Изучение функциональных и аллостерических сайтов в суперсемействах белков

Полный текст

ВВЕДЕНИЕ Изучение взаимосвязи структуры и функции бел ка - одна из актуальных задач современной био химии, сложность которой заключается в том, что сходство структуры не означает тождествен ности функций. При общей укладке полипептидной цепи белки могут обладать принципиально разными свойствами [1, 2], в то время как одну и ту же функ цию могут выполнять белки с различной структурой [3]. Специфические белок-белковые взаимодействия и распознавание низкомолекулярных соединений лежат в основе функционирования живых систем. Для понимания молекулярных механизмов этих про цессов и структурно-функциональных взаимосвя зей в белках необходимо изучать структурную орга низацию конкретных сайтов, ответственных за эти взаимодействия и связывание различных лигандов (субстратов, ингибиторов, эффекторов) [4]. Анализ карманов и полостей на поверхности глобул, форми рующих сайты связывания с уникальными свойства ми, и их функциональная классификация должны привести к более глубокому пониманию общих зако номерностей функционирования белков, предсказа ния функции новых ферментов, целенаправленного изменения свойств белков/ферментов дикого типа, а также дизайна лекарственных средств. В большинстве работ изучение свойств белков фо кусируется на анализе их функциональных сайтов - активных центров ферментов, каналов мембранных транспортных белков, ДНК- и белоксвязывающих участков различных регуляторных белков. Однако за последние годы накоплено множество свиде тельств явления аллостерии - регуляции функции белков посредством связывания низкомолекулярных эффекторов в регуляторных сайтах, топологически независимых от функциональных сайтов [5]. Эти све дения стимулируют интерес к изучению регуляции функции биологических макромолекул при связыва нии различных лигандов в аллостерических центрах. Созданы экспериментальные и компьютерные под ходы к поиску новых регуляторных центров в струк турах белков. Предпринимаются попытки понять взаимосвязь между функциональными и регулятор ными сайтами и изучить молекулярные механизмы взаимного влияния центров связывания, находя щихся на значительном расстоянии друг от друга [6]. Обнаружены низкомолекулярные ингибиторы, селективно связывающиеся в аллостерических сай тах ряда белков, ассоциированных с различными за болеваниями человека [7]. Однако особое внимание к этой теме связано не столько с уникальными осо бенностями функционирования конкретных белков, сколько с общей ролью этих процессов в регуляции живых систем. Есть основания полагать, что алло стерия представляет собой весьма универсальное явление, присущее большинству белков [8]. Интерес вызывает не только фундаментальное значение ал лостерии, но и возможность практического использо вания этого явления в биотехнологии и биомедицине. За последнее время показано, что белки и ферменты наряду с весьма хорошо известными функциональ ными сайтами (активными центрами) и аллостери ческими сайтами содержат значительное количество практически неизученных участков связывания. На рис. 1 представлена структура ДНК-зависимой РНК-полимеразы - ключевого фермента синтеза РНК во всех живых организмах [9, 10]. Поверхность этого крупного полисубъединичного фермента по крыта большим количеством полостей - потенциаль ных сайтов связывания. Среди них можно увидеть как активный центр, содержащий каталитические остатки и участок связывания ДНК, так и несколько известных аллостерических сайтов, способных свя зывать различные низкомолекулярные лиганды [11, 12]. При этом роль остальных участков связывания, а их большинство, остается неизвестной. Насколько важны эти сайты для функционирования фермента? Какие сайты связывания играют физиологическую роль, а какие можно приспособить для создания бел ка с новыми практически значимыми свойствами? Как оценить потенциал использования каждого от дельного сайта для регуляции функции? В данном обзоре обсуждается изучение структур но-функциональных взаимосвязей в белках на ос новании анализа различных сайтов связывания в их структурах. Рассмотрены экспериментальные и компьютерные подходы к поиску и изучению но вых центров связывания регуляторных лигандов, молекулярные механизмы аллостерии, а также вза имосвязь функции и регуляции в белках. Увеличение размеров публичных баз данных открывает доступ к новой информации о геномных последовательно стях, структуре и функции большого числа белков. В этой связи новые возможности предоставляют ме тоды биоинформатики, которые позволяют изучать свойства ферментов не по отдельности, а системно, в суперсемействах. Анализ структурной информа ции и экспериментальных данных о функциональ ных свойствах отдельных белков в их взаимосвязи с близкими, а также эволюционно удаленными