Гибридный белок на основе второй субъединицы гемагглютинина вирусов гриппа A/H2N2 формирует перекрестный иммунитет

Полный текст

ВВЕДЕНИЕ Вируснейтрализующие антитела предотвращают инфекцию, блокируя прикрепление вируса гриппа к клеточной поверхности. Действие этих антител направлено, главным образом, на эпитопы первой иммунодоминантной высоковариабельной субъеди ницы гемагглютинина (НА1). Узкая специфичность нейтрализующих антител делает существующие вакцины неэффективными против дрейфовых вари антов вируса гриппа и против вновь появляющихся вирусов с пандемическим потенциалом. Т-клеточный иммунитет вносит существенный вклад в очищение организма от вируса и обеспечивает легкое течение инфекции, поэтому для достижения более полного контроля над гриппозной инфекцией желательно иметь вакцины, индуцирующие не только гумораль ный, но и Т-клеточный ответ. Разработка вакцин, основанных на консервативных антигенах, которые усиливают как гуморальный, так и клеточный ответ, является универсальной стратегией контроля эпиде мий и пандемий. Гемагглютинин вируса гриппа - белок, синтезиру емый в виде предшественника (НА0), который триме ризуется в эндоплазматическом ретикулуме и транс портируется на клеточную поверхность через аппарат Гольджи. Гемагглютинин (НА0) посттрансляционно разрезается хозяйскими протеазами на две субъе диницы - НА1 и НА2, которые остаются связанными одним дисульфидным мостиком [1]. В отличие от НА1, вторая субъединица гемагглютинина (НА2) относи тельно консервативна среди штаммов вируса и от вечает за слияние вирусной и клеточной мембраны в эндосомах, обеспечивая таким образом попадание рибонуклеинового комплекса в цитоплазму [2]. Иммунизация традиционными вакцинами и есте ственная гриппозная инфекция не приводят к об разованию значительного количества анти-НА2 антител, что связано с низкой иммуногенностью стеблевого участка НА2 в присутствии иммунодо минантных рецепторсвязывающих регионов НА1 [3]. Однако в последнее время выделен ряд моноклональ ных антител (от мышей, человека), которые реагиру ют с эпитопами, локализованными в стеблевой части НА. Это перекрестно реагирующие антитела, кото рые нейтрализуют подтипы вируса гриппа в преде лах филогенетической группы, обеспечивая, таким образом, широкий спектр защиты [4-11]. Моноклональные антитела, специфичные к реги онам НА2 1-38 (CF2), 125-175 (FE1), способны ин гибировать in vitro слияние вирусной и клеточной мембран. Внутривенное введение моноклональных антител CF2 и FE1 за 2 ч до заражения мышей Balb/c гомологичным и гетерологичным вирусами гриппа А/ H3N2 в дозе 1LD50 обеспечивало 100% выживаемость опытных животных [6]. Моноклональное антитело CR6261, специфичное к гидрофобному карману сте блевой части НА2, ингибировало рН-индуцируемое конформационное изменение НА вирусов гриппа H1N1, H5N1 и обладало нейтрализующей актив ностью [4, 5]. Показано, что моноклональное анти тело CR6261 взаимодействовало преимущественно с α-спиралью НА2, а также с соседними аминокис лотными остатками НА2 и НА1. Большинство амино кислот в малой α-спирали НА2, которые взаимодей ствуют с CR6261, у подтипов вирусов гриппа первой филогенетической группы идентичны более чем на 99% (различия в 1-5 аминокислотных остатках). Моноклональное антитело CR6261 предотвращало конформационный переход НА при низких значени ях рН, т.