Испытания трансгенных растений осины с геном bar на устойчивость к гербицидам в полунатуральных условиях

Полный текст

ВВЕДЕНИЕ Многие лиственные породы (например, ива и тополь) на ранних стадиях роста не выдерживают конку ренции с сорными растениями, что делает борьбу с сорняками очень важной [1]. Эта проблема особен но актуальна в питомниках, где низкая конкуренто способность молодых растений приводит к сниже нию их выживаемости и ослаблению роста. В связи с этим на борьбу с сорными растениями в питомни ках тратится 50-70% средств, выделяемых на вы ращивание стандартного посадочного материала [2]. Механические способы борьбы отличаются трудоем костью и низкой эффективностью. Более перспек тивно использование гербицидов, простых в приме нении, эффективных и экономичных. В зоне умеренного климата в лесных питомниках выращивают различные виды Populus, однако ис пользованию гербицидов мешает высокая чувстви тельность видов этих растений к большинству таких соединений [3]. Оптимальным представляется выра щивание растений, устойчивых к высокоэффектив ным неселективным гербицидам, относительно без опасным для окружающей среды. С этой целью в древесные растения встраи вали различные гены, определяющие устойчи вость к гербицидам. Первым таким геном был ген aroA, придающий устойчивость к глифосату [4]. Сообщалось также о переносе гена crsl-1 для при обретения устойчивости к сульфонилмочевине [5], генов СР4 и GOX для устойчивости к глифосату [6]. Наибольшее распространение, однако, получил ген bar почвенной бактерии Streptomyces hygroscopicus, придающий устойчивость к гербицидам широ кого спектра действия (Liberty, Basta, Finale и др.) на основе фосфинотрицина (ФФТ, глюфосинат ам мония). ФФТ является аналогом L-глутаминовой кислоты и мощным ингибитором глутаминсинтета зы (ГС), играющей центральную роль в ассимиляции аммония и регуляции азотного метаболизма в рас тениях [7]. Ингибирование ГС приводит к быстрому накоплению аммония в растительной клетке и ее последующей гибели [8]. Ген bar кодирует фермент ФФТ-ацетилтрансферазу, который ацетилирует свободную аминогруппу ФФТ и тем самым инак тивирует его [9]. Ген bar встраивали в различные виды и гибриды Populus [3, 10] и Eucalyptus [11, 12], а также дуб [13] и различные виды хвойных [14, 15], но растения осины ранее не трансформировали. Цель нашей работы заключалась в создании устойчивых к гербицидам растений осины путем трансформации отечественных высокопродуктивных генотипов ге ном bar и отборе на основе испытаний в полунату ральных условиях линий, перспективных для план тационного лесоводства. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ В работе использовали растения осины (P. tremula L.) двух генотипов - Pt и f2. Растения с генотипом Pt, обнаруженные в Ленинградской области, характе ризуются быстрым ростом и устойчивостью к ядро вой гнили (СПбНИИЛХ, А.В. Жигунов, персональ ное сообщение), тогда как растения с генотипом f2 представляют собой культуру микропобегов клона 34, найденного С.Н. Багаевым в Костромской области [16]. Растения культивировали in vitro на среде WPM [17] с 0.5 мг/л гиббереллина при 22-24°C и фотопери оде 16 ч. Трансформацию проводили штаммом Agrobacterium tumefaciens СВЕ21 с бинарным век тором pBIBar [18], содержащим гены nos-nptII и 35S-bar согласно [19]. Канамицин-устойчивые трансформанты анализировали методом ПЦР. Растительную ДНК выделяли согласно [20]. Возможное загрязнение препаратов агробактери альной ДНК проверяли путем амплификации после довательности гена virB. Использовали следующие пары праймеров: Vir-B1 - 5’-GGCTACATCGAAGATCGTATGAATG- 3’; Vir-B2 - 5’-GACTATAGCGATGGTTACGATGTTGAC- 3’; Nos - 5’-CGCGGGTTTCTGGAGTTTAATGAGCTAAG- 3’; NptII - 5’-GCATGCGCGCCTTGAGCCTGG-3’; Bar-1 - 5’-TGCACCATCGTCAACCACTA-3’; Bar-2 - 5’-ACAGCGACCACGCTCTTGAA-3’. Реакционная смесь содержала 16 мМ (NH4)2SO4, 0.01% бычьего сывороточного альбумина, 200 