гомо логами, должен позволить лучше понять структур но-функциональные взаимосвязи в белках/фермен тах и обнаружить новые механизмы регуляции их функциональных свойств. ЯВЛЕНИЕ АЛЛОСТЕРИИ Аллостерию принято определять как процесс ре гуляции функции белка путем связывания эф фектора - лиганда или другого белка - в сайте на поверхности структуры, который называют ал лостерическим центром [6]. В свою очередь, слово «аллостерический» происходит от греческих корней allos (другой) и stereos (твердый) и может быть пере ведено как «иная форма», чтобы подчеркнуть взаи мосвязь конформационных состояний между струк турно удаленными сайтами в белках [8]. Известно, что аллостерическая регуляция метаболизма важна для функционирования живых клеток, а аллосте рические эффекторы могут быть как ингибиторами, так и активаторами функции белков [13]. Исторически под аллостерией понимали коопе ративный эффект в полисубъединичных белках, функционирующих на уровне четвертичной струк туры. В 1965 году на основании 24 известных на тот момент случаев была сформулирована «согласован ная» модель аллостерии, называемая также моде лью MWC (по заглавным буквам фамилий авторов Monod-Wyman-Changeux) [14]. Скачкообразное уве личение сродства гемоглобина к кислороду по мере его насыщения, описываемое S-образной кривой, позволило предположить кооперативный эффект. Однако полученная в 1960 году с разрешением 5.5 Å структура гемоглобина показала, что молекулы гема, связывающие кислород, расположены на значитель ном расстоянии друг от друга в разных субъединицах белка (рис. 2) [15]. Это позволило сделать вывод о том, что в основе организации аллостерических белков лежит симметричное расположение субъединиц, причем существуют по меньшей мере два конфор мационных состояния каждой субъединицы - R (от англ. relaxed) и Т (от англ. tense), которые, в случае ге моглобина, характеризуются высоким и низким срод ством к кислороду соответственно. Переход от одной конформации к другой в результате связывания ли ганда происходит во всех субъединицах согласован но и таким образом, что олигомерный белок не суще ствует в гибридном состоянии (RT). Эта упрощенная модель позволила кинетически описать наблюдае мое увеличение сродства гемоглобина к кислороду по мере его насыщения [14]. Однако объяснить этот феномен на молекулярном уровне удалось только по сле проведения ряда структурных исследований [16, 17]. Стало понятно, что присоединение (отщепление) кислорода сопровождается значительными изменениями пространственной организации функциональ ного центра и разрывом (образованием) нескольких солевых мостиков, а возникающее при этом смеще ние субъединиц друг относительно друга приводит к тому, что эффект от связывания первой молеку лы кислорода распространяется на весь тетрамер. Таким образом, присоединение и отщепление одной молекулы кислорода в одной субъединице иницииру ет соответствующий процесс в остальных субъеди ницах, что делает гемоглобин эффективным перенос чиком кислорода по градиенту давления. Подобные кооперативные эффекты в гомоолигомерных белках/ ферментах - один из наиболее известных примеров аллостерии. В этом случае аллостерическим центром по отношению к активному центру одной субъеди ницы является активный центр другой субъедини цы, при этом связывание второй молекулы субстра та (или его аналога) приводит к аллостерическому влиянию на центр связывания первой молекулы субстрата и может не сопровождаться ее каталити ческим превращением. В соответствии с «последо вательной», или KNF-моделью (по заглавным бук вам фамилий авторов Koshland-Nemethy-Filmer) [18], субъединицы в рамках мультимера изменяют свою конформацию поочередно, т.е. связывание ли ганда меняет конформацию и свойства соответству ющей субъединицы, что, в свою очередь, способно влиять на ее соседей. Иными словами, связывание лигандов последовательно приводит к изменению конформаций субъединиц. Такая модель описыва ет отрицательную кооперативность, которая на блюдается, например, в глицеральдегид-3-фосфат дегидрогеназе при связывании кофермента NAD+, когда присоединение кофактора в активном центре одной субъединицы ослабляет его связывание в со седней вследствие перестройки внутри- и межсубъ единичных контактов [19, 20]. Наблюдаемое свойство способствует поддержанию активности фермента на постоянном уровне вне зависимости от концентра ции лиганда в среде. Хотя с целью выработки более общих закономерностей была предпринята попытка объединить модели MWC и KNF [21], дальнейшие ис следования показали, что молекулярные механизмы аллостерической регуляции сложны и разнообразны, и ни одна из предложенных моделей не описывает исчерпывающе явление аллостерии. В настоящее время можно считать общеприня тым, что аллостерической регуляции подвержены не только полисубъединичные, но