Подход к диагностике точечных мутаций в нативной ДНК с применением оксида графена

Полный текст

ВВЕДЕНИЕ Диагностика точечных мутаций (замен, инсерций, делеций, далее - ТМ) чрезвычайно важна для совре менной медицины, так как позволяет судить о пред расположенности к различным заболеваниям, осу ществлять правильный подбор лекарств и открывает путь к изучению функций генов. В современной ме дицинской генетике используют несколько основных методов диагностики ТМ в нативной ДНК [1]: ПЦР- ПДРФ-анализ, флуоресцентные методы детекции (ПЦР в реальном времени, ПЦР с регистрацией сиг нала по конечной точке), технологии с применением биочипов и секвенирование. Однако все эти методы имеют определенные недостатки, поэтому актуаль ным остается поиск новых более быстрых, эконо мичных и эффективных подходов к диагностике ТМ в нативной ДНК [2]. В последние годы при поиске подходов к диагно стике ТМ активно используется оксид графена, кото рый обладает двумя уникальными свойствами - спо собностью к тушению флуоресценции находящихся вблизи него флуорофоров [3] и различной аффинно стью по отношению к одно- и двухцепочечным мо лекулам ДНК [4] при низкой стоимости и простоте синтеза. С применением этих свойств за последние 5 лет разработано большое число различных подхо дов к диагностике ТМ с применением оксида графе на, например, [5-9]. Однако эти подходы эффектив ны в случае диагностики ТМ в небольших по длине одноцепочечных олигонуклеотидах, и ни один из них не позволяет диагностировать ТМ в нативной ДНК [10]. Целью данного исследования стала разработка подхода к диагностике ТМ в нативной ДНК с приме нением оксида графена. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ Материалы Оксид графена синтезировали из натурально го порошка графита согласно модифицированно му методу Hummers и соавт. [11]. Использовали реактивы для синтеза оксида графена компании «Востокреактив» (Россия), диализные мешки MFPI MF-1230-45 «Русбиолинк» (Россия), реактивы для проведения ПЦР (буфер для ПЦР, MgCl2, dNTP, ДНК-полимераза) приобретены в компании «Евроген» (Россия). Использовали аллель-специфичную SNPdetect ДНК-полимеразу («Евроген»). Структура праймеров для ПЦР приведена в таблице. Продукты ПЦР инкубировали с оксидом графена с использованием разведенного деионизованной во дой натрий-фосфатного буфера (10×, Gibco, США). Деионизованную воду (18.2 MΩ×см) получали с помо щью системы очистки Milli-Q Advantage A10 (Merck Millipore, Германия). Характеристики тест-системы определяли на трех группах образцов ДНК (по 16 в каждой группе - больные 3М-синдромом с подтвержденной мутацией 4582insT в гомозиготном состоянии, гетерозиготные носители мутации 4582insT, здоровые), выделенных из периферической крови пациентов, от которых получено информированное согласие. Также были использованы 16 отрицательных контролей. Все об разцы ДНК генотипировали с помощью тест-системы компании «ТестГен» на основе метода ПЦР в реаль ном времени (рис. 1). Проведение исследования одо брено локальным этическим комитетом. Оборудование Для синтеза оксида графена использовали маг нитную мешалку Intelli-Stirrer MSH-300i (Biosan, Латвия), а также ультразвуковой диспергатор ИЛ100-6/3 («ИНЛАБ», Россия) и центрифугу MiniSpin Plus (Eppendorf, Германия). ПЦР проводи ли с использованием термоциклера С1000 (Bio-Rad, США), интенсивность флуоресценции регистри ровали с помощью флуориметра Джин-4 («ДНК технология», Россия). Синтез оксида графена Порошок графита (0.1 г, Sigma Aldrich, США) и ни трата натрия (0.05 г, «х. ч.») добавляли в концентри рованную серную кислоту («ос. ч.») объемом 14 мл. Далее мелкими порциями постепенно добавляли 0.4 г перманганата калия («ч.д.а.»). Полученную реакци онную смесь перемешивали в химическом стакане в течение 3 недель на магнитной мешалке при тем пературе 75оС. После перемешивания смесь разбав ляли деионизованной водой в 2 раза по объему. Далее в смесь добавляли 5% раствор пероксида водорода (7 мл) до появления бриллиантово-желтой окраски. Бриллиантово-желтую смесь фильтровали на ворон ке Бюхнера с использованием обеззоленного фильтра (желтая лента) диаметром 70 мм и промывали 300 мл деионизованной воды до установления нейтральной среды в фильтрате. При этом получали коричневую гелеобразную массу, которую переносили с фильтра в химический стакан и разбавляли 50 мл воды с по следующей ультразвуковой обработкой с объемной мощностью 750 Вт в течение 5 мин на диспергаторе ИЛ100-6/3. После диспергирования суспензию цен трифугировали при 14500 об/мин (14.1 g) в