мкМ каждого dNTP, 0.4 мкМ каждого олигонуклеотида, 0.05 ед. акт./мкл Taq-полимеразы, 1-5 нг/мкл геном ной ДНК. Условия ПЦР: денатурация - 96°С (3 мин); 30 циклов - 94°С (1 мин), 60°С (nptII, bar) или 58°С (virB) по 1 мин, 72°С (1 мин); элонгация - 72°С (5 мин). Реакцию проводили на амплификаторе MJ MiniTM Gradient Thermal Cycler (Bio-Rad, США). Устойчивость трансгенных линий in vitro оцени вали путем укоренения растений на среде WPM с 0, 0.5 или 5 мг/л ФФТ. Через 2 недели после посадки определяли частоту укоренения, количество корней и их длину. Для оценки устойчивости к обработке гербицидом трансгенные и контрольные растения были микроразмножены, адаптированы к условиям теплицы и после пересадки в пластиковые сосуды объемом 1 л с субстратом торф : перлит (3 : 1) в на чале июня 2014 г. перенесены на открытую площад ку на территории ФИБХ РАН в Пущино. В середи не июля растения обрабатывали водой (контроль) или 0.5, 1 и 2% водным раствором гербицида Basta (Bayer CropScience, 150 г/л ФФТ) в дозах, эквива лентных 2.5, 5 и 10 л/га (по четыре растения каждой линии в варианте). Визуальную оценку поврежде ний проводили через 3, 7, 14 и 28 сут после обработки по следующей шкале: 0 баллов - без повреждений, 1 - некроз 0-25% поверхности листьев, 2 - 25-50%, 3 - 50-75%, 4 - 75-100%, 5 - полный некроз. В день обработки и через 3 сут отбирали образцы листьев для оценки содержания аммонийного азота и воды. Растительный материал экстрагировали соглас но [21]. Аммонийный азот определяли согласно [22]. Содержание воды определяли высушиванием при 105°С в течение 24 ч. В течение вегетационного сезона 2014 г. каждые 4 недели измеряли высоту рас тений и подсчитывали количество листьев, каждые 8 недель - диаметр основания ствола. После перезимовки в естественных условиях в мае 2015 г. растения пересаживали в сосуды объ емом 3 л. Степень подмерзания растений определяли по соотношению живой части к общей длине ствола. Метеоданные получены с автоматической метеостан ции UGT в Пущино (около 600 м от места испытаний). Экспрессию гена bar оценивали в июне 2015 г. мето дом ОТ-ПЦР (внутренний контроль - ген актина). РНК выделяли по модифицированной методике [23]. кДНК синтезировали в два этапа. На первом этапе реакционную смесь (0.1-5 мкг РНК, 0.5 мкг олиго-dT праймера, 10 ед. акт. ингибитора РНКаз) прогревали в течение 5 мин при 70°С и переносили на лед. На вто ром этапе добавляли 0.4 мМ dNTP, буфер для обрат ной транскриптазы и 4 ед. акт./мкл обратной транс криптазы M-MuLV, инкубировали в течение 1.5 ч при 37°С, после чего прогревали (15 мин при 70°С). ПЦР проводили с праймерами на гены bar и актина: Actin 1 up - 5’-TATGCCCTCCCACATGCCAT-3’; Actin 1 low - 5’-CATCTGCTGGAAGGTGCTGA-3’. Реакционная смесь содержала ScreenMix-HS («Евроген»), 0.8 мМ праймеров 0.1-5 мкг РНК или кДНК. Условия ПЦР: денатурация - 95°С (5 мин); 31 цикл - 95°С (45 с), 59°С (30 с), 72°С (1 мин); элонга ция - 72°С (10 мин). В июле 2015 г. растения обраба тывали гербицидом по описанной выше методике. Статистическую обработку проводили с использо ванием программы Statistica 6.1 (StatSoft, США). РЕЗУЛЬТАТЫ В результате генетической трансформации вектором pBIBar получено 18 линий осины, устойчивых к кана мицину: 10 - на основе генотипа Pt и восемь - на ос нове f2. Из 14 наиболее хорошо растущих in vitro линий (по семь с каждым генотипом) выделили ДНК для проведения ПЦР-анализа. ПЦР-анализ гена virB не выявил загрязнения образцов агробактериальной ДНК. Подтверждено присутствие последовательно сти селективного гена nptII во всех линиях (данные не приведены). Вставка целевого гена bar в геном осины обнаружена в шести из семи линий Pt (кроме PtXIBar23a), во всех линиях f2 выявлена амплифи кация фрагмента ДНК ожидаемого размера - 310 п.