е. нейтрализовало вирус, стабилизируя на тивное состояние НА и предотвращая рН-зависимое слияние вирусной и клеточной мембран. Выделено анти-Н3N2-моноклональное антитело 12D1, которое взаимодействовало с высококонсервативной большой α-спиралью НА2 (остатки 76-106), обладало нейтра лизующей способностью и связывалось с вирусами гриппа подтипа H3N2, циркулировавшими с 1968 по 2003 г. [8]. В последние годы разработан ряд кандидатных вакцин на основе НА2 вирусов гриппа А фило генетической группы II [12-14]. Показана их им муногенность и эффективность в защите от за ражения летальными дозами гомологичного и гетерологичного вирусов одной филогенетической группы. Предполагается, что конструирование ан тигена, формирующего иммунный ответ на консер вативные эпитопы НА2, может служить основой для вакцины широкого спектра действия, обладаю щей профилактической и терапевтической эффек тивностью. Целью данной работы было моделирование и соз дание гибридного рекомбинантного белка, содержа щего перспективные Т- и В-клеточные эпитопы НА2 вирусов гриппа A/H2N2, изучение его иммуноген ности и протективного действия. В качестве основы гибридного белка выбран флагеллин - мукозаль ный адъювант, который усиливает иммунный ответ на присоединенные к нему антигены. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ Выбор консервативного участка НА2 вирусов гриппа А/H2N2 Поиск аминокислотных последовательностей для анализа проводили в базе данных GenBank, построение выравниваний осуществляли с ис пользованием программного обеспечения Vector NTI v10.0 (Invitrogen, США). Поиск вероятных Т-клеточных эпитопов осуществляли с использова нием NetCTLpan1.1 Server [15] и параметров поиска, установленных по умолчанию. Поиск эксперимен тальных B- и СD4+ T-клеточных эпитопов, гомо логичных участкам НА2, проводили в базе данных Immune Epitope Database [16]. Визуализацию трех мерной структуры белков выполняли в программе Chimera 1.5.3 [17]. Для гомологичного моделирования трехмерной структуры белка по первичной после довательности использовали открытый веб-ресурс Phyre2 [18]. Конструирование экспрессионных векторов и создание штаммов-продуцентов Escherichia coli Нуклеотидную последовательность, кодирующую ги бридный рекомбинантный белок FlgMH, оптимизиро вали для экспрессии в E. coli, синтезировали и встра ивали в вектор pQE30 по сайтам рестрикции BamHI и HindIII. Для создания белков Flg (флагеллин) и MH (фрагмент гемагглютинина) соответствующие нукле отидные последовательности амплифицировали с ис пользованием праймеров, несущих концевые сайты рестрикции BamHI и HindIII, и затем встраивали в поликлональный сайт вектора pQE30. Для получе ния штаммов-продуцентов рекомбинантных белков плазмидами pQE30/FlgMH, pQE30/MH, pQE30/Flg трансформировали клетки E. coli DLT1270. Штамм DLT1270, производное штамма DH10B [19], содержит ген репрессора лактозного оперона lacI, интегриро ванный в хромосому. Выделение и очистка рекомбинантных белков Штаммы E. coli DLT1270, трансформированные век торами pQE30/FlgMH, pQE30/Flg и pQE30/MH, на капливали в среде LB с ампициллином, экспрессию индуцировали добавлением 1 мM IPTG. Клетки об рабатывали лизоцимом, рекомбинантные белки очи щали из клеточного лизата с помощью металлоаф финной хроматографии на Ni-сорбенте. Электрофорез и иммуноблотинг Электрофорез в полиакриламидном геле (ЭФ в ПААГ) проводили в денатурирующих условиях по методу Лэммли [20]. Пробы смешивали с буфе ром для внесения, содержащим β-меркаптоэтанол, кипятили в течение 7 мин и наносили в градиентный 8-16% ПААГ. Электрофорез проводили в течение 1.5 ч при 10-12 мА. Гель фиксировали 10% уксусной кислотой и окрашивали Кумасси G-250 в течение 18 ч. Горизонтальный перенос белков из ПААГ на ни троцеллюлозную мембрану (BioRad, США) осущест вляли в TB-буфере (0.03 М глицин, 0.04 М трис, 0.037% додецилсульфат Na, 20% этанол) с