными значениями изменений стандартных значений энтальпии и энтропии (6.8 ккал/моль и 46.6 кал/(моль×К) соответственно). Это свидетель ствует о том, что основной вклад в термодинами ческие параметры этой стадии вносят те же взаи модействия, которые происходят на первой стадии связывания АРЕ1 с ДНК-субстратом - неспецифи ческие контакты между ДНК-связывающим цен тром и рибозофосфатным остовом ДНК-дуплекса. Однако комплекс фермента с продуктом E•Р можно считать истинным неспецифическим комплексом, тогда как образование первичного комплекса (E•S)1 в случае короткого ДНК-субстрата включает неко торые элементы специфического узнавания F-сайта. Поэтому образование комплекса (E•S)1 по сравне нию с комплексом E•Р энергетически более выгод но (ΔΔG°298 = -2.2 ккал/моль, ΔΔH° = 7.5 ккал/моль, ΔΔS° = 32.4 кал/(моль×К)). Таким образом, нами получены термодинамиче ские параметры конформационных перестроек фер мента АРЕ1 в процессе специфического узнавания поврежденного участка ДНК и осуществления ка талитической стадии, которые позволили сделать вывод о молекулярной природе отдельных стадий кинетического механизма, описывающего функцио нирование фермента.

Об авторах

A. Д. Мирошникова

Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН

Email: nikita.kuznetsov@niboch.nsc.ru
Россия

A. A. Кузнецова

Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН

Email: nikita.kuznetsov@niboch.nsc.ru
Россия

Н. A. Кузнецов

Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН; Новосибирский государственный университет

Автор, ответственный за переписку.
Email: nikita.kuznetsov@niboch.nsc.ru
Россия

O. С. Федорова

Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН; Новосибирский государственный университет

Email: fedorova@niboch.nsc.ru
Россия

Список литературы

Дополнительные файлы