н. (рис. 1). Устойчивость растений осины in vitro (13 линий и два исходных генотипа) определяли путем укоре нения на среде, содержащей 0 (контроль), 0.5 мг/л (сублетальная концентрация) или 5 мг/л (летальная концентрация) ФФТ. Через 2 недели после посадки у нетрансгенных растений на среде с 0.5 мг/л ФФТ резко снизились частота укоренения, количество и длина корней, а на среде с 5 мг/л ФФТ все расте ния погибли. Добавление ФФТ не повлияло на часто ту укоренения трансгенных растений, хотя у некото рых линий отмечено снижение количества и длины корней. По итогам эксперимента in vitro отобрано по три трансгенные линии каждого генотипа, не по казавшие снижения показателей укоренения на сре де с ФФТ - PtXIBar9a, PtXIBar14a, PtXIBar29a, f2XIBar2a, f2XIBar3a и f2XIBar5a, которые оцени вали на устойчивость к гербициду Basta в условиях открытой площадки. Выявлена низкая устойчивость однолетней нетрансгенной осины: уже через 3 сут все листья на растениях обоих генотипов были полно стью некротизированы вне зависимости от использо ванной дозы гербицида (табл. 1 и 2). Все трансгенные линии были устойчивыми к обработке 2.5 л/га герби цида, а две линии генотипа f2 - и к 5 л/га. В осталь ных вариантах на отдельных листьях наблюдались мелкие пятна некроза, занимающие до 5-10% пло щади листа. Через 7 сут после обработки Basta в мак симальной дозе у некоторых трансгенных линий воз росла степень поражения - увеличилось количество пораженных листьев и площадь некроза (до 25% пло щади листа). Через 14 и 28 дней после обработки сим птомы поражения у трансгенных растений не уси лились, а контрольные растения сбросили листья и полностью погибли. Внешний вид растений через 7 сут после обработки показан на рис. 2. Показано, что уровень аммонийного азота в ли стовой ткани однолетних растений осины трансген ных линий был сходным, но в контрольных расте ниях содержание аммония было существенно выше: 17.5-19.6 и 24.2 мкг NH4 +/г сырого веса у генотипа Pt (р < 0.001) и 18.9-20.6 и 24.1 мкг NH4 +/г сырого веса у генотипа f2 (р < 0.05) соответственно. Через 3 сут после обработки гербицидом уровень аммония в контрольных растениях увеличился в зависимости от дозы в 2.7-4.6 раза у Pt (рис. 3) и 2.2-3.7 раза у f2 (рис. 4). В большинстве трансгенных линий уровень аммония снизился (до -36% от исходного уровня), тогда как в линии PtXIBar9a во всех вариантах его содержание возросло на 14-60% (в абсолютных зна чениях не отличаясь существенно от варианта обра ботки водой). До обработки листья осины содержали, в за висимости от линии, 55.9-64.1% воды (табл. 3). Обработка гербицидом вызвала резкое обезвожи вание контрольных растений: содержание воды снизилось до 20.3-24.0% у растений с генотипом Pt и до 22.7-25.3% - с f2. У трансгенных растений этот показатель практически не изменился и со ставил 53.9-63.3% (95-102% от исходного уровня). Существенные различия между вариантами обра ботки гербицидом отсутствовали. Измерения биометрических показателей растений осины в сезоне 2014 г. не выявили негативного влия ния обработки гербицидом на рост трансгенных ли ний. Не обнаружено статистически значимых разли чий в измеренной в конце года высоте растений после разных вариантов обработки (рис. 5). Трансгенные линии также не отличались по высоте между собой и от контрольных растений. Не выявлено существен ных различий и в облиственности растений (данные не приведены), но диаметр ствола у растений линии f2XIBar5a, обработанных 2.5 или 5 л/га, был значи мо выше, чем в варианте обработки водой - 6.9, 7.0 и 6.3 мм соответственно (р < 0.05). Для оценки влияния абиотических факторов на стабильность экспрессии перенесенного гена растения оставляли на зимовку в естественных ус ловиях. В третьей декаде октября 2014 г. на всей Европейской части России наблюдались аномально низкие температуры. В Пущино в эти дни температу ра опускалась до -12.6°С, что примерно на 10°С ниже среднемноголетних значений (рис. 6). Как выяснилось весной после распускания почек, такое похолодание вызвало частичное подмерзание однолетних побегов или даже полную гибель расте ний (рис. 7). Генотип f2 показал значительно более низкую зимостойкость, чем генотип Pt. Растения ли нии f2XIBar5а вымерзли полностью, у всех расте ний линии f2XIBar3а отмечено подмерзание побегов (в среднем 22.9% длины), и только у линии f2XIBar2а и в контроле около половины растений не получили никаких повреждений. Не погибли растения с гено типом Pt, а доля подмерзших составила 41.2-70.6% с более низкой степенью подмерзания побегов. ОТ-ПЦР-анализ тотальной РНК пяти выживших после перезимовки трансгенных линий осины выявил положительный сигнал ожидаемого размера у всех линий, что подтверждает транскрипцию гена bar (рис. 8). В нетрансгенных растениях обоих генотипов транскрипция гена bar не обнаружена. Перезимовавшие растения пяти трансгенных линий осины и исходных генотипов в 2015 г. были повторно обработаны гербицидом Basta (погибшие контрольные растения заменили резервными). Развитие симптомов поражения у двулетних не трансгенных растений было несколько замедлено по сравнению с однолетними в 2014 г. - через 3 дня после обработки гербицидом в дозе, эквивалент ной 2.5 и 5 л/га, на части листьев еще оставались живые участки ткани (поражение четыре балла). Однако через 7 дней после обработки все листья нетрансгенных растений были полностью некроти зированы (рис. 9). Не наблюдалось заметных раз личий в устойчивости трансгенных линий. Все рас тения были полностью устойчивыми к дозе 2.5 л/га. Обработка 5 л/га не вызвала симптомов поражения через 3 сут, через 7 сут на единичных листьях по явились мелкие пятна некроза размером до 1 мм, через 14 сут симптомы поражения в виде пятен или полосок некроза вдоль краев листа не более 1 мм в ширину отмечены примерно у 25% всех ли стьев. Эффект от обработки двойной полевой дозой (10 л/га) был выражен сильнее: мелкие пятна не кроза на отдельных листьях обнаружены уже на 3-й день после обработки, через 7 дней было поражено до трети всех листьев, а через 14 дней - около по ловины. В этом варианте мелкие пятна некроза (до 1-2 мм в диаметре) наблюдали в основном у краев листа, только у некоторых листьев в верхней ча сти побегов (2-3 листа на растение) некроз занимал до 10-15% площади. После 14 дней дальнейшего развития симптомов поражения не наблюдалось. На основе проведенных исследований отобрали четыре трансгенные линии, PtXIBar9a, PtXIBar14a, PtXIBar29a и f2XIBar2a, обладающие высокой устойчивостью к гербициду с ФФТ и максимальным уровнем зимостойкости. ОБСУЖДЕНИЕ Современные лесные плантации представляют со бой искусственные насаждения интенсивного типа, предназначенные для получения специализирован ного сырья с продуктивностью, значительно превы шающей продуктивность природных лесов. Такой эффект достигается несколькими способами, напри мер, использованием элитных генотипов, в том числе и трансгенных, например, в апреле 2015 г. в Бразилии одобрено коммерческое использование трансгенного эвкалипта с ускоренным ростом [24]. Немаловажное значение имеет и качественный уход, а также за кладка плантаций высококачественным посадочным материалом, выращивание которого в питомниках невозможно без борьбы с сорняками. Химический способ борьбы позволяет увеличить выход посадоч ного материала и повысить его качество, существен но снизив при этом трудовые и денежные затраты. Придание устойчивости к гербицидам методами ген ной инженерии позволяет упростить борьбу с сорня ками химическим способом, не повреждая при этом культурные растения. С этой целью в растения оси ны был встроен ген bar из почвенной бактерии S. hygroscopicus [9]. Этот ген не только придает устой чивость к гербицидам на основе ФФТ, но и является одним из наиболее широко используемых в генной инженерии селективных генов [25]. Кроме того, в от личие от большинства других генов устойчивости к гербицидам, ген bar обеспечивает инактивацию действующего вещества гербицида. Для трансформации мы использовали элитные генотипы осины российского происхождения, от личающиеся ускоренным ростом и устойчивостью к сердцевинной гнили. Например, насаждения клона 34 (исходный материал для культуры in vitro гено типа f2) в возрасте 47 лет превосходили насаждения обычной осины по сумме площадей сечений на 51%, по запасу - на 43%, а доля деревьев со стволовы ми гнилями у этого клона была ниже в 4.7 раза [26]. Методом ПЦР встраивание гена bar подтверждено у 13 трансформантов. Эксперимент in vitro показал устойчивость всех трансгенных линий к летальной для нетрансгенных растений концентрации ФФТ в среде, что подтверждает экспрессию встроенного гена. Дальнейшие испытания устойчивости расте ний осины к гербицидам проводили в полунатураль ных условиях: рост корневой системы ограничен объемом посадочного контейнера, но растения на ходятся в открытом грунте и подвержены всем воз действиям окружающей среды. В настоящее время это наиболее приближенный к естественным усло виям уровень работы с трансгенными растениями, доступный в России, так как полевые испытания не проводятся уже около 10 лет. Растения обраба тывали или водой, или гербицидом Basta в дозах, эквивалентных 2.5, 5 и 10 л/га. Этот гербицид в дозе 1.5-2.5 л/га используется в качестве десиканта, а 4-5 л/га - в качестве гербицида. Таким образом, максимальная концентрация соответствовала двой ной полевой дозе. Для оценки стабильности пере несенного признака обработку проводили в течение 2014 и 2015 гг. после перезимовки в естественных условиях. Обработка однолетних растений показала, что оси на очень чувствительна к ФФТ - уже через 3 сут все листья нетрансформированного контроля были пол ностью некротизированы. О высокой чувствитель ности к ФФТ растений рода Populus сообщалось ра нее: полный некроз листьев P. alba наблюдали уже через 2 дня после обработки стандартной полевой дозой гербицида [3]. В отличие от контроля, транс генные растения осины, несущие ген bar, показали высокую степень устойчивости - обработка 5 и 10 л/га приводила к образованию незначительных пя тен некроза. Гербицид не вызвал ослабления роста ни одной из шести линий осины, тогда как в работе Meilan и соавт. [6] снижение роста наблюдали у 25% линий гибридов Populus, обработанных однократ ной дозой и у 17-61% - двукратной. Другие дере вья с геном bar также проявляли высокую степень устойчивости: к двукратной дозе гербицидов с ФФТ были устойчивы растения эвкалипта [11] и P. alba [3]. Мы наблюдали различия между генотипами в реак ции на обработку гербицидом: признаки поражения у трансгенных линий на основе генотипа Pt были вы ражены в большей степени, чем генотипа f2. Наши растения P. tremula, погибшие после обработки 375 г/га ФФТ, оказались более чувствительными к ФФТ, чем гибрид P. alba × P. tremula, который выжил после обработки 400 г/га ФФТ [10]. В клетках растений аммоний, выделяемый при восстановлении нитрата, деградации аминокис лот и фотодыхании, эффективно детоксифицирует ся только глутаминсинтетазой [7], поэтому растения очень чувствительны к ингибиторам этого фермента, одним из которых является ФФТ. Накопление ам мония в растениях, обработанных ФФТ, широко ис пользуется в качества биохимического маркера ин гибирования глутаминсинтетазы [27]. В однолетних нетрансгенных растениях осины через 3 сут после об работки содержание аммония увеличилось в 2.2-4.6 раза в зависимости от дозы и генотипа. По-видимому, генотип Pt более чувствителен к действию гербици да (рост в 2.7-4.6 раза), чем f2 (рост в 2.2-3.7 раза). Наблюдаемое нами повышение содержания аммония у осины было значительно менее выражено, чем у ги брида P. alba × P. tremula, когда через 24 ч содержа ние выросло почти в 100 раз - с 9 до 800-900 мкг/г сырого веса [10]. Это можно объяснить различиями в генотипах, времени после обработки - 72 и 24 ч, дозе ФФТ - 0.375-1.5 и 4 кг/га и скорости метабо лизма, связанной с возрастом