использованием системы Mini Trans-Blot cell (BioRad, США) в ох лаждаемой камере при +4°С в течение 1.5 ч при по стоянном токе 200 мА. Затем мембрану блокировали в 3% растворе БСА (бычий сывороточный альбумин, Amresco, ЕС) в фосфатно-солевом буфере (ФБР) в те чение ночи при комнатной температуре. Мембрану инкубировали 1 ч при комнатной температуре с пер вичными антителами, разведенными в ФБР с 0.1% Твин 20 (ФБРТ) и 3% БСА, затем отмывали в ФБРТ. Флагеллин окрашивали кроличьими поликлональны ми антителами (Abcam, Великобритания) в разведе нии 1 : 16000. Для окрашивания фрагмента гемагглю тинина использовали кросс-специфичную сыворотку, полученную трехкратной последовательной иммуни зацией мышей сублетальными дозами вирусов грип па А филогенетической группы I (H2, H5 и H1pdm), в разведении 1 : 2000. Белки выявляли окрашиванием мембраны в течение 1 ч при комнатной температуре вторичными антителами, меченными пероксидазой хрена (козьи антикроличьи IgG либо козьи антимы шиные IgG, Invitrogen, США), в разведении 1 : 2000 и последующей инкубацией в течение 15 мин с суб стратом TMB (тетраметилбензидин) Immunoblot solution (Invitrogen, США). Иммунизация мышей Иммуногенность рекомбинантного белка FlgМН ис следовали на линейных мышах Ваlb/c и C57Bl/6 (самки, возраст 6-8 недель, масса 18-20 г), получен ных из питомника «Столбовая» ГУ научный центр биомедицинских технологий РАМН. Животных со держали в виварии ФГБУ «НИИ гриппа» Минздрава России в соответствии с действующими правилами. Мышей (16 особей) иммунизировали рекомбинант ным белком FlgMH интраназально (после ингаляци онной анестезии 2-3% изофлюран, 30% O2, 70% N2O) трехкратно с двухнедельным интервалом в дозе 10 мкг/мышь в объеме 50 мкл. Контрольной группе мы шей (16 особей) вводили рекомбинантный белок Flg интраназально трехкратно с двухнедельным интер валом в дозе 10 мкг/мышь. Получение сывороток и БАЛ Образцы крови получали от пяти мышей опытной и контрольной групп через 2 недели после послед ней иммунизации, после эвтаназии в CO2-камере (Vet Tech Solutions, Великобритания). Для получе ния сыворотки кровь инкубировали в течение 30 мин при температуре 37°С. После образования сгустков крови образцы помещали на поверхность льда и ох лаждали в течение 1 ч с последующим центрифу гированием в течение 15 мин при 400g. Аликвоты сыворотки крови (по 30 мкл) замораживали при тем пературе -20°С. Бронхоальвеолярные лаважи (БАЛ) получали от пяти мышей каждой группы через 2 недели после последней иммунизации после эвтаназии животных в CO2-камере. Труп животного фиксировали на опе рационном столике брюшком кверху. Производили разрез кожи по средней линии от нижней челюсти. В нижнюю часть трахеи в направлении легких вво дили катетер на глубину 3-5 мм. Дважды промывали бронхи и легкие 1 мл ФБР. БАЛ центрифугировали в течение 15 мин при 400g, отбирали аликвоты надо садка и замораживали их при температуре -20°С. Получение спленоцитов мыши Спленоциты мыши получали в соответствии с прото колом BD PharmingenTM. На 14-й день после послед ней иммунизации мышей опытной и контрольной групп (по три мыши из каждой группы) подвергали эвтаназии с помощью CO2-камеры. Селезенки мы шей извлекали асептически, гомогенизировали с ис пользованием Medimachine (BD Biosciences, США) и избавлялись от дебриса путем фильтрации че рез шприцевые фильтры с диаметром пор 70 мкм (Syringe filcons, BD Biosciences, США). Эритроциты лизировали ACK-буфером (0.15 M NH4Cl, 1.0 М KHCO3, 0.1 мМ Na2EDTA, pH 7.2-7.4), спленоциты от мывали полной средой RPMI-1640 с 10% ЭТС, 2 мМ L-глутамина, 100 