Снижение чувствительности миокарда к стимуляции мускариновых рецепторов третьего типа в постнатальном онтогенезе

Полный текст

ВВЕДЕНИЕ Парасимпатическая регуляция сердца чрезвычайно важна для его нормальной работы. Нейромедиатор ацетилхолин (АХ), выделяющийся из окончаний интрамуральных постганглионарных парасимпати ческих нейронов, является основным эффектором парасимпатической нервной системы. АХ действу ет на пейсмекерные и рабочие кардиомиоциты по средством мускариновых рецепторов второго под типа (М2-рецепторов), вызывая соответственно отрицательный хронотропный и инотропный эффект [1]. Однако в последнее время появилось множество свидетельств существования в миокарде млекопита ющих функционально активных холинорецепторов третьего типа (М3-рецепторов) [2-4]. В то время как М2-рецепторы сопряжены с Gi белками, а основные эффекты их стимуляции свя заны со снижением внутриклеточного уровня сAMP, М3-рецепторы сопряжены с Gq-белками, что обу славливает активацию фосфоинозитидного каскада внутриклеточной сигнализации при их стимуляции [1, 2]. При этом α-субъединица Gq-белка активирует фосфолипазу С, что в итоге приводит к повышению внутриклеточного уровня Са2+ и активации протеин киназы С, способной посредством фосфорилирования влиять на работу различных ионных каналов. С дру гой стороны, каналы, переносящие калиевый ток (IKM3), активируются, по всей видимости, в резуль тате прямого взаимодействия с субъединицами Gq белка [3, 5]. В результате стимуляция М3-рецепторов приводит к уменьшению длительности ПД, выра женному у взрослых крыс [6], мышей [4] и морских свинок [7] главным образом в предсердном миокарде. Помимо этого, М3-рецепторы опосредуют ряд эф фектов АХ, не связанных с электрической активно стью, в частности его антиапоптотическое действие на кардиомиоциты [8, 9]. Большинство работ, связанных с М3-рецепторами миокарда, ограничивалось лишь изучением их функций у взрослых животных, несмотря на то, что на ранних стадиях постнатального онтогенеза роль парасимпатической регуляции сердца в целом выше, чем у взрослых, в связи с недоразвитием или полным отсутствием симпатической иннервации миокарда [10] При этом результаты экспериментов на крысятах in vivo [11], а также предварительные данные нашей группы [12], полученные на миокар де новорожденных крысят, позволяют предполагать более высокую чувствительность миокарда к стиму ляции М3-рецепторов на ранних стадиях онтогенеза. В связи с этим в настоящей работы проведено срав нительное изучение электрофизиологических эф фектов избирательной стимуляции М3-рецепторов в предсердном и желудочковом миокарде новорож денных крысят (НК) первого дня жизни, крысят трехнедельного возраста (ТНК) и взрослых крыс возрастом 4 месяца (ВК). Электрофизиологические данные сопоставляли с результатами измерения экс прессии генов М3- и М2-рецепторов методом ПЦР в реальном времени (РВ-ПЦР). ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ В работе использовали четырехмесячных самцов белых беспородных крыс (n = 26) массой 300-350 г, ТНК массой 24-28 г (n =24, из пяти различных по метов) и НК массой 4.5-6 г (n = 25). Животных дека питировали, после чего быстро вскрывали грудную клетку, выделяли сердце и промывали раствором Тироде (состав в ммоль/л: NaCl 133.47; KCl 4.69; NaH2PO4·2H2O 1.35; NaHCO3 16.31; MgSO4·7H2O 1.18; CaCl2·2H2O 2.5; глюкоза 7.77), насыщенным карбо геном (газовая смесь 95% О2, 5% СО2). После этого из каждого сердца выделяли препарат ушка правого предсердия и препарат стенки правого желудочка. Каждый препарат закрепляли в экспериментальной камере объемом 3 мл (температура 38°С, скорость протока раствора 10 мл/мин) эндокардиальной сто роной вверх и стимулировали с помощью серебряных электродов с частотой 6 Гц (ВК и ТНК) или 4 Гц (НК). ПД регистрировали стандартным методом внутри клеточного отведения биоэлектрической активности с помощью стеклянных микроэлектродов сопро тивлением 25-50 МОм, подключенных к усилителю Neuroprobe-1600 (AM-Systems, США). Сигнал оциф ровывался на аналогово-цифровом преобразователе Е14-140 (L-Card, Россия) и записывался на компью тере с помощью программы Powergraph v. 3.3 (DiSoft, Россия). Обработку данных проводили в программе MiniAnalysis v. 3.0.1 (Synaptosoft, США). При анализе записей определяли длительность ПД на уровне 50 и 90% реполяризации (ДПД50 и ДПД90 соответствен но), а также амплитуду ПД и величину потенциала покоя. В электрофизиологических экспериментах ис пользовали четыре соединения: селективные блокаторы М1-, М2- и М3-рецепторов - пирен зепин, метоктрамин и 4-DAMP