течение 5 мин, частицы оксида графита, не расслоившиеся в результате УЗ-обработки, удаляли путем декан тации раствора оксида графена над осадком. На по следнем этапе проводили диализ раствора в диа лизных мешках (MWCO: 12000-14000) в течение 3 дней с трехкратной сменой деионизованной воды в стакане объемом 1 л с диализным пакетом. В ре зультате получали однородную суспензию оксида графена темно-коричневого цвета, объемом ~ 50 мл. В высушенной суспензии оксида графена методом энергодисперсионной рентгеновской спектроскопии определяли атомное содержание углерода и кисло рода, которое составило ~58 и ~42% соответственно. Концентрацию оксида графена в суспензии опре деляли весовым методом, взвешивая сухой остаток от 1 мл суспензии, высушенной при температуре 170оС в течение 5 мин. Аллель-специфичная ПЦР Для каждого образца ДНК готовили 25 мкл сме си, содержащей 1× ПЦР-буфер, 3 мМ MgCl2, 0.28 мМ dNTP, 0.2 мкМ праймера R, 0.6 мкМ прай мера F-FAM, 66.4 нМ праймера F-ROX, 2.5 ед. акт. SNPdetect ДНК-полимеразы и 1.2 нг/мкл ДНК. Температурный профиль ПЦР состоял из денату рации при 95оС в течение 3 мин, 38 циклов ампли фикации (30 с - денатурация при 95оС, 30 с - отжиг при 60оС, 1 мин - элонгация при 72оС), завершающей элонгации при 72оС в течение 5 мин. Верификацию прохождения амплификации осуществляли ме тодом гель-электрофореза продуктов ПЦР в 3% агарозном геле без добавления бромистого этидия. Длина продукта амплификации составляла 149 п.н. (150 п.н. при амплификации с мутантного аллеля), GC-состав - 55.7%. Добавление оксида графена к продуктам ПЦР и регистрация флуоресценции Из каждой пробирки отбирали 15 мкл постампли фикационной ПЦР-смеси и помещали в 0.6 мл про зрачную микроцентрифужную пробирку. Далее добавляли 3.6 мкл 5× натрий-фосфатного буфе ра (Gibco, США) и 4 мкл суспензии оксида гра фена (0.5 мг/мл) в 1× натрий-фосфатном буфе ре (Gibco, США), инкубировали при комнатной температуре на орбитальном шейкере в течение 20 мин (450 об/мин). Измеряли интенсивность флу оресценции по FAM- и ROX-каналам в каждой пробирке с помощью флуориметра Джин-4 («ДНК технология», Россия). РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Описание разработанного подхода На рис. 2 изображена схема разработанного подхода. На первом этапе диагностики проводят аллель специфичную ПЦР, которая отличается от обыч ной использованием аллель-специфичной ДНК полимеразы и трех праймеров. Один из праймеров (обратный, выделен на рис. 2 зеленым цветом) спо собен комплементарно отжигаться на ДНК аллелей обоих типов (дикого и мутантного). Два других прай мера (прямые, выделены синим и оранжевым цветом на рис. 2) содержат на 5’-конце разные флуорофо ры - ФЛ1 и ФЛ2 с неперекрывающимися спектрами возбуждения/эмиссии. Каждый из прямых прайме ров способен связываться с аллелем только одного типа, поскольку они комплементарны ДНК разных аллелей в области сайта мутации. В зависимости от генотипа донора ДНК возможно образование трех типов постамплификационной сме си: с ампликонами, меченными флуорофором ФЛ1 (гомозиготный дикий тип); меченными флуорофором ФЛ2 (гомозиготный мутантный тип), и с амплико нами, меченными обоими флуорофорами (гетерози готный тип). В любом случае продукты ПЦР будут содержать избыток флуоресцентно меченных прай меров. При добавлении водной суспензии оксида графена к постамплификационной ПЦР-смеси на поверхно сти нанолистов оксида графена будет происходить адсорбция одноцепочечных молекул ДНК - флуорес центно меченных праймеров, вследствие чего флуо ресценция от них будет потушена. Двухцепочечные молекулы ДНК (ампликоны) будут оставаться в рас творе из-за их низкой аффинности к оксиду графена и могут генерировать флуоресцентный сигнал. Если после добавления избытка оксида графена сравнить интенсивность флуоресценции каждого из флуорофоров в конечном растворе (для анализи руемого образца ДНК) и интенсивность флуоресцен ции в отрицательном контроле, то можно установить генотип донора ДНК. Апробация разработанного подхода С применением этого подхода нами разработана тест система, предназначенная для ДНК-диагностики мутации, ассоциированной с формированием 3М-синдрома у якутов. 