ед/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина. Жизнеспособность клеток оценива ли окрашиванием 0.4% раствором трипанового синего. Концентрацию клеток доводили до 2 × 106 кл/мл. Синтетические пептиды Иммуногенность рекомбинантных белков оценивали с использованием следующих синтетических пепти дов, синтезированных НПО «Верта»: G-47 (24 аминокислоты): AADKESTQKAFDGITNKVNSVIEK - малая α-спираль НА2 (35-58); G-48 (15 аминокислот): MNTQFEAVGKEFSNL - «расплетенный» в нативном неактивированном ге магглютинине «линкерный» участок НА2 (59-72); G-49 (34 аминокислоты): ERRLENLNKKMEDGFLDVWTYNAELLVLMENERT - часть большой α-спирали НА2 (73-107). Иммуноферментный анализ ИФА проводили общепринятым методом. 96-луноч ные планшеты с высокой сорбционной способностью (Greiner, Германия) покрывали рекомбинантным белком FlgMH в концентрации 5 мкг/мл или очи щенными вирусами А/Singapore/1/57 (H2N2), A/PR/8/34 (H1N1), A/Aichi/2/68 (H3N2), A/ Kurgan/05/2005/RG (H5N1) в концентрации 2 мкг/мл, сорбцию проводили в ФБР рН 7.2 в течение ночи при 40С. После сорбции вирусов часть планше тов заливали на 30 мин цитратным буфером (рН 5.0), затем 1 раз отмывали ФБР. Планшеты обрабатывали блокирующим буфером (0.01 М ФБР, pH 7.2 с 5% ЭТС) в течение 1 ч при комнатной температуре, отмывали 3 раза ФБРТ. В лунки планшетов добавляли 100 мкл двукратных разведений сывороток (начиная с 1 : 400) в блокирующем буфере, инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре. Использовали конъюга ты козьих поликлональных антимышиных IgG, IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3, IgA (Abcam, Великобритания) с пероксидазой хрена в разведении 1 : 20000. В ка честве субстрата использовали ТМБ (BD Bioscience, США), инкубация 15 мин. Оптическую плотность (ОП) измеряли с использованием микропланшетно го ридера i-Mark (Bio-Rad) при длине волны 450 нм. За титр принимали наибольшее разведение сыво ротки, которое дает оптическую плотность, по край ней мере, в 2 раза большую, чем среднее значение бланка. Проточная цитометрия Мультипараметрическую проточную цитоме трию выполняли в соответствии с протоколом BD PharmingenTM. Определяли способность синтети ческих пептидов G-47, G-48, G-49 и вируса гриппа A/Singapore/1/57 (H2N2) активировать продукцию ИФН-γ специфическими CD8+ Т-лимфоцитами в се лезенке. Спленоциты мышей Ваlb/c и C57Bl/6 по лучали на 14-й день после последней иммунизации, 2 × 106 спленоцитов мышей опытных и контроль ных групп стимулировали (в течение 6 ч при 370C) 10 мкг пептидов G-47, G-48, G-49 или 1 мкг вируса A/Singapore/1/57 (H2N2) в присутствии брефел дина А (1 мкг/мл) (BD Bioscience, США). Клетки отмывали, Fc-рецепторы блокировали антителами CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block, BD Pharmingen, США) и окрашивали флуоресцентно меченны ми антителами анти-CD3а-FITC, анти-CD8-PerCP (BD Pharmingen, США) при 4°C в течение 30 мин. Затем клетки пермеабилизировали в соответствии с протоколом тест-системы Cytofix/Cytoperm Plus (BD Bioscience, США) и окрашивали флуоресцент но меченными антителами анти-ИФНγ-PE (BD Pharmingen, США). Интенсивность флуоресценции измеряли на проточном цитофлуориметре BD FACS Canto II (Becton Dickinson, США). Результаты анали зировали с использованием программного обеспече ния BD FACS Diva версия 6.1.3 (BD Bioscience, США). Вирусы и заражение мышей В работе использованы штаммы, полученные из Коллекции вирусов гриппа и ОРЗ лаборато рии эволюционной изменчивости вирусов грип па ФГБУ «НИИ гриппа» Минздрава России - А/ Singapore/1/57 (H2N2), A/PR/8/34 (H1N1), A/ Aichi/2/68 (H3N2) и A/Kurgan/05/2005/RG (H5N1). В экспериментах