Apurinic/apyrimidinic (AP) endonucleases play an important role in DNA repair and initiation of AP site elimination. One of the most topical problems in the field of DNA repair is to understand the mechanism of the enzymatic process involving the human enzyme APE1 that provides recognition of AP sites and efficient cleavage of the 5’-phosphodiester bond. In this study, a thermodynamic analysis of the interaction between APE1 and a DNA substrate containing a stable AP site analog lacking the C1’ hydroxyl group (F site) was performed. Based on stopped-flow kinetic data at different temperatures, the steps of DNA binding, catalysis, and DNA product release were characterized. The changes in the standard Gibbs energy, enthalpy, and entropy of sequential specific steps of the repair process were determined. The thermodynamic analysis of the data suggests that the initial step of the DNA substrate binding includes formation of non-specific contacts between the enzyme binding surface and DNA, as well as insertion of the amino acid residues Arg177 and Met270 into the duplex, which results in the removal of “crystalline” water molecules from DNA grooves. The second binding step involves the F site flipping-out process and formation of specific contacts between the enzyme active site and the everted 5’-phosphate-2’-deoxyribose residue. It was shown that non-specific interactions between the binding surfaces of the enzyme and DNA provide the main contribution into the thermodynamic parameters of the DNA product release step.
Одной из актуальных задач в изучении репарации ДНК остается выяснение механизма ферментативного процесса с участием эндонуклеазы APE1, который обеспечивает высокоточное узнавание апуриновых/апиримидиновых (АР) сайтов в ДНК и эффективный гидролиз 5′-фосфодиэфирной связи, играя тем самым важную роль в обеспечении стабильного функционирования ДНК и жизнедеятельности клетки. В настоящей работе проведен термодинамический анализ взаимодействия APE1 с ДНК-субстратом, содержащим аналог АР-сайта, у которого отсутствует OH-группа в положении С1′ 2′-дезоксирибозы (F-сайт). Методом «остановленного потока» с регистрацией изменений интенсивности флуоресценции белка при разных температурах проведен анализ кинетики образования фермент-субстратных комплексов, каталитической стадии и диссоциации комплекса фермента с продуктом реакции. Рассчитаны изменения стандартной свободной энергии Гиббса, энтальпии и энтропии последовательных стадий ферментативного процесса, а также образования переходного состояния в каталитической стадии. Полученные данные позволили предположить, что на первой стадии процесса происходят образование контактов между ДНК связывающим центром фермента и ДНК-субстратом, встраивание остатков Arg177 и Met270 в большую и малую бороздки ДНК соответственно и вытеснение из бороздок «кристаллической» воды. На второй стадии происходят выворачивание F-сайта в активный центр фермента и образование специфических контактов с 2′-дезоксирибозой и 5′-фосфатной группой. Показано, что основной вклад в термодинамические параметры процесса диссоциации комплекса фермент-продукт вносят неспецифические взаимодействия между ДНК-связывающим центром и рибозофосфатным остовом ДНК-дуплекса.