соответственно, а также агонист М-рецепторов пилокарпин, обла дающий небольшой специфичностью по отношению к М1- и М3-рецепторам по сравнению с М2- и М4 рецепторами. Все вещества заказаны в Sigma (США). Концентрации веществ выбраны на основе данных предыдущих исследований [4, 7]. На каждом препа рате не более 2 раз записывали эффект пилокарпина в норме или на фоне того или иного блокатора. Уровни экспрессии генов сравнивали методом РВ- ПЦР. Для этого использовали препараты ушка пра вого предсердия и стенки правого желудочка, полу ченные от НК, ТНК и ВК, способом, описанным выше. Препараты помещали в раствор для стабилизации РНК (IntactRNA, «Евроген», Россия) на 24 ч при 4°C, которые затем хранили при -20°C до момента вы деления РНК. РНК экстрагировали гуанидинтиоци анат-фенол-хлороформным методом (ExtractRNA, «Евроген», Россия). РНК от геномной ДНК очищали при помощи ДНКазы I (2 000 ед.акт./мл, NEB, США) в течение 60 мин при 37°C. Концентрацию РНК изме ряли при помощи спектрофотометра (Nanodrop 2000, ThermoScientific, США). Для синтеза кДНК суммар ную РНК, очищенную от геномной ДНК, подвергали реакции обратной транскрипции с использованием набора MMLVRTkit («Евроген», Россия). Все мани пуляции проводили в соответствии со стандартной методикой по протоколам, рекомендованным произ водителем. кДНК хранили при температуре -80°C до проведения РВ-ПЦР. РВ-ПЦР проводили на приборе BioRad с системой детекции CFX96 с использованием набора реактивов компании «Синтол» (Россия) и красителя EvaGreen (BIOTIUM, США). Использовали праймеры, синте зированные в ЗАО «Евроген» (5’-3’): M2-рецептор -TCTACACTGTGATTGGTTACTGGC (прямой), GCTTAACTGGGTAGGTCAGAGGT (обратный); M3-рецептор - СAAGTGGTCTTCATTGCCTTCT (прямой), GCCAGGCTTAAGAGGAAGTAGTT (об ратный); GAPDH -CAGCGATGCTTTACTTTCTGAA (прямой), GATGGCAACAATGTCCACTTT (обрат ный). Программа амплификации состояла из началь ной денатурации при 95°C, 5 мин; за которой следо вало 50 циклов ПЦР (1 мин при 95°C, 30 с при 60°C и 30 с при 72°C), а затем последний шаг - 72°C, 10 мин. Данные анализировали пороговым методом при по мощи программного обеспечения, поставляемого вместе с амплификатором. Результаты нормирова ли по количеству РНК, взятому в реакцию обратной транскрипции. Статистическую обработку результатов проводи ли в программе Statistica v. 6.0. При оценке статисти ческой значимости различий для связанных выборок использовали критерий Вилкоксона, для несвязан ных - критерий Манна-Уитни. Использование непа раметрических критериев было обусловлено малыми размерами выборок, не позволяющими гарантиро вать нормальность распределения. РЕЗУЛЬТАТЫ Для избирательной стимуляции М3-рецепторов в электрофизиологических экспериментах исполь зовали агонист мускариновых рецепторов пило карпин (10 мкМ), который подавали в эксперимен тальную камеру в присутствии высокоселективного блокатора М2-рецепторов метоктрамина (100 нМ). Чтобы исключить возможный эффект активации М1-рецепторов, в специальных предварительных экспериментах пилокарпин подавали в присутствии их селективного антагониста пирензепина (100 нМ). Поскольку никаких различий между выраженно стью эффектов пилокарпина на фоне метоктрами на и на фоне двух блокаторов обнаружено не было, что согласуется с ранними данными об отсутствии М1-рецепторов в кардиомиоцитах, то в дальнейшем для избирательной стимуляции М3-рецепторов пи локарпин подавали на фоне одного метоктрамина. Помимо регистрации эффектов стимуляции соб ственно М3-рецепторов, ставили контрольные экс перименты, в которых пилокарпин апплицировали в отсутствие блокаторов, чтобы выявить суммарный эффект активации М2- и М3-рецепторов в препара тах миокарда. Оказалось, что в отсутствие блокаторов пилокар пин вызывает ярко выраженное уменьшение дли тельности ПД как на уровне 50, так и на уровне 90% реполяризации в желудочковом (рис. 1, 2А,Б) и пред сердном (рис. 2В,Г) миокарде крыс всех трех возрас тов. Максимальный эффект пилокарпина развивался в течение 250-300 с от момента начала аппликации вещества, в дальнейшем мы будем обсуждать только максимальные значения эффектов пилокарпина. Эффект избирательной стимуляции М3-рецепторов во всех сериях опытов был качественно сходен с действием пилокарпина в отсутствие блокаторов, однако существенно слабее выражен. Тем не ме нее у НК и ВК наблюдалось статистически значи мое уменьшение ДПД50 и ДПД90 как в желудочко вом (рис. 1А,В, 2А,Б), так и в предсердном миокарде (рис. 2В,Г). Напротив, в группе ТНК значимый эф фект избирательной стимуляции М3-рецепторов отсутствовал (рис. 1Б, 2). Эффекты избирательной стимуляции М3-холинорецепторов практически не проявлялись на фоне селективного блокатора М3 рецепторов 4-DAMP (10 нМ), т.