с летальным заражением исполь зовали адаптированный к репродукции в легких мышей вариант вируса гриппа А/Singapore/1/57 (H2N2), полученный в лаборатории гриппозных вак цин ФГБУ «НИИ гриппа» Минздрава России. Вирусы накапливали в 10-12-дневных развивающихся кури ных эмбрионах и очищали методом ультрацентрифу гирования в градиенте сахарозы. Иммунизированных мышей (по 11 мышей в опыт ной и контрольной группах) заражали адаптирован ным к мышам вирусом гриппа A/Singapore/1/57 (H2N2) в дозе 2LD50. Вирус вводили интраназально в объеме 50 мкл/мышь после ингаляционной анесте зии (2-3% изофлюран, 30% O2, 70% N2O). После за ражения проводили ежедневное наблюдение за жи вотными. Протективное действие FlgMH оценивали по двум параметрам: динамика падения массы тела и выживаемость мышей после заражения. Статистическая обработка Статистическую обработку данных проводили в программе GraphPad Prizm v5.1. Статистическую значимость различий титров антител оценивали с использованием непараметрического критерия Манна-Уитни. Сравнение показателей выживаемо сти проводили с использованием критерия Мантела- Кокса. Различия считали значимыми при р < 0.05. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Выбор и построение MH-фрагмента консенсусной последовательности НА2 вирусов гриппа A/H2N2 По результатам выравнивания консенсусных по следовательностей НА2 найдены два протяженных высококонсервативных участка: (1-24) и (89-104) (рис. 1А). Идентичность на первом участке состав ляет 78.3%, однако он содержит высокогидрофоб ный пептид слияния НА, склонный к образованию агрегатов. Несмотря на то что консервативность второго участка меньше (62.5%), большинство ами нокислотных замен не сопряжено с изменением физико-химических свойств боковых радикалов, что позволяет надеяться на небольшое изменение способности к презентации на определенных аллелях HLA. Кроме того, консервативная последователь ность YNAELLVL, входящая в данный участок, обна руживается в большой части B- и CD4+ T-эпитопов в НА2 (рис. 2А). Наиболее отличаются от консенсу са последовательности Н3 и Н7 (филогенетическая группа II), при исключении которых идентичность на участке повышается до 87.5%. Для конструирова ния целевого гибридного рекомбинантного белка был выбран фрагмент консенсусной последовательности НА2 вирусов гриппа человека А/Н2N2 (филогенети ческая группа I). В состав гибридного белка была включена кон сервативная область НА2 (89-104), а также малая α-спираль НА2 (35-58), выступающая на поверх ность триммера, и потенциально доступная для свя зывания антителами (рис. 1Б). Для сохранения тре тичной структуры в состав гибридного белка FlgMH включен непрерывный фрагмент НА2 (35-107). Фрагмент НА2 (35-107) вирусов гриппа H2 чело века обладает наибольшей однородностью по ами нокислотному составу. Наиболее вариабельной ами нокислотой (встречаемость 58.3%) является аргинин (R) в положении 75 (позиция 415 в нумерации НА0), при этом в 41.7% в данном положении находится ли зин (K). Обе аминокислоты положительно заряжены, боковой радикал аргинина крупнее и, следовательно, предпочтительнее для провокации гуморального им мунного ответа (рис. 1В). Кроме того, последовательность НА2 (35-107) со держит участки, гомологичные экспериментальным В- и CD4+ T-клеточным эпитопам, представленным в базе данных IEDB (рис. 2А). Теоретический поиск показал наличие множественных потенциальных CD8+ Т-клеточных эпитопов в составе фрагмента НА2 (35-107) для репрезентативного набора алле лей (рис. 2Б). Дизайн гибридного рекомбинантного белка FlgMH Химерный белок конструировали с использовани ем коммерческой плазмиды pQE30, содержащей перед сайтом клонирования старт-кодон и гистиди новый таг. Гибридный белок FlgMH включал полно размерную последовательность флагеллина (FliC) без старт-кодона и целевую последовательность MH, кодируемые одной рамкой считывания с гистидино вым тагом (рис. 3А). Таким образом, рекомбинантный белок FlgMH состоял из флагеллина, к N-концу ко торого присоединен гистидиновый таг, а к С-концу - участок (35-107) консенсусной последовательности НА2 вирусов гриппа человека А/Н2N2. Гомологичное моделирование трехмерной структуры FlgMH пока зало сохранение α-спирализации в участках MH, со ответствующих фрагментам (38-56) и (75-107) в со ставе HA2 (рис. 3Б), из чего можно предположить, что бóльшая часть нативной структуры сохранена, и гибридный белок будет стимулировать образова ние антител, в том числе к структурным эпитопам, характерным для нативного НА. Получение и очистка рекомбинантных белков Нуклеотидные последовательности, кодирующие гибридный белок FlgMH, а также его компоненты Flg и MH были клонированы в вектор pQE30 и экс прессированы в штамме E. coli DLT1270 (рис. 4А). Теоретическая молекулярная масса белков со ставляла соответственно FlgMH - 61.3, Flg - 52.9, MH - 9.8 кДа, что совпадало с их электрофоре тической подвижностью в ПААГ (рис. 4Б). Белки FlgMH и Flg были хорошо растворимы в ФБР, в от личие от белка MH, который накапливался в тель цах включения и растворялся только в 2 М мочевине. Очищенные белки FlgMH и Flg взаимодействовали в Вестерн-блотинге с кроличьей поликлональной сы вороткой к флагеллину, а белки FlgMH и MH - с мы шиной кросс-специфичной сывороткой против НА вирусов гриппа филогенетической группы I (рис. 4Б). Иммуногенность и протективность рекомбинантного белка FlgMH Консенсусная последовательность НА2 (35-107), входящая в состав белка FlgMH, включает в себя В-, CD4+ и CD8+ Т-клеточные эпитопы, поэтому мы оценивали способность рекомбинантного белка FlgMH стимулировать как В-, так и Т-клеточный им мунный ответ. Для исследования способности рекомбинантно го белка FlgMH индуцировать образование НА2 специфических антител мышей Balb/c иммунизи ровали трехкратно интраназально белком FlgMH без адъюванта, контрольной группе мышей вводи ли белок Flg. Интраназальный путь введения анти гена индуцирует формирование как системного, так и местного иммунного ответа. Поэтому на 14-е сутки после последней иммунизации мы определя ли содержание IgA в сыворотке и БАЛ к целевому антигену, а также титры антител в сыворотке к ви русам гриппа первой и второй филогенетических групп, а также оценивали профиль подклассов IgG (IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3). Местный ответ об условлен секреторным sIgA, мультимерная форма которого обладает эффективной антивирусной ак тивностью, блокируя вирусную репликацию [21, 22]. Интраназальная иммунизация мышей рекомбинант ным белком FlgMH стимулировала формирование высокого уровня анти-НА2 IgA в сыворотке и БАЛ иммунизированных животных (рис. 5А). Известно, что тип иммунного ответа на флагеллин и рекомбинантные белки на его основе определяется формой флагеллина. Растворимый флагеллин (моно мерный и полимерный) индуцирует иммунный от вет, специфичный к флагеллину и введенному с ним целевому антигену с сильным преобладанием ответа Тh2-типа [23-29]. Тогда как закрепленная в мембра не форма флагеллина вызывает преимущественно иммунный ответ Тh1-типа [24, 28]. С другой сторо ны, показано, что тип иммунного ответа на целевой антиген зависит также от антигена, слитого с фла геллином [23]. Как показано на рис. 5Б, иммунизация растворимым рекомбинантным белком FlgMH при водила к индукции практически одинакового уров ня IgG1 (тип ответа Тh2), IgG2a и IgG2b (тип отве та Тh1) НА2-специфических антител: IgG1 - 40.0%, IgG2a - 30.3%, IgG2b - 26.4%, IgG3 - 3.3%. Отсутствие существенных различий подклассов IgG (IgG1, IgG2a, IgG2b) к целевому антигену после иммуниза ции мышей рекомбинантным белком FlgMH предпо лагает формирование смешанного Тh1 и Тh2 иммун ного ответа. Выбранная консенсусная последовательность НА2 (35-107) достаточно консервативна у вирусов гриппа первой филогенетической группы (87.5% гомологии), поэтому представлялось важным оценить форми рование кросс-реактивных антител после иммуни зации мышей белком FlgMH. По результатам ИФА НА2-специфические IgG, индуцируемые рекомби нантным белком FlgMH, связывались не только с ви русом гриппа субтипа A/H2N2 (среднегеометриче ский титр, СГТ = 12800), но и с другими подтипами вируса гриппа А первой филогенетической группы: Н1 (СГТ = 4160) и H5 (СГТ = 2880) (рис. 5В). Однако титры антител к вирусам гриппа подтипов H1 и Н5 были значимо ниже, чем к подтипу Н2 (р < 0.05, кри терий Манна-Уитни). Кроме того, индуцируемые ан титела связывались с гемагглютинином в нативной конформации (рН 7.2) и с кислой формой гемагглюти нина (рН 5.0) с одинаковой интенсивностью (рис. 5В), что свидетельствует о доступности целевой последо вательности НА2 на поверхности вириона для анти тел. Способность рекомбинантного белка FlgMH ин дуцировать клеточный ответ определяли по про дукции ИФН-γ CD3+CD8+ Т-лимфоцитами се лезенки после рестимуляции синтетическими пептидами (G-47, G-48, G-49), соответствующими целевой последовательности НА2 и очищенным ви русом гриппа A/H2N2. Показано, что число акти вированных ИФН-γ секретирующих CD3+CD8+ Т-клеток как у мышей линии Balb/c (гаплотип H-2d), так и у мышей линии C57Bl/6 (гаплотип H-2b), имму низированных рекомбинантным белком FlgMH, было статистически значимо выше (р < 0.05, критерий Манна-Уитни), чем у мышей, иммунизированных белком-носителем флагеллином (рис. 6А,Б). Флагеллин обеспечивает антигенспецифический CD4+ Т-клеточный ответ [30] через активацию TLR5, экспрессируемых на клетках CD11c+ [31], что при водит к сильному гуморальному ответу. Однако спо собность флагеллина стимулировать специфический CD8+ Т-клеточный ответ остается неясной. В ряде работ показано, что иммунизация мышей слитым белком (флагеллин-GFP, флагеллин-ОVA) стиму лирует CD8+ ответ на антиген, в отличие от имму низации только антигеном без флагеллина [26, 32]. С другой стороны, установлено, что растворимый флагеллин, слитый с антигеном, преимущественно индуцирует Тh2-ответ и не формирует антигенспе цифических клеток CD8+ [23-36]. Для презентации в MHC-комплексе экзогенный антиген подвергается протеолитическому расщеплению, перед которым он должен быть развернут [33]. Восстановление дис ульфидных связей внутри белка является ключевым моментом в процессе развертывания [34], и кросс презентация дендритными клетками антигена, со держащего дисульфидные мостики, зависит от экс прессии тиоловых редуктаз, индуцируемой ИФН-γ [35]. Показано [36], что слияние MНC I ограниченных иммуногенных эпитопов с флагеллином может соз дать псевдоадъювантный эффект, который функ ционирует через усиление презентации антигена на поверхности клетки и не зависит от TLR5, MyD88 и консервативных регионов флагеллина. Это обу словлено более эффективным процессингом антиге на, слитого с флагеллином, чем антигена в нативном состоянии, т.е. антиген, а не сигнал TLR5 является лимитирующим фактором при формировании CD8+ Т-клеточного ответа. Таким образом, флагеллин мо жет быть платформой для вакцин, которые содержат слабопроцессирующиеся антигены, несущие CD8+ эпитопы [36]. Нами установлено, что растворимая форма фла геллина, слитого с последовательностью НА235-107, содержащей CD8+ эпитопы, стимулирует формиро вание НА2-специфических CD8+ Т-клеток. Способность рекомбинантного белка FlgMH защи щать мышей показана при заражении иммунизиро ванных животных летальной дозой (2LD50) адапти рованного вируса гриппа A/Singapore/1/57 (H2N2). Иммунизация приводила к различию в динамике массы тела опытных и контрольных мышей, у имму низированных мышей максимальная потеря массы тела составила 10%, у контрольных - 16.6% (рис. 7А). Иммунизация рекомбинантным белком FlgMH защи щала мышей от заражения (рис. 7Б). Выживаемость в опытной группе составила 91.0%, в отличие от кон трольной группы - 41%. Полученные различия были статистически значимыми (р = 0.0184, критерий Мантела-Кокса). ВЫВОДЫ Консервативные участки второй субъединицы НА представляют интерес для дизайна вакцинных кон струкций, способных обеспечить иммунитет ши рокого спектра действия против вирусов гриппа А. Гибридный рекомбинантный белок FlgMH на основе флагеллина и высококонсервативного фрагмента ге магглютинина НА2 (35-107) вирусов гриппа подти па A/H2N2 содержит потенциальные В-клеточные, а также CD4+ и CD8+ Т-клеточные эпитопы и со четает адъювантную активность флагеллина, обу словленную его специфическим связыванием с TLR5, и консервативность участка стеблевой части молеку лы гемагглютинина, которая участвует в конформа ционных изменениях, ведущих к слиянию бислойных липидных мембран вируса и клетки-хозяина в про цессе pH-индуцированной реакции слияния. Целевая последовательность, включающая малую α-спираль, фрагмент большой α-спирали и соединяющий их участок, входит в состав второй цепи гемагглютинина и отличается очень высокой стабильностью амино кислотного состава в рамках подтипа. Рекомбинантный белок FlgMH стимулирует фор мирование смешанного Тh1/Th2-ответа на целевую последовательность, а также кросс-реагирующих антител, связывающихся с вирусами гриппа первой филогенетической группы (H1, H2, H5), и индукцию специфических цитотоксических Т-лимфоцитов (CD3+CD8+ИФН-γ+). Иммунизация слитым бел ком защищала иммунизированных животных от ле тальной гриппозной инфекции. Сконструированный гибридный рекомбинантный белок FlgMH является перспективной основой для создания противогрип позной вакцины широкого спектра действия, спо собной стимулировать Т- и В-клеточный иммунный ответ. Кросс-протективный потенциал фрагментов НА2 может быть усилен оптимизацией их доставки и увеличением иммуногенности при помощи лиган дов TLR-рецепторов для эффективной стимуляции врожденного иммунитета и последующего усиления адаптивного иммунного ответа.

Об авторах

Л. А. Степанова

Научно-исследовательский институт гриппа МЗ РФ

Автор, ответственный за переписку.
Email: stepanoval60@mail.ru
Россия

M. В. Сергеева

Научно-исследовательский институт гриппа МЗ РФ

Email: stepanoval60@mail.ru
Россия

M. A. Шуклина

Научно-исследовательский институт гриппа МЗ РФ

Email: stepanoval60@mail.ru
Россия

A. A. Шалджян

Научно-исследовательский институт гриппа МЗ РФ

Email: stepanoval60@mail.ru
Россия

M. В. Потапчук

Научно-исследовательский институт гриппа МЗ РФ

Email: stepanoval60@mail.ru
Россия

A. В. Коротков

Научно-исследовательский институт гриппа МЗ РФ

Email: stepanoval60@mail.ru
Россия

Л. M. Цыбалова

Научно-исследовательский институт гриппа МЗ РФ

Email: stepanoval60@mail.ru
Россия

Список литературы

Дополнительные файлы