растений и нахожде нием в теплице или на открытой площадке. Во всех шести трансгенных линиях осины обработка гер бицидом не привела к существенному повышению уровня аммония, довольно сходному во всех вари антах (12.4-27.0 мкг/г сырого веса). Этим наши ре зультаты отличаются от данных работы Asano и со авт. [28], которые наблюдали примерно 10-кратный разброс в содержании аммония в шести трансгенных линиях Agrostis, несущих ген bar, через 3 дня после обработки гербицидом, почти достигавший уровня нетрансгенных растений. У нас же, наоборот, в боль шинстве вариантов содержание аммония снизи лось, и в трех вариантах, где снижение составило 34-36% (f2XIBar3a после 10 л/га и f2XIBar5a после 5 и 10 л/га), оно было значимым. Возможно, это свя зано с какими-то процессами, протекавшими в этот 3-дневный период, например с включением аммония в азотный метаболизм. Высокие дозы гербицида, вы звавшие некроз на листьях трансгенных растений, не отразились на содержании аммония. Считается, что токсичность накапливаемого ам мония является основным фактором гербицидной активности ФФТ [8, 29]. С другой стороны, показа но, что действие гербицида обусловлено, главным образом, не накоплением аммония, а отсутствием глутамина, что делает невозможным синтез важ нейших азотсодержащих соединений, образую щихся из амидного и аминного азота глутамина [30]. Учитывая полный некроз листьев нетрансгенных растений осины при повышении уровня аммония всего в 2.2 раза, отсутствие взаимосвязи между по ражением листьев и уровнем аммония у трансгенных растений, а также способность растений выживать при многократном повышении уровня аммония [31], можно предположить, что фитотоксичность аммония не является основной причиной гибели осины после обработки ФФТ. Для оценки чувствительности к ФФТ использова ли такой показатель, как снижение сырой [8] или су хой [32] массы. Так как гербицид Basta применяется и в качестве десиканта, мы решили использовать по казатель обезвоживания листовой ткани. Обработка гербицидом вызвала резкое обезвоживание нетранс генных растений - содержание воды упало поч ти в 3 раза независимо от дозы. По-видимому, уже в дозе 2.5 л/га (стандартной для десикации) был до стигнут некий физиологический предел обезвожи вания. Появление пятен некроза на листьях транс генных растений, обработанных гербицидом в дозе 5 и 10 л/га, не отразилось на содержании в них воды, которое колебалось в диапазоне 95-102% по срав нению со значениями до обработки всех растений, в том числе и обработанных водой. Стоит отметить, что у контрольных растений f2 влажность снизилась в меньшей степени (в 2.4-2.7 раза), чем у растений Pt (в 2.6-3 раза). В середине-конце октября 2014 г. в Европейской России произошло резкое похолодание, которое на блюдалось впервые с 1982 г. [33]. Отрицательные аномалии в этот период достигали 8-11°С, и тем пература соответствовала середине декабря. Незапланированные испытания осины на зимо стойкость привели к гибели всех растений линии f2XIBar5а и к подмерзанию всех растений линии f2XIBar3а. Это позволяет предположить некие из менения в этих линиях, значительно снизившие их устойчивость к низким температурам в осенний период. Интересно, что из трех трансгенных линий генотипа f2 именно у двух наиболее пострадавших отмечено существенное снижение уровня аммония после обработки гербицидом. Уровень зимостойкости остальных четырех трансгенных линий осины был значительно выше и находился на уровне нетранс генных растений обоих генотипов. Этот случай лиш ний раз подтверждает необходимость проведения полевых испытаний многолетних растений в течение длительного периода времени и в различных клима тических зонах. Помимо уровня экспрессии встроенных генов, для древесных растений особенно важна ее стабиль ность, так как они растут много лет, ежегодно под вергаясь сменам периодов покоя и роста, а также воздействию различных абиотических и биотических стрессов. Нестабильная экспрессия перенесенных генов и, как следствие, проявление новых призна ков ставит под вопрос коммерческую ценность таких растений. Стабильную экспрессию гена bar в гибри дах Populus в полевых условиях без затухания на блюдали на протяжении трех [34] или восьми лет [35]. Высокий уровень устойчивости к гербициду Basta со хранялся также у подвоя груши с геном bar на 5-й год выращивания в поле [36]. Однако в двулетних поле вых испытаниях тополя с генами устойчивости к гли фосату на второй год отмечено сильное усиление повреждений двух линий из 80 от обработки герби цидами, а в некоторых линиях выявлены морфологи ческие изменения [6]. В нашей работе сильный абио тический стресс не вызвал снижения экспрессии гена bar в выживших растениях осины, что подтверждено анализом экспрессии методом ОТ-ПЦР. Двулетние трансгенные растения сохранили высокий уровень устойчивости и на второй год испытаний, но развитие симптомов поражения у них было замедлено, причем и у нетрансгенных контрольных растениях тоже. Это может быть связано со значительно увеличившейся листовой поверхностью или меньшей восприимчиво стью к гербициду по причине более развитой кути кулы. Именно малоразвитой кутикулой объясняют сниженную устойчивость гибридов Populus с геном bar, обработанных вскоре после высадки в поле [35], но через 8 лет эти растения показали высокую устойчивость. В пользу этой версии говорит и то, что в отличие от первого года, когда пятна некроза были относительно равномерно распределены по по верхности листа, на растениях второго года симпто мы поражения концентрировались по краям листа, где кутикула могла быть тоньше. Возможно также, что нанесенный гербицид стекал к краям листа. Так как устойчивость к гербицидам у древесных растений важна в первые годы выращивания, то та кие гены целесообразно встраивать в уже транс генные растения. Например, впервые повторная трансформация древесных растений была проведе на именно геном bar на уже трансгенных растениях груши, несущих ген gus [37]. Перспективность подоб ного направления в лесной биотехнологии подтверж дается исследованиями компании ArborGen (США), в которых гены устойчивости к гербицидам перено сили в трансгенную линию эвкалипта AGEH427 [38], содержащую гены холодоустойчивости и стериль ности [39]. ЗАКЛЮЧЕНИЕ На основе элитных генотипов нами получен ряд трансгенных линий осины с геном bar, придающим устойчивость к гербицидам, содержащим фосфино трицин. Двулетние испытания в полунатуральных условиях показали устойчивость полученных линий к двухкратной полевой дозе гербицида Basta. По ре зультатам этих испытаний отобраны четыре линии (PtXIBar9a, PtXIBar14a, PtXIBar29a, f2XIBar2a), об ладающие не только высокой устойчивостью к гер бицидам, но и к экстремально низким температурам. Эти растения перспективны для проведения даль нейших исследований, в частности полевых испы таний. Кроме того, ген bar может использоваться для встраивания в другие трансгенные древесные растения, полученные ранее в нашей лаборатории и уже проявившие ценные признаки, такие, как по вышенная продуктивность и модификация состава древесины [40].

Об авторах

В. Г. Лебедев

Филиал Института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН

Автор, ответственный за переписку.
Email: vglebedev@mail.ru
Россия

В. Н. Фасхиев

Филиал Института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН

Email: vglebedev@mail.ru
Россия

Н. П. Коваленко

Филиал Института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН

Email: vglebedev@mail.ru
Россия

K. A. Шестибратов

Филиал Института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН

Email: vglebedev@mail.ru
Россия

A. И. Мирошников

Филиал Института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН; Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова

Email: vglebedev@mail.ru
Россия

Список литературы

Дополнительные файлы