и мономерные белки, а аллостерическими лигандами служат пре жде всего низкомолекулярные соединения, которые связываются в регуляторном центре, топографиче ски независимом от функционального центра. Кроме того, к аллостерическим эффектам стали относить регуляторное влияние, вызываемое белок-белковы ми взаимодействиями, фосфорилированием и даже точечными мутациями. Многообразие конкретных примеров аллостерической регуляции белков и фер ментов хорошо иллюстрирует ряд недавних статей [5, 7, 22]. Высказано предположение, что аллостерия может быть неотъемлемым свойством практически всех белков [8], исключение могут составить лишь структурные белки, жесткая конформация кото рых ограничивает их подвижность и возможности регуляции. Действительно, экспериментальные ис следования все чаще обнаруживают аллостерию в ферментах, которые раньше не считались алло стерическими. Фосфофруктокиназа, катализирую щая одну из ключевых стадий гликолиза, является примером белка со сложно организованной регуля цией, осуществляемой различными эффекторами. Аллостерия описана в ферментах этого суперсемей ства - прокариотических [23] и эукариотических, причем последние имеют значительно большие раз меры глобул вследствие дупликаций, вставок и му таций предкового прокариотического гена, которые способствовали появлению новых аллостерических центров [24]. В то же время свойства фосфофрук токиназы из миксомицета Dictyostelium discoideum отличаются от свойств ее гомологов, и этот белок не считается аллостерическим. Однако делеция од ного C-концевого остатка лейцина приводит к прояв лению у мутантного белка аллостерических свойств, присущих другим представителям суперсемейства [25]. В качестве другого примера можно привести пируваткиназу [26]. У млекопитающих известно че тыре изоформы этого фермента - L, R, M1 и M2. Все изоформы, за исключением М1, аллостерические и характеризуются положительной гомотропной ко оперативностью по отношению к субстрату, а также положительной гетеротропной кооперативностью по отношению к фруктозо-1,6-дифосфату. При этом изоформы M1 и M2 образуются в результате альтер нативного сплайсинга одного гена и отличаются на 23 аминокислотных остатка, локализованных в области межсубъединичных контактов, а также участвую щих в образовании центра связывания фруктозо-1,6-дифосфата. Внесение двух точечных мутаций в структуру изоформы M1, одной - в область меж субъединичного контакта [27], другой - в область центра связывания фруктозо-1,6-дифосфата [26], приводит к проявлению аллостерических свойств, характерных для других гомологов. Еще одним примером служит миоглобин, паралог1 гемоглоби на, существующий в виде трех основных конформационных состояний с разными каталитическими свойствами, так называемых таксономических под состояний, внутри которых могут выделяться до полнительные конформационные вариации [28]. Предполагается, что миоглобин способен аллостери чески контролировать протекание бимолекулярных реакций c двухатомными субстратами (например, NO и O2) за счет изменения геометрии консерватив ных полостей, примыкающих к активному центру. Интересно отметить, что во всех этих случаях алло стерическая регуляция обнаруживалась в белках, у гомологов которых это явление было описано ранее. Эти примеры говорят не только о широкой распро страненности аллостерической регуляции, но и об об щих механизмах этого явления в рамках суперсе мейств белков. Рассмотренные случаи указывают также на возможность тонкой настройки аллостерии за счет нескольких точечных мутаций, но при этом подчеркивают сложную взаимосвязь функции и ре гуляции. По современным представлениям структуру бел ка предлагается рассматривать в рамках сложных статистических ансамблей конформеров, которые, совершая локальные перегруппировки, находят ся в постоянном движении [6, 29]. В этом контексте аллостерический эффект обусловлен перераспре делением конформационных состояний [8]. Иными словами, связывание аллостерического эффектора приводит к популяционному сдвигу в сторону та ких конформационных состояний макромолекулы, которые значительно отличаются функционально от нативного [30]. В свою очередь, в традиционно не аллостерических белках альтернативные конформа ции центров связывания и функционально важные конформационные переходы на сегодняшний день могут быть неизвестны. Но это не означает, что нель зя подобрать лиганд или особые условия среды, спо собные вызвать конформационный сдвиг и проявить аллостерические свойства в неаллостерических белках. В принципе, практически любое вещество, связавшись на поверхности белка, может вызвать популяционный сдвиг его конформаций, вопрос со стоит лишь в эффективности такого сдвига и его влиянии на функцию [8]. Этот вопрос требует даль нейшего изучения на более широкой выборке бел ков. Однако конформационные изменения, связанные с аллостерической регуляцией, трудно выявить с по мощью современных экспериментальных методов. Разработанные в последнее время подходы биоин форматики и компьютерной биологии предоставляют новые возможности для решения этой задачи. ПОИСК ЦЕНТРОВ СВЯЗЫВАНИЯ В БЕЛКАХ Предсказание центров связывания в белках на ос новании информации об их структуре представляет собой новое направление в компьютерной биологии [31]. Для поиска полостей и карманов на поверхно сти структуры белков предложены разнообразные геометрические подходы, основанные на исполь зовании пространственных критериев (таблица). Поскольку в большинстве случаев программы по зволяют выявить несколько потенциальных сайтов, предпринимаются попытки их классифицировать с использованием различных геометрических па раметров - размера, глубины и ориентации [32-34], а также различных статистических оценок, учитывающих физико-химические свойства известных центров связывания лигандов [35, 36]. Альтернативу геометрическим методам представляют энергети ческие подходы, в которых предсказание и ранжи рование сайтов основано на расчете энергии свя зывания небольших органических молекул (проб) на поверхности белка [37, 38]. Все эти подходы, осно вываясь на структурной информации, способны бы стро и эффективно обнаружить полости и карманы потенциальных сайтов связывания, однако не дают представления об их функциональной значимости и структуре комплементарных лигандов. В процессе эволюции от общего предка одни свой ства белков сохраняются, в то время как другие претерпевают изменения в результате естествен ного отбора, что приводит к формированию функ ционального разнообразия. Так, гомологичные фер менты одного суперсемейства могут обладать общей структурной организацией и химизмом катализи руемой реакции, но отличаться по другим функци ональным свойствам (субстратная специфичность, энантио- и региоселективность, тип химического превращения), а также принципам их регуляции. Существенный рост публичных баз данных, содер жащих геномную и структурную информацию о бел ках/ферментах, позволяет проводить масштабный сравнительный анализ в рамках суперсемейств - со вокупностей как близких, так и эволюционно удален ных гомологов. Не все позиции в структуре белков одинаково подвержены изменчивости в процессе эволюции, что отражает различия в давлении отбо ра на остатки с разной функциональной ролью. Этот факт позволяет использовать биоинформатический анализ суперсемейств белков для поиска эволюци онных закономерностей, характерных для аминокис лотных остатков функциональных и регуляторных центров связывания [39] (таблица). Полностью кон сервативные позиции играют ключевую роль в функ ции, общей для всего суперсемейства, например, принимают участие в каталитическом механизме действия ферментов. Нужно отметить, что не всег да каталитические аминокислоты в суперсемействе полностью консервативны, кроме того, известны слу чаи миграции каталитических аминокислот в струк турах гомологичных белков [2, 40]. Так, например, нуклеофил каталитической триады α/β-гидролаз может быть представлен как серином, так и цисте ином или аспартатом, а каталитическая кислота может располагаться по меньшей мере в двух аль тернативных позициях основной полипептидной цепи. Тем не менее показано, что консервативность остатков в полостях на поверхности белков может служить критерием при аннотации функциональных центров [41-43], и это свойство может быть исполь зовано для характеристики широкого круга фер ментов [44-46]. Фактически, описание любого ново го белка с неизвестной функцией разумно начинать с его сравнительного анализа с ближайшими гомо логами и расчета консервативных позиций в колон ках множественного выравнивания. Роль наиболее консервативных остатков, обнаруженных при таком анализе, может быть проверена экспериментально посредством внесения точечных мутаций и оценке их влияния на каталитические свойства. Благодаря критерию консервативности предсказание функцио нальных центров в новом белке с неизвестной функ цией возможно даже при отсутствии данных о его трехмерной структуре при условии, что доступна аннотация функциональных центров в его гомоло гах. На сегодняшний день такая информация о до статочно большом числе белков из различных су персемейств собрана в публичных базах данных (см. следующую главу). Таким образом, комплексное ис пользование геометрических структурных подходов и биоинформатического анализа делает поиск функ циональных центров в белках более эффективным. Сравнительное исследование белков позволи ло сделать вывод о том, что аллостерические сайты характеризуются меньшим содержанием консерва тивных позиций и более высоким содержанием ва риабельных позиций [47]. Показано также, что му тагенез вариабельных позиций в аллостерических центрах приводит к изменению аллостерического эффекта, в то время как замена консервативных позиций в этих же центрах в основном приводит к потере каталитической функции. Эти результаты говорят о малой пригодности критерия консерватив ности при поиске регуляторных центров и свиде тельствуют о важной роли вариабельных позиций в связывании аллостерических лигандов и регуляции функциональных свойств в суперсемействах белков. В этом отношении особый интерес представляют специфические позиции подсемейств (СПП) - кон сервативные внутри функциональных подсемейств, но различающиеся между ними [48, 49]. Присутствие СПП характерно как для каталитических, так и ал лостерических сайтов и может быть эффективным критерием идентификации функциональных и ре гуляторных центров в структурах белков [39]. Поиск статистически значимых СПП может помочь понять разницу в строении участков связывания в родствен ных белках. Так, например, ДНК-зависимая РНК полимераза (РНКП) является ключевым ферментом транскрипции, который присутствует во всех живых системах. Каталитическая основа бактериального фермента состоит из субъединиц α2ββ’ω и харак теризуется высокой степенью сходства по струк туре и функции с гомологами всех известных организмов. Подтверждено, что бактериальная РНКП служит мишенью для противомикробных средств [12]. Рифампицин - антибиотик «первого эшелона» при туберкулезе - селективно ингибирует транс крипцию в Mycobacterium tuberculosis за счет вза имодействия с аллостерическим центром, располо женным в β-субъединице фермента. Взаимодействие ингибитора с бактериальным ферментом напря мую блокирует элонгацию в патогене, не затраги вая при этом родственный фермент человека [50]. Биоинформатический анализ суперсемейства РНКП показывает, что селективность связывания рифам пицина с ферментом бактерий обусловлена наличи ем специфических позиций подсемейств в соответ ствующем участке связывания, которые отличаются у прокариот и человека (рис. 3). Этот пример свиде тельствует о том, что изучение роли СПП в форми ровании сайтов связывания регуляторных лигандов позволяет лучше понять молекулярные механизмы специфического узнавания аллостерических эффек торов и закономерности функциональной регуляции в семействах белков. ПУБЛИЧНЫЕ БАЗЫ ДАННЫХ Возможность быстрого получения информации из открытых источников в сети Интернет являет ся важным фактором развития современной науки. В этом контексте особое место занимают публичные базы данных. База данных каталитических сайтов Catalytic Site Atlas (CSA) - один из основных источников инфор мации о ферментах [51]. В основе CSA лежат экспе риментальные данные о 1000 каталитически актив ных белков с разными свойствами, а методы поиска сходства по геномным последовательностям приме няются для того, чтобы с высокой степенью значимо сти аннотировать каталитические остатки в других белках на основании критерия консервативности. В результате использования методов биоинформа тики база данных CSA содержит данные об активных центрах нескольких десятков тысяч белков с извест ной структурой. Объем знаний об аллостерических белках не столь значителен, что, по всей видимости, связано с недо статком структурной информации и сложностями при определении аллостерических сайтов. Однако и в этой области достигнут значительный прогресс. Если 50 лет назад (когда была предложена первая модель кооперативности) были известны 24 алло стерических белка, то сегодня насчитываются сотни таких примеров. Недавнее создание публичной базы данных аллостерических центров Allosteric Database (ASD) стало первой попыткой обобщить массив со ответствующей опубликованной информации [52]. На сегодняшний день база ASD насчитывает почти 2000 сайтов, однако далеко не все сведения подкре плены кристаллографической информацией о струк туре белка в комплексе с эффектором, а некоторые аннотации и вовсе неоднозначны. Тем не менее мож но ожидать, что систематизация экспериментального материала о структуре и функции аллостерических центров будет продолжаться, в том числе и в рамках других публичных баз данных. ВЗАИМОСВЯЗЬ ФУНКЦИИ И РЕГУЛЯЦИИ Не вызывает сомнений тот факт, что конформаци онные изменения в структуре белка, обусловленные связыванием лиганда в аллостерическом центре, в конечном итоге приводят к изменению функцио нальных свойств. Однако не много известно о кон кретных молекулярных механизмах этого явле ния. Как объяснить кооперативность, наблюдаемую при связывании различных лигандов, и как предска зать взаимодействие между сайтами в белках, в ко торых аллостерия еще не описана? В последние годы предпринято несколько попыток понять взаимосвязь функции и регуляции [6]. В основе этих подходов лежат компьютерные методы поиска корреляций - структурных или эволюционных - между события