3М-синдром - частое ауто сомно-рецессивное наследственное заболевание, обу словленное мутацией 4582insT в экзоне 25 гена CUL7 (KIAA0076, Куллин 7) [12]. Ввиду высокой частоты гетерозиготного носительства мутации, ассоции рованной с формированием 3М-синдрома у якутов (около 30 человек на 1000), это заболевание было вы брано для разработки тест-системы с применением оксида графена. C помощью сервиса Primer Blast (http://www. ncbi.nlm.nih.gov/) к разным аллелям были подобраны FAM- и ROX-меченые праймеры, по 3’-концу ком плементарные последовательности ДНК в области мутации (таблица). На стадии добавления оксида графена к про дуктам ПЦР использовали раствор оксида графена (0.5 мг/мл) в 1× натрий-фосфатном буфере, а также сам буфер, чтобы нивелировать влияние pH на ин тенсивности флуоресценции. После добавления окси да графена измеряли интенсивность флуоресценции каждого образца (в том числе отрицательных контро лей) по FAM- и ROX-каналам, после чего рассчиты вали средние интенсивности флуоресценции и соот ношения интенсивностей образец/контроль в каждой клинической группе образцов по каждому каналу флуоресценции в отдельности. Условия проведения аллель-специфичной ПЦР, состав ПЦР-смеси, длину амплифицируемого участка, количество оксида гра фена варьировали для достижения максимального соотношения интенсивностей флуоресценции обра зец/контроль по каждому каналу флуоресценции. В ходе оптимизации тест-системы на выбор ке из шести образцов ДНК носителей мутации 4582insT и здоровых доноров (по два образца каж дого типа) и двух отрицательных контролей в семи эквивалентных опытах с разными объемами до бавляемой суспензии оксида графена определено количество оксида графена, позволяющее макси мально эффективно интерпретировать результаты ДНК-диагностики - 4 мкл с концентрацией 0.5 мг/мл в 1× натрий-фосфатном буфере (рис. 3). Испытание разработанной тест-системы при ге нотипировании контрольной выборки из 48 образцов ДНК носителей мутации 4582insT и здоровых людей (по 16 образцов каждого типа) дало хорошие резуль таты (рис. 4). Доверительные интервалы на рис. 4 построены с применением стандартных отклонений, рассчитан ных как сумма относительных стандартных отклоне ний для интенсивностей флуоресценции контроль ных и известных образцов по каждому каналу. Согласно приведенным на рис. 4 данным, разра ботанная тест-система позволяет достоверно диа гностировать все три комбинации аллельных вари антов в гене CUL7. Использование оксида графена в качестве наноструктурного тушителя флуоресцен ции флуоресцентно меченных праймеров в постам плификационной ПЦР-смеси позволило добиться практически полного тушения их флуоресценции. При этом флуоресценция от меченого продукта ПЦР в значительной степени сохранялась, что позволило статистически значимо анализировать постампли фикационную смесь по флуоресцентным свойствам. На протестированной выборке клинических образцов специфичность тест-системы составила 100% (так как все образцы можно однозначно отнести к кли ническим группам), а чувствительность - не менее 1.2 нг ДНК, что позволяет говорить о пригодности предложенного подхода для генотипирования то чечных мутаций в условиях классической генети ческой лаборатории. Несомненными достоинствами разработанного метода являются его простота (три стадии) и скорость (2 ч). При этом, теоретически, раз работанный подход не ограничен типом детектируе мых точечных мутаций (инсерций, делеций, замен), так как он основан на применении аллель-специфич ной ПЦР, что позволяет адаптировать данный метод к диагностике любых точечных мутаций, если подо брать оптимальные структуры праймеров и условия диагностики. С учетом простоты метода, низкой сто имости коммерческого оксида графена, доступности используемого для ДНК-диагностики оборудования метод может быть интересен генетическим лаборато риям, занимающимся фармакогенетическими иссле дованиями, а также диагностикой наследственных заболеваний, обусловленных точечными мутациями в ДНК. ВЫВОДЫ Нами разработан подход, который предполагает ис пользование оксида графена в качестве нанострук турного тушителя флуоресценции для проведения диагностики ТМ с применением аллель-специфичной ПЦР. Метод может быть интересен диагностическим лабораториям, в которых для диагностики точеч ных мутаций (замен, инсерций, делеций) в натив ной ДНК используется недорогое оборудование типа ПЦР-флуориметров. Достоверность, специфичность и хорошая чувствительность подхода подтверждены при разработке тест-системы для ДНК-диагностики носительства мутации, ассоциированной с формиро ванием 3М-синдрома у якутов. Разработанный под ход позволяет создавать тест-системы для диагно стики любых точечных мутаций.

Об авторах

A. A. Кузнецов

Северо-Восточный федеральный университет им. М.К. Аммосова

Автор, ответственный за переписку.
Email: kuznecov.artem@mail.ru
Россия

Н. Р. Максимова

Северо-Восточный федