Связывание белкового фактора CTCF в альфа-глобиновом локусе генома кур
- Авторы: Котова E.С.1, Акопов С.Б.1, Дидыч Д.A.1, Петрова Н.В.2, Яровая O.В.2, Разин С.В.2, Николаев Л.Г.1
-
Учреждения:
- Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН
- Институт биологии гена РАН
- Выпуск: Том 8, № 1 (2016)
- Страницы: 90-97
- Раздел: Экспериментальные статьи
- Дата подачи: 17.01.2020
- Дата публикации: 15.03.2016
- URL: https://actanaturae.ru/2075-8251/article/view/10463
- DOI: https://doi.org/10.32607/20758251-2016-8-1-90-97
- ID: 10463
Цитировать
Аннотация
В альфа-глобиновом локусе генома кур и окружающих областях с использованием метода двумерного сдвига электрофоретической подвижности проведен систематический поиск фрагментов ДНК, содержащих потенциальные сайты связывания фактора транскрипции CTCF. При помощи иммунопреци питации хроматина проверена занятость белком CTCF таких сайтов в отобранных фрагментах в эритроидных и лимфоидных клетках. Лишь один из 13 фрагментов ДНК, связывающихся с CTCF in vitro, с высокой эффективностью взаимодействует с этим белком in vivo в эритроидных клетках и менее эффективно в лимфоидных. Таким образом, связывание CTCF с участком ДНК in vitro по большей части не означает, что этот участок будет занят CTCF в ядре клетки. Связывание же CTCF in vivo, как правило, сопровождается связыванием белка с данным участком in vitro. При эритроидной дифференцировке не происходит существенных изменений в связывании CTCF с исследованными фрагментами ДНК.
Ключевые слова
Полный текст
ВВЕДЕНИЕ Гены HBZ, HBAD и HBAA, кодирующие альфа-гло бины, располагаются в альфа-глобиновом домене ге нома кур на хромосоме 14. Домен альфа-глобиновых генов кур относят к доменам открытого типа с прису щими им особенностями: он располагается в богатой генами области, чувствителен к нуклеазам во всех типах клеток и реплицируется в начале S-фазы клеточного цикла. Кластер альфа-глобиновых генов фланкирован генами «домашнего хозяйства», кото рые активно транскрибируются во всех изученных типах клеток [1]. Примерно в 20 т.п.н. с 5’-стороны от глобиновых генов находится главный регулятор ный элемент (MRE, major regulatory element) доме на [2], включающий в себя эритроид-специфичный промотор полнодоменного транскрипта [3]. Энхансер и сайленсер, активные в эритробластах кур, обнару жены вблизи 3’-конца гена HBAA. При эритроидной дифференцировке во всем домене меняется статус ацетилирования гистона H4 [4]. Фактор транскрипции CTCF считается одним из основных организаторов различных сетей регу ляции генов, включая активацию и репрессию транс крипции, образование независимо функционирую щих доменов хроматина, регуляцию импринтинга и т.д. Фундаментальные свойства CTCF позволяют ему действовать как фактору транскрипции, инсу ляторному белку, а также как компоненту распреде ленных по геному пограничных элементов, способно му привлекать различные факторы, появляющиеся в ответ на разнообразные внешние и внутренние сиг налы [5, 6]. Ранее в альфа-глобиновом локусе кур были идентифицированы несколько сайтов связы вания CTCF. Во-первых, это сайты M9 и C10-C14, связанные с CTCF в эритроидных и неэритроидных клетках и принадлежащие последовательностям с функциями инсуляторов [7], и CTCF-зависимый сайленсер (CDS, CTCF-Dependent Silencer [8]), свя занный с CTCF в эритроидных клетках HD3 и 6C2. Кроме того, методом ChIP-seq выявлены несколько сайтов, связанных с CTCF в эритроцитах пяти и десятидневных эмбрионов кур (обозначены здесь 5d1-5d3, 10d1-10d3, см. [9]). Один из этих сайтов, 5d1/10d2, по-видимому, принимает участие в пере ключении активности глобиновых генов в процессе развития [10]. В настоящей работе предпринят систематиче ский поиск потенциальных сайтов связывания CTCF в альфа-глобиновом домене кур и окружающих обла стях при помощи разработанного нами ранее метода двумерного сдвига электрофоретической подвиж ности (2D-EMSA, [11, 12]). Дальнейшее выявление среди отобранных фрагментов тех, которые связаны с CTCF в клетках эритроидного и неэритроидного типа, проводили путем иммунопреципитации хро матина с анализом ПЦР в реальном времени. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ Культуры клеток Линию куриных эритробластов HD3, трансформи рованных вирусом эритробластоза птиц (клон A6 линии LSCC, см. [13]), и линию B-клеток кур DT40 (CRL-2111) выращивали в среде DMEM/F12 (1 : 1) (Invitrogen) с добавлением 2% куриной и 8% эмбри ональной телячьей сыворотки при 37оС и 5% CO2. При выращивании DT40 к среде дополнительно до бавляли 2-меркаптоэтанол до концентрации 50 мкМ. Терминальную эритроидную дифференцировку клеток HD3 индуцировали инкубацией клеток в те чение 12 ч в присутствии 20 мкМ ингибитора про теинкиназ iso-H-7 (1-(5-изохинолинсульфонил)-3 метилпиперазиндигидрохлорид, Sigma-Aldrich) при рН 8.0 и 42оС в 100% воздушной атмосфере как описано ранее [14]. Для контроля дифференци ровки использовали окрашивание клеток бензидином [15]. К 25 мкл 0.4% (w/v) раствора бензидина (Sigma) в 4% уксусной кислоте добавляли 1 мкл 30% раство ра H2O2, смешивали с 25 мкл суспензии клеток, вы держивали в течение 10 мин и с помощью светово го микроскопа выявляли бензидин-положительные клетки, окрашенные в темно-синий цвет. Доля гемо глобинсодержащих (бензидин-положительных) кле ток составляла 21% после 12 ч инкубации. При этих условиях уровень транскрипции гена альфа-глобина близок к максимальному, но продолжает возрастать [16]. Белок CTCF и антитела к нему Полноразмерный куриный белок CTCF, содержащий полигистидиновую (6 × His) последовательность, был синтезирован в клетках COS-1 и частично очищен по описанному ранее методу [17]. Кроличьи поликло нальные антитела к фрагменту куриного CTCF (ами нокислотные остатки 86-233) приготовлены согласно [17, 18]. Получение библиотеки коротких фрагментов альфа-глобинового локуса ДНК клона CH261-75C12 искусственной бактериаль ной хромосомы (BAC, получена из CHORI BACPAC Resource Center, https://bacpac.chori.org), содержа щую вставку альфа-глобинового локуса кур длиной 227366 п.н., очищали при помощи набора Plasmid Midi Kit (Qiagen) и обрабатывали нуклеазой Plasmid-Safe ATP-Dependent DNase (Epicentre) в соответствии с рекомендациями производителей. Библиотеку коротких фрагментов получали в ос новном согласно [19]. Два образца ДНК BAC расще пляли либо Sau3AI, либо Csp6I (Fermentas), к лип ким концам присоединяли библиотечный праймер ACTGAGGTCGACTATCCATGAACA. Полученные суббиблиотеки амплифицировали при помощи ПЦР (21-24 цикла) с использованием того же прай мера и набора Encyclo PCR kit («Евроген») в при сутствии 1.5 М бетаина и 5% диметилсульфоксида по следующей схеме: 95oC, 30 c; 55oC, 30 c; 72oC, 90 c. Суббиблиотеки объединяли и очищали с помощью набора QIAquick PCR Purification Kit (Qiagen). ПЦР-амплификацию фрагментов M9, CDS и HBAD на матрице полученных библиотек прово дили с помощью набора Encyclo PCR kit («Евроген») в присутствии 1.5 М бетаина и 5% диметилсуль фоксида. Использовали следующие пары прай м е р о в : TCAGGAAGAAAGAATGGGAAA и C C T G C G T T T T A G C T G A T T G G д л я M 9 ; TCCCAGCACCTCGCAGTGCA и GCACAAGGCTCAAAGGTGAGACA для CDS; CCCAGACCAAGACCTACTTCC и GCTGAGGTTGTCCACGTTCTT для HBAD. Начиная с 24 цикла ПЦР, из реакционной смеси че рез каждые три цикла отбирали аликвоты по 2.5 мкл и анализировали их в 1% агарозном геле. Сдвиг электрофоретической подвижности (EMSA) Отобранные фрагменты 1-13 амплифицировали на матрице плазмидной ДНК, выделенной из соот ветствующих клонов ранжированной библиотеки, с помощью ПЦР (10 циклов - 94oC, 30 с; 60oC, 30 с; 72oC, 90 с) с использованием библиотечного прайме ра. Далее аликвоту реакционной смеси использовали для радиоактивного мечения в ходе ПЦР согласно [12]. Для сдвига электрофоретической подвижно сти ~5 нг (30000-50000 имп/мин) меченого фрагмен та ДНК смешивали с 1 мкг поли(dI-dC), 1-2 мкг (по белку) ядерного или цитоплазматического экстракта или 2 мкл раствора очищенного белка CTCF в 20 мкл конечного объема 12 мМ HEPES-KOH pH 7.9, 12% глицерин, 60 мМ KCl, 0.3 мМ EDTA, 0.6 мМ DTT. Для дополнительного сдвига электрофоретической подвижности добавляли 4.5 мкг антител против CTCF или 3 мкг моноклональных антител к полигистидину (Sigma, H1029). Смесь инкубировали в течение 20 мин при комнатной температуре, разделяли в 5-7.5% по лиакриламидном геле, приготовленном на 50 мМ трис-боратном буфере pH 8.3, 0.5 мМ EDTA, и радио автографировали в течение 16-40 ч. Двумерный сдвиг электрофоретической под вижности (2D-EMSA) проводили так, как описа но нами ранее [12] с небольшими модификациями. ПЦР-амплификацию проводили в присутствии 1.5 М бетаина и 5% диметилсульфоксида с использова нием набора Encyclo PCR kit («Евроген»). Для перво го раунда двумерного EMSA использовали 10 мкл белковой фракции, содержащей около 0.5 пмоль CTCF, для второго раунда - 1 мкл той же фрак ции. Полученную библиотеку CTCF-связывающих фрагментов ДНК клонировали в плазмиду pGEM-T (Promega) и ранжировали в 96-луночных планшетах. Секвенировали 230 клонов и картировали их на гено ме кур (сборка galGal4). Иммунопреципитация хроматина (ChIP) Иммунопреципитацию хроматина проводили в со ответствии с описанной ранее методикой [20]. Примерно 3 × 107 клеток на стадии экспоненциаль ного роста (для DT40 и HD3) либо собранных через 12 ч после начала индукции (для индуцированных HD3) фиксировали 1% по объему формальдегидом в 60 мл среды DMEM/F12 (1 : 1) в течение 8 мин. Клетки осаждали центрифугированием в течение 4 мин при 700 g и 4оС, промывали PBS, содержа щим 1 мМ AEBSF и 1 мкл/мл коктейля ингибиторов протеаз (Sigma, P8340), повторно осаждали, ресу спендировали в 200 мкл 50 мМ трис-HCl pH 8.0, 1 % SDS, 10 мМ EDTA и инкубировали в течение 10 мин на льду для лизиса. Далее клетки обрабатывали ультразвуком при помощи процессора Cole-Parmer CP750 (амплитуда 30%, 30 циклов по 3 с с интервалом 10 с). Обломки клеток удаляли в микроцентрифуге (10 мин, 13000 об/мин, 4оС), супернатант разводили в 10 раз 16.7 мМ трис-HCl pH 8.0, 16.7 мМ NaCl, 1.2 мМ EDTA, 1% Triton X-100, 0.01 % SDS, 1 мМ PMSF и 1 мкл/мл коктейля ингибиторов протеаз. На этой стадии отбирали аликвоту для входного контроля (input). Клеточный лизат очищали от неспецифиче ски связавшихся белков преинкубацией с белок-А агарозой (Invitrogen), а затем инкубировали с 2 мкг поликлональных антител к CTCF или контрольных кроличьих поликлональных антител к тауматину (предоставлены Е.А. Стукачевой) в течение ночи при 4оС и перемешивании. ДНК-белковые комплек сы собирали на белок-А-агарозе, промывали и элю ировали с носителя буфером для элюции (1 % SDS, 0.1 М NaHCO3, 2 раза по 15 мин) при комнатной тем пературе. Затем к раствору добавляли NaCl до 0.2 М, последовательно РНК-азу А и протеиназу К, и ин кубировали при 65оС в течение 4 ч для обращения сшивки. ДНК экстрагировали дважды смесью фе нол-хлороформ и осаждали этанолом в течение ночи при 4оС в присутствии 20 мкг гликогена в качестве носителя. Фрагменты ДНК собирали центрифугиро ванием, растворяли в воде и анализировали с исполь зованием количественной ПЦР в реальном времени при помощи амплификатора MX3000P (Stratagene) и реакционной смеси qPCRmix-HS SYBR («Евроген») в объеме 25 мкл в течение 40 циклов - 95oC, 30 с; 61-65°C (для разных праймеров), 30 с; 72°C, 60 с. Эффективность ПЦР рассчитывали при помощи про граммы LinRegPCR [21]. При проведении количественной ПЦР в ка честве положительного контроля использова ли фрагмент F1 сайленсера гена лизоцима кур [22] и фрагмент промоторной области гена MYC курицы [23]. Не связывающиеся с CTCF фраг мент энхансера из бета-глобинового локуса кур [8] и участок экзона гена альфа-D-глобина (HBAD) использовали в качестве отрицательного контро ля. Фрагменты ДНК амплифицировали на ма трице геномной ДНК кур со следующими прай мерами: CAGCACAGTTCTGGCTATGAAA и CCTCAGCTGGGGTCAATAAGT (сайленсер гена лизоцима); AAGCAGCGAGGAGCGCCCTTT и TACTACAAGGAGAGGTCGGAAGT (промо тор гена MYC); GGGCAGGTTGCAGATAAACA и TAACCCCCTCTCTTCCCTCA (энхансер из бета глобинового локуса); CCCAGACCAAGACCTACTTCC и GCTGAGGTTGTCCACGTTCTT (экзон гена HBAD) ; TGTGGTCATCCATGTCCTCAATC и G G A A G C T T T T T G C C A A G G A G A A для 10d1; GCTCTTCCTCACCCAGGTTTCT и CATCCAGCCCTCTCCAAACA ( 1 0 d 2 , 8 и 5d1); TGACCCATCTTGCAATGGATACT и G T T T G G G A A C T C T C T C T C C A T C C ( 1 0 d 3 ) ; ATAGGACTTCCCTGCTTCCATCT и G T T G G A G T G T T G T G G T C T T C T C C ( 5 d 2 ) ; GTGAGGAGAGGGCGAAGTTTATT и GCTCCCTGAGCTCCTCACCT ( 5 d 3 ) ; A T A A C T T G G C A C G C A A A C T A G C A и TTTGGAAAGTGCTGTGGGTAAAG (фраг мент 1); TTCTACACTTGTCCCTCCTTTTCA и CCTATTTTGTGGCTGCATTCTTC (фраг мент 2 ) ; GGAGCTCAGCAGGCAGAAACTA и GCTAAGGCAAAGGCTCTGTTGT (фраг мент 3 ) ; CTCTGCATTGCTGTGTGTGTTTT и ATGGTGGTTATCTCAGGGGTTTT (фрагмент 4) ; GGTACGTTCTCAGTGCCCAAAC и CCACCTGCAGACCTAACCTGTC (фраг мент 5 ) ; CAGCTCTTCTGGCTCATTTGTCT и ATCTCCCTTTCAGTCCCCTTCTC (фраг мент 6 ) ; TTTCACCCCAGAAGTTCATGCT и CCCAGTGTGGAAGCCATTTATC (фраг м е н т 7 ) ; CATGGGCAGCAAACACACAG и TCCATTTCCAGCGGTTCTTATC (фраг мент 9 ) ; AGGTAGGACTCAGCAGGGACAG и GGGACAAGTAGCTGGGACAAAA (фраг мент 10); CTGGAGATACCCATGGCAGAAC и TTTGTGGCCAACGTCAAACTAC (фраг м е н т 1 1 ) ; GGTTTGCCTTTCTTGCTCTG и ATGCCCATCTCACTTGCTCT ( ф р а г мент 12); CGTACCAGCACCAGACAAACAG и TCGACTGTTGAAGGAGGCATAA (фрагмент 13). Данные анализировали при помощи ресурсов ге номного браузера (UCSC Genome Browser, http:// genome.ucsc.edu) [24] и NCBI-BLAST (http://blast. ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi). РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Отбор CTCF-связывающих последовательностей при помощи 2D-EMSA Для получения библиотеки CTCF-связывающих последовательностей методом двумерного EMSA (2D-EMSA, см. [12]) искусственную бактериальную хромосому (BAC), содержащую вставку длиной 227366 п.н., полностью перекрывающую альфа-гло биновый локус кур и включающую обширные флан кирующие участки, исчерпывающе гидролизовали рестриктазой Sau3AI либо Csp6I. К полученным лип ким концам присоединяли синтетические адапторы, амплифицировали с помощью ПЦР, и оба гидроли зата смешивали в равных количествах. Полученную библиотеку коротких фрагментов (около 1000 фраг ментов со средней длиной ~500 п.н.) метили 32P и сме шивали с белковой фракцией, обогащенной полно размерным CTCF, экспрессированным в клетках COS-1 [17]. Реакционную смесь далее разделяли электрофоретически в неденатурирующем полиа криламидном геле (в первом направлении). Полосу с образцом вырезали, инкубировали в содержащем SDS буфере для разрушения ДНК-белковых ком плексов, и фрагменты ДНК разделяли в содержащем SDS геле (во втором направлении). Область, содер жащую большинство фрагментов, исходно связан ных с CTCF (обведена на рис. 1А), вырезали из геля, фрагменты ДНК элюировали и амплифицировали. Для повышения эффективности отбора процедуру повторяли. Специфичность отбора проверяли при помощи амплификации полученной и исходной библиотек с праймерами к последовательностям альфа-гло бинового локуса кур, связывающим CTCF согласно опубликованным данным: CDS (CTCF-зависимый сайленсер) [8] и M9 [7]. Последовательность экзона гена HBAD, не связывающую CTCF, использовали в качестве отрицательного контроля. Результаты ам плификации представлены на рис. 1Б. Как видно из рис. 1, после двух раундов отбора продукты ПЦР областей CDS и M9 становятся ви димыми после 24 и 27 циклов амплификации со ответственно, тогда как продукт контрольного, не связывающего CTCF участка гена HBAD, стано вится видимым лишь после 33 циклов. С учетом того, что все три фрагмента амплифицируются из ис ходной библиотеки с примерно равной эффектив ностью (см. исходную дорожку на рис. 1Б), можно грубо оценить, что обогащение конечной библиоте ки CTCF-связывающими фрагментами составляет ~64-512 раз. Фрагменты ДНК, полученные после второго ра унда отбора, клонировали в вектор pGEM-T, белые колонии (230) распределяли по 96-луночным план шетам и секвенировали их вставки. Из этих после довательностей 22 соответствовали фрагментам BAC, геномной ДНК Escherichia coli или химерным фрагментам, 208 принадлежали альфа-глобиновому локусу. Среди них выявлено 79 уникальных после довательностей. Построенная кривая разрежения (рис. 1В) указывает, что секвенирование произведено с глубиной, достаточной для идентификации боль шинства потенциальных CTCF-связывающих фраг ментов локуса. Десять отобранных фрагментов ДНК (1-4, 6-10, 13) использовали в качестве зондов для проверки методом сдвига и дополнительного сдвига электро форетической подвижности (EMSA, supershift) их способности связываться с CTCF. Два фрагмента (10 и 13) представлены на рис. 2. Все 10 фрагментов были способны связывать CTCF, что свидетельствует о вы сокой эффективности отбора. Распределение потенциальных участков связывания CTCF Все 208 секвенированных фрагментов были кар тированы на геноме кур (сборка galGal4, 2011 г.). Таблица с координатами всех картированных фраг ментов ДНК в формате bed доступна по запросу. Полная карта распределения фрагментов приведе на в верхней части рис. 3. Видно, что в локусе име ется ряд участков с повышенной эффективностью отбора (обозначены вертикальными стрелками), т.е. с повышенным сродством к CTCF в условиях EMSA. В нижней части рис. 3 приведена подробная часть карты, непосредственно включающая гены глоби нов, указаны положения генов (RefSeq), а также не которых идентифицированных ранее регуляторных элементов, в частности энхансера/сайленсера [25] и MRE (Major Regulatory Element, [2]). Показаны так же идентифицированные ранее в различных типах клеток и тканей участки ДНК, способные связывать CTCF: M9, C10-C14 [7] и участок CTCF-зависимого сайленсера [8]. Участки связывания CTCF 5d1-5d3 и 10d1-10d3 выявлены ранее методом ChIP-seq в пяти- и десятидневных эмбрионах кур соответ ственно [9]. Как видно из рис. 3, подавляющее большинство найденных ранее сайтов связывания CTCF совпада ет либо находится на очень небольшом расстоянии от участков с высокой эффективностью отбора, т.е. хорошо связывающихся с CTCF в условиях EMSA. Сайт связывания 10d1, расположенный за границей увеличенного участка карты, также совпадает по по ложению с участком повышенного сродства к CTCF. Отметим, что сайт связывания и место сшивки при иммунопреципитации хроматина могут не пол ностью совпадать из-за изгиба ДНК [26, 27], т.е. фраг менты, идентифицируемые по EMSA и ChIP, не обя зательно перекрываются, хотя и должны находиться на небольшом расстоянии друг от друга. Связывание CTCF в области альфа-глобиновых генов in vitro и in vivo Чтобы сравнить связывание CTCF с участками ДНК, обнаруживаемыми методом EMSA и выяв ляемыми в живой клетке методом ChIP, мы прове ли опыты по иммунопреципитации хроматина в 13 участках ДНК из области глобиновых генов, а так же в участках 5d1-5d3 и 10d1-10d3 [9] в трех типах клеток - линии эритробластов HD3, той же линии, индуцированной к терминальной эритроидной диф ференцировке (HD3-ind), и неэритроидной линии DT40 В-клеток кур. Положение амплифицированных при иммунопреципитации хроматина фрагментов ДНК приведено на рис. 3 (панель ChIP), а результаты иммунопреципитации на рис. 4. Из рис. 4 видно, что высокая степень занятости сайтов белком CTCF, близкая к занятости в поло жительном контроле (F1, MYC), характерна только для фрагмента 10, расположенного вблизи 3’-конца гена HBAA. Высокий уровень связывания CTCF на блюдается в клетках HD3 и индуцированных HD3, в клетках DT40 уровень связывания CTCF этим сай том значительно ниже. Показательно, что фрагмент 10 по положению совпадает с фрагментом этой об ласти генома с наиболее сильным связыванием CTCF in vitro (рис. 3). Кроме фрагмента 10, выделяется 5d3, степень свя зывания CTCF с которым уверенно выше значений отрицательного контроля для всех трех типов клеток, но существенно ниже, чем у фрагмента 10 в клетках HD3 и HD3-ind. Некоторое превышение над отрица тельным контролем наблюдается у фрагментов 4, 5, 9 и 10d3 только в клетках HD3-ind, но степень это го превышения невелика и не позволяет с уверен ностью утверждать, что эти фрагменты связывают CTCF. Таким образом, большинство фрагментов ДНК (17 из 18), связывающихся с очищенным белком CTCF в условиях EMSA, не связывают CTCF в клеточном ядре использованных типов клеток. Этот факт может объясняться следующими причинами. 1. Метилирование цитозина в составе динуклеоти да CpG в сайте нарушает связывание с ним CTCF [28, 29]. Однако лишь около 30% сайтов связывания CTCF содержат последовательность CpG [30], так что мети лированием ДНК в сайте CTCF полученные резуль таты можно объяснить лишь частично. 2. Связывание CTCF ограничено сайтами с подхо дящей структурой хроматина/модификациями гисто нов и/или наличием вблизи сайтов других факторов транскрипции, облегчающих связывание CTCF [31]. Скорее всего, в ограничении связывания CTCF определенную роль играют обе причины [32]. Очевидно, что некоторые из сайтов, связывания CTCF с которыми не обнаружено в наших экспери ментах по иммунопреципитации хроматина (рис. 4), могут связывать этот белок в других типах клеток и тканей. Так, фрагменты ДНК 5d1, 5d2, 10d1-10d3, не связывающие CTCF в клетках HD3 и DT40 (рис. 4), делают это в эритробластах эмбрионов кур [9]. Особняком стоит фрагмент 5d3, связывающийся с CTCF согласно результатам иммунопреципитации хроматина (рис. 4) и данным работы [9], но не со впадающий ни с одним из отобранных участков. Аналогично проявляет себя CTCF-связывающий фрагмент M9 [7], однако его присутствие в библиоте ке подтверждается ПЦР (рис. 1Б). Возможно, оба эти фрагмента ДНК не попали в число секвенированных. ЗАКЛЮЧЕНИЕ На основании проведенных экспериментов можно заключить, что эффективность связывания после довательности с CTCF в условиях EMSA (in vitro) и степень ее занятости белком CTCF связаны, по дан ным ChIP, односторонне - взаимодействие CTCF с участком ДНК in vitro по большей части не означа ет, что этот участок будет занят CTCF в ядре клетки. Связывание же CTCF in vivo, наоборот, чаще всего сопровождается непосредственным взаимодействием белка с данным участком ДНК in vitro. Кроме того, из полученных результатов видно, что при эритроидной дифференцировке не происхо дит существенных изменений в связывании CTCF с исследованными фрагментами ДНК. Единственный обнаруженный нами сайт, в высо кой степени связанный с CTCF в эритроидных клет ках HD3 и HD3-ind, существенно (в 2-3 раза) слабее связан с белком в лимфоидных клетках DT40, т.е. связывание CTCF с этим участком обнаруживает заметную тканевую специфичность. В то же время не выявлено значительных различий в связывании CTCF в линии клеток эритробластов HD3 и в клетках той же линии, стимулированных к эритроидной диф ференцировке.
Об авторах
E. С. Котова
Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН
Email: lev@ibch.ru
Россия
С. Б. Акопов
Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН
Email: lev@ibch.ru
Россия
Д. A. Дидыч
Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН
Email: lev@ibch.ru
Россия
Н. В. Петрова
Институт биологии гена РАН
Email: lev@ibch.ru
Россия
O. В. Яровая
Институт биологии гена РАН
Email: lev@ibch.ru
Россия
С. В. Разин
Институт биологии гена РАН
Email: lev@ibch.ru
Россия
Л. Г. Николаев
Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН
Автор, ответственный за переписку.
Email: lev@ibch.ru
Россия
Список литературы
- Razin S. V., Ulianov S. V., Ioudinkova E. S., Gushchanskaya E. S., Gavrilov A. A., Iarovaia O. V. // Biochemistry (Mosc). 2012, V.77, P.1409-1423
- Flint J., Tufarelli C., Peden J., Clark K., Daniels R.J., Hardison R., Miller W., Philipsen S., Tan-Un K.C., McMorrow T. // Human Molecular Genetics 2001, V.10, P.371-382
- Razin S.V., Rynditch A., Borunova V., Ioudinkova E., Smalko V., Scherrer K. // J. Cell Biochem. 2004, V.92, P.445-457