ми, происходящими при связывании лигандов в то пологически независимых центрах на поверхности белков. Рассмотрим несколько таких примеров. Структурные изменения, возникающие при свя зывании лиганда, непосредственно связаны с кон формационной подвижностью белковой глобулы. Молекулярная динамика зарекомендовала себя как эффективный метод изучения структурных из менений в белках [53, 54], в том числе согласованных флуктуаций атомов, происходящих в результате коллективного движения [55]. Так, расчет матриц ко вариаций флуктуации атомов вдоль МД-траекторий был использован для изучения молекулярных меха низмов аллостерической регуляции белка-супрес сора опухолевого роста Хиппеля-Линдау (pVHL) [56]. pVHL в свободном состоянии нестабилен и су ществует в виде так называемой «расплавленной глобулы». Белок стабилизируется при взаимодей ствии с элонгинами С и В, которые вместе образу ют лигандраспознающий компонент для связывания фактора транскрипции HIF в составе ферментного комплекса убиквитинлигазы Е3 (рис. 4). С использо ванием МД показано, что интерфейс между двумя доменами α и β в pVHL представляет собой наиме нее стабильный участок белка. Были отобраны та кие аминокислотные остатки, подвижность которых вдоль МД-траекторий в наибольшей степени корре лирует с движением остатков из нестабильной меж доменной области pVHL. Молекулярное моделирование показало, что замена аминокислот в отобранных позициях на гомологичные остатки в аминокислот ной последовательности более стабильного pVHL из Caenorhabditis elegans приводит к значительной стабилизации pVHL из человека как в свободном со стоянии, так и в составе комплекса. При этом мута ции остатков в областях, топологически независи мых от центров связывания элонгина С и фактора транскрипции HIF, приводят к стабилизации ком плекса pVHL-элонгин С и снижению энергии связы вания HIF в pVHL. Авторы работы [56] делают вы вод, что стабильность и эффективность связывания в pVHL могут регулироваться аллостерически с по мощью лекарственных средств, мимикрирующих эффект внесенных мутаций. Другой пример свидетельствует о пользе поиска эволюционных корреляций с использованием стати стического анализа геномных последовательностей [57, 58]. Подход основан на предположении, что если два сайта в структуре белка функционально связа ны, то соответствующие аминокислотные остатки в гомологичных белках должны коэволюционировать в процессе развития от общего предка и эта корреля ция может быть выявлена с помощью статистическо го сравнения аминокислотных последовательностей. В таком случае корреляция встречаемости амино кислот в двух сайтах в структурах родственных бел ков может означать существование функциональной зависимости между ними. Описанный подход при менили для анализа мембранного белка FecA - пред ставителя семейства TonB-зависимых транспортных белков, функция которого заключается в перекач ке железа через внешнюю мембрану грамотрица тельных бактерий [59]. Ключевая стадия переноса железа - взаимодействие белка TonB, создающего протонный градиент, с консервативным N-концевым TonB-связывающим мотивом транспортного белка. Предполагалось, что это взаимодействие, протека ющее на периплазматической стороне мембраны, вызывает конформационные изменения, которые приводят к связыванию сидерофора1 на противо положной поверхности мембраны со стороны вне клеточного пространства и последующему импорту железа, однако конкретные механизмы этой аллосте рической коммуникации между двумя центрами свя зывания, расположенными в разных компартментах на значительном расстоянии друг от друга, остава лись неизвестными. Статистический анализ последо вательностей TonB-зависимых транспортных белков обнаружил рассеянную, но связную сеть коррели рующих остатков, которая обеспечивает функциональную коммуникацию между периплазматическим и внеклеточным сайтами связывания в FecA (рис. 5), а направленный мутагенез обнаруженных остатков, ни один из которых не участвует непосредственно в образовании центров связывания TonB и сидеро фора, привел к нарушению транспортной функции FecA. Основываясь на известных к этому моменту ре зультатах, можно сделать вывод, что поиск эволю ционных и структурных корреляций может служить важным инструментом изучения молекулярных ме ханизмов аллостерической регуляции в белках. ЦЕНТРЫ СВЯЗЫВАНИЯ В БИОТЕХНОЛОГИИ И БИОМЕДИЦИНЕ Сайты связывания субстратов/лигандов в фермен тах/белках активно изучаются с целью создания новых биокатализаторов для промышленного ис пользования (см., например, обзор [60]), а также ин гибиторов, используемых в качестве лекарственных средств человека [61, 62]. В каждом случае применя ют свои методы, однако в основе большинства успеш ных исследований лежит общий принцип, который можно назвать «стохастический анализ». Для дизайна белков с новыми свойствами предложены так на зываемые подходы «направленной эволюции» [63, 64]. Эти методы сочетают в себе случайный мутаге нез структуры белка, сопряженный с последующим скринингом для отбора наиболее предпочтительных фенотипов. Мутации вносят в структуру или опре деленную часть структуры белка произвольным образом, после чего эффект замен оценивают экс периментально и отбирают те из них, которые при водят к улучшению нужного свойства. В последние годы стохастические подходы стали более быстрыми и эффективными за счет использования различных методов статистического анализа и компьютерной биологии [65, 66]. Однако они по-прежнему требуют значительных ресурсов, экспериментального иссле дования больших библиотек мутантов, разработки эффективных методов скрининга и при этом способ ны изучить лишь очень небольшую часть возмож ных изменений в структуре белка. Эффективное применение методов случайной эволюции затруд нено высокой вероятностью отрицательных мутаций и низкой вероятностью проявления функционально полезных фенотипов. Аналогичным образом дизайн новых лекарственных средств в большинстве слу чаев основан на слепом экспериментальном скри нинге огромных библиотек низкомолекулярных со единений в качестве потенциальных ингибиторов белка-мишени [67, 68]. Хотя структуру такого слу чайно обнаруженного ингибитора далее можно опти мизировать с использованием экспериментальных и компьютерных подходов, это в целом чрезвычайно трудоемкий и малоэффективный подход. Так, ком пания GlaxoSmithKline за период с 1995 по 2001 год провела 70 высокопроизводительных эксперимен тальных скрининговых исследований (стоимостью около $1 млн каждый) белков-мишеней, отобранных из различных болезнетворных бактерий, с исполь зованием собственных коллекций потенциальных ингибиторов, содержащих 260000-530000 соеди нений. По результатам шестилетних исследований для дальнейших испытаний отобрали всего пять ли дерных компонентов с подтвержденными эффекта ми [69]. Обзор опубликованных данных показывает, что в период с 1996 по 2004 год подобные исследо вания проводились по крайней мере 34 различны ми компаниями на 60 мишенях и в целом считаются неудачными [70]. Высокие затраты на эксперимен тальные исследования в сочетании с низкой резуль тативностью эмпирического поиска предопределили значительное падение интереса к этой методологии. Несмотря на кажущуюся универсальность стоха стических подходов, они, как правило, направлены на изучение функциональных центров. В большин стве случаев с целью изменения каталитических свойств случайные мутации вносят в структуру активного центра фермента [71]. Аналогично, боль шинство разрабатываемых лекарственных средств связываются с функциональными центрами белков (см., например, [72]). Примеров практического ис пользования аллостерических сайтов значительно меньше. Так, показано, что введение единственной мутации в структуру глицеральдегид-3-фосфат дегидрогеназы приводит к разрушению солевого мостика вблизи активного центра и потере коопе ративности при связывании NAD+ [73]. При этом полученный препарат фермента характеризует ся двукратным увеличением удельной активности. Известны лекарственные средства, которые взаи модействуют с регуляторными сайтами белков. Так, рифампицины и миксопиранины связываются в по лостях субъединиц β и β’ РНКП, топологически не зависимых от активного центра, и прямо блокируют работу фермента [12]. Связывание ингибитора дорамапимода в аллостерическом центре p38 MAP киназы человека и сопутствующие этому процессу конформационные перестройки приводят к блоки ровке связывания АТР [74]. Ингибиторы обратной транскриптазы ВИЧ-1 эфавиренц, невирапин и де лавирдин связываются в аллостерическом сайте на значительном расстоянии от активного центра [75]. Обобщая имеющийся опыт, следует отметить, что благодаря более высокой вариабельности в рам ках суперсемейства аллостерические сайты мож но считать не менее привлекательными мишенями для селективного ингибирования, чем каталитиче ские [76]. Низкая эффективность стохастических методов стимулирует развитие компьютерных подходов к дизайну эффективных биокатализаторов и поис ку селективных ингибиторов ферментов. Показано, что биоинформатический анализ эволюционных взаимосвязей в функционально разнообразных су персемействах позволяет обнаруживать не только ключевые «горячие точки» в структурах ферментов, но и конкретные аминокислотные замены, внесение которых позволяет получать мутанты с улучшенны ми свойствами [54, 77-79]. Применение вычислитель ных подходов к дизайну белков подробно рассмо трено в недавних обзорах [80-82]. Секвенирование полных геномов основных бактериальных патоге нов, в том числе M. tuberculosis [83], положило на чало применению компьютерной геномики в меди цине. Использование геномных подходов позволяет не только составить список всех потенциальных бел ков-мишеней в конкретном организме, но и выявить наиболее перспективные объекты для последующего экспериментального исследования [84]. Важным пре имуществом такого постгеномного анализа принято считать возможность выбора мишени, которая встре чается во многих, либо, наоборот, всего в нескольких бактериальных геномах. Предполагалось, что таким путем можно создавать как лекарственные средства с широким спектром действия, так и высокоспеци фичные ингибиторы определенных патогенов. Кроме того, сравнительный анализ геномов бактерий и жи вотных позволяет исключать из списка возможных мишеней такие белки, гомологи которых есть в орга низме человека, что может позволить избежать ситу аций, когда созданный прототип токсичен не только для бактерий, но и для человека [85]. Однако, обоб щая, следует отметить, что используемые до по следнего времени постгеномные методы весьма поверхностно подходили к выбору мишеней, на ко торые действуют лекарственные средства. Так, на пример, предпочтительными мишенями при поиске новых антибиотиков считали белки, консервативные у бактерий и отсутствующие в организме челове ка. При этом не учитывали особенности структур ной организации этих белков, в том числе строение конкретных участков связывания потенциальных ингибиторов. Исключение из списка потенциаль ных мишеней белков патогенных микроорганизмов, гомологи которых есть у человека (в попытке избе жать токсичности ингибитора), в целом следует при знать малообоснованным. Важнейшие метаболиче ские пути, как правило, консервативны, и ключевые ферменты этих путей содержатся как в патогенных бактериях, так и в организме человека. В качестве примера можно привести уже упоминавшийся про тивотуберкулезный препарат рифампицин, который ингибирует репликацию бактерий, селективно свя зываясь с β-субъединицей РНКП, гомолог которой есть и в организме человека [50]. Подводя итог, можно отметить общую тенденцию отказа от малоэффективных стохастических подхо дов в пользу более рациональных и фокусированных стратегий. В этом контексте роль методов биоин форматики и молекулярного моделирования в био технологии и биомедицине продолжает неуклонно возрастать. Разработка новых подходов к система тическому анализу различных центров связывания в больших суперсемействах белков должна помочь, с одной стороны, установить взаимосвязь между структурой, функцией и регуляцией белков/фер ментов, и, с другой стороны, обнаружить участки связывания новых субстратов, а также ингибиторов/ эффекторов с ранее неизвестным механизмом дей ствия. ЗАКЛЮЧЕНИЕ Белок-белковые взаимодействия, а также взаимо действие белков (ферментов) с различными низкомо лекулярными соединениями являются важнейшими факторами регуляции их функциональных свойств. В настоящее время наиболее хорошо изучены моле кулярные механизмы действия лигандов, связыва ющихся в функциональных сайтах белков (актив ных центрах ферментов), в то время как механизмы аллостерического ингибирования или связывания в других малоизвестных сайтах в структурах бел ков изучены недостаточно. В этом контексте боль шой интерес представляют не только взаимодей ствие между функциональным и аллостерическим центрами, но также поиск и характеристика новых сайтов связывания, их роль в функционировании белка. Несмотря на первые шаги в сторону боль шего понимания взаимосвязи структуры, функции и регуляции, этот вопрос еще далек от разрешения и требует дальнейшего изучения. Анализ опубли кованных данных позволяет сделать вывод о том, что роль методов биоинформатики и молекулярного моделирования в изучении роли различных участков связывания в функционировании белка, в том числе аллостерических эффектов, будет неуклонно расти. Установление эволюционных взаимосвязей между различными сайтами связывания в рамках супер семейств белков, открытие новых функциональных, аллостерических и регуляторных сайтов с использо ванием вычислительных подходов должны улучшить наше понимание структурно-функциональных взаи мосвязей в белках и предоставить новые возможно сти как для создания новых лекарственных средств, так и для дизайна более эффективных биокатализа торов.

Об авторах

Д. А. Суплатов

Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, Научно-исследовательский институт физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского; Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова

Email: vytas@belozersky.msu.ru
Россия

В. К. Швядас

Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, Научно-исследовательский институт физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского; Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова

Автор, ответственный за переписку.
Email: vytas@belozersky.msu.ru
Россия

Список литературы

Дополнительные файлы