е. действительно были опосредованы активацией М3-рецепторов (рис. 2). Важно отметить, что в желудочковом миокарде НК эффект стимуляции М3-рецепторов более чем в 3 раза превосходил эффект у ВК (рис. 2А,Б), в то вре мя как в предсердном миокарде существенных раз личий в выраженности эффекта не наблюдалось. Таким образом, в желудочковом миокарде эффект М3-стимуляции был наиболее выражен у НК, а наи менее - у ТНК. В предсердном миокарде основное различие между тремя возрастными группами на блюдалось по реакции на пилокарпин, подаваемый без блокаторов, - выраженность эффекта растет по мере увеличения возраста животного и у ВК более чем в 2 раза превосходит эффект у НК. Согласно данным РВ-ПЦР, в миокарде живот ных всех возрастов синтезируется мРНК как М2-, так и М3-рецепторов, однако ген последних экспрес сируется гораздо слабее (рис. 3). При этом уровень экспрессии гена М3-рецептора снижается по мере взросления животного как в предсердном, так и в же лудочковом миокарде (рис. 3Б), т.е. в миокарде ТНК он выше, чем у ВК. Однако уровень экспрессии гена М2-рецептора был максимальным именно в группе ТНК. Поэтому отношение экспрессии М3 к М2 в же лудочковом миокарде у ВК выше, чем у ТНК - 0.59 против 0.19%. В предсердном миокарде отношение приблизительно одинаковое - 0.16 и 0.18% соответ ственно. ОБСУЖДЕНИЕ Итак, нами впервые получены сведения об изменении относительного вклада М3-рецепторов в регуляцию электрической активности желудочкового и пред сердного миокарда крыс в постнатальном онтогенезе. В электрофизиологических экспериментах изби рательную стимуляцию М3-рецепторов вызывали ранее неоднократно применявшимся способом [4, 7], а именно, аппликацией 10 мкМ пилокарпина на фоне полной блокады М2-рецепторов 100 нМ метоктра мина. Отметим, что в нашей ранней работе повыше ние концентрации метоктрамина не приводило к из менению эффектов пилокарпина, а, следовательно, наблюдаемый в присутствии 100 нМ пилокарпина эффект не связан с активацией остаточных М2 рецепторов. Это подтверждается также практиче ски полным исчезновением эффекта пилокарпина на фоне блокаторов М-рецепторов обоих типов, ме токтрамина и 4-DAMP. Электрофизиологические данные показывают, что степень воздействия стимуляции М3-рецепторов на электрическую активность желудочкового мио карда максимальна у НК. В предсердном миокар де чувствительность к пилокарпину в отсутствие блокаторов М-рецепторов увеличивается с возрас том, в то время как чувствительность к пилокар пину на фоне блокады М2-рецепторов одинакова у НК и ВК. Можно предположить, что как в пред сердном, так и в желудочковом миокарде вклад М2 рецепторов в регуляцию электрической активности увеличивается с возрастом, при этом в желудочко вом миокарде у НК М3-рецепторы занимают главен ствующее положение. Данные РВ-ПЦР в целом подтверждают эти предположения, поскольку показывают, что экс прессия гена М3-рецептора снижается с возрастом. Остается неясным, почему эффект стимуляции М3 рецепторов не наблюдается у ТНК. С одной стороны, это можно объяснить наименьшим отношением ко личества мРНК М3- к мРНК М2-рецепторов в этой возрастной группе. С другой стороны, относительный уровень трансляции белков М2- и М3-рецепторов может отличаться от уровня экспрессии мРНК соот ветствующих генов. ЗАКЛЮЧЕНИЕ В целом, результаты нашей работы позволяют предположить важную функциональную роль М3 рецепторов в желудочках новорожденных крысят, которая нивелируется у ВК. При этом функции М3 рецепторов не ограничиваются изученным нами воз действием на электрическую активность. Например, возможно участие М3-рецепторов в реализации кардиопротекторных воздействий АХ [8, 9] в усло виях окислительного стресса, испытываемого ор ганизмом новорожденного. Связь изменения роли М3-рецепторов с началом симпатической регуляции миокарда представляется маловероятной, посколь ку в трехнедельном возрасте перед включением симпатической регуляции эффект стимуляции М3 рецепторов уже отсутствует.

Об авторах

С. В. Тапилина

Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова; Российский национальный исследовательский медицинский университет им. Н.И. Пирогова МЗ РФ

Email: abram340@mail.ru
Россия

Д. В. Абрамочкин

Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова; Российский национальный исследовательский медицинский университет им. Н.И. Пирогова МЗ РФ

Автор, ответственный за переписку.
Email: abram340@mail.ru
Россия

Список литературы

Дополнительные файлы