- Anguita E., Johnson C.A., Wood W.G., Turner B.M., Higgs D.R. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2001, V.98, P.12114-12119
- Holwerda S.J., de Laat W. // Philos. Trans. R. Soc. Lond. B Biol. Sci. 2013, V.368, 20120369
- Nikolaev L.G., Akopov S.B., Didych D.A., Sverdlov E.D. // Curr. Genomics. 2009, V.10, P.294-302
- Valadez-Graham V., Razin S.V., Recillas-Targa F. // Nucleic Acids Research 2004, V.32, P.1354-1362
- Klochkov D., Rincon-Arano H., Ioudinkova E.S., Valadez-Graham V., Gavrilov A., Recillas-Targa F., Razin S.V. // Mol. Cell Biol. 2006, V.26, P.1589-1597
- Martin D., Pantoja C., Fernandez Minan A., Valdes-Quezada C., Molto E., Matesanz F., Bogdanovic O., de la Calle-Mustienes E., Dominguez O., Taher L. // Nat. Struct. Mol. Biol. 2011, V.18, P.708-714
- Valdes-Quezada C., Arriaga-Canon C., Fonseca-Guzman Y., Guerrero G., Recillas-Targa F. // Epigenetics. 2013, V.8, P.827-838
- Chernov I.P., Akopov S.B., Nikolaev L.G., Sverdlov E.D. // Biotechniques. 2006, V.41, P.91-96
- Vetchinova A.S., Akopov S.B., Chernov I.P., Nikolaev L.G., Sverdlov E.D. // Anal. Biochem. 2006, V.354, P.85-93
- Beug H., von Kirchbach A., Doderlein G., Conscience J.F., Graf T. // Cell. 1979, V.18, P.375-390
- Nicolas R.H., Partington G., Major G.N., Smith B., Carne A.F., Huskisson N., Goodwin G. // Cell Growth Differ. 1991, V.2, P.129-135
- Orkin S.H., Harosi F.I., Leder P. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1975, V.72, P.98-102
- Gavrilov A.A., Razin S.V. // Nucleic Acids Research 2008, V.36, P.4629-4640
- Kotova E. S., Sorokina I. V., Akopov S. B., Nikolaev L. G., Sverdlov E. D. // Biochemistry (Mosc). 2013, V.78, P.879-883
- Gushchanskaya E.S., Artemov A.V., Ulyanov S.V., Logacheva M.D., Penin A.A., Kotova E.S., Akopov S.B., Nikolaev L.G., Iarovaia O.V., Sverdlov E.D. // Epigenetics. 2014, V.9, P.951-963
- Nikolaev L.G., Tsevegiyn T., Akopov S.B., Ashworth L.K., Sverdlov E.D. // Nucleic Acids Research 1996, V.24, P.1330-1336
- Orlando V. // Trends Biochem. Sci. 2000, V.25, P.99-104
- Ruijter J.M., Ramakers C., Hoogaars W.M., Karlen Y., Bakker O., van den Hoff M.J., Moorman A.F. // Nucleic Acids Research 2009, V.37, P.e45
- Kohne A.C., Baniahmad A., Renkawitz R. // J. Mol. Biol. 1993, V.232, P.747-755
- Filippova G.N., Fagerlie S., Klenova E.M., Myers C., Dehner Y., Goodwin G., Neiman P.E., Collins S.J., Lobanenkov V.V. // Mol. Cell Biol. 1996, V.16, P.2802-2813
- Meyer L.R., Zweig A.S., Hinrichs A.S., Karolchik D., Kuhn R.M., Wong M., Sloan C.A., Rosenbloom K.R., Roe G., Rhead B. // Nucleic Acids Research 2013, V.41, P.D64-D69
- Targa F.R., de Moura Gallo C.V., Huesca M., Scherrer K., Marcaud L. // Gene. 1993, V.129, P.229-237
- Arnold R., Burcin M., Kaiser B., Muller M., Renkawitz R. // Nucleic Acids Research 1996, V.24, P.2640-2647
- MacPherson M.J., Sadowski P.D. // BMC Mol. Biol. 2010, V.11, P.101
- Bell A.C., Felsenfeld G. // Nature 2000, V.405, P.482-485
- Hark A.T., Schoenherr C.J., Katz D.J., Ingram R.S., Levorse J.M., Tilghman S.M. // Nature 2000, V.405, P.486-489
- Nakahashi H., Kwon K.R., Resch W., Vian L., Dose M., Stavreva D., Hakim O., Pruett N., Nelson S., Yamane A. // Cell Rep. 2013, V.3, P.1678-1689
- // The ENCODE Project Consortium. // Nature 2012, V.489, P.57-74
- Teif V.B., Beshnova D.A., Vainshtein Y., Marth C., Mallm J.P., Hofer T., Rippe K. // Genome Res. 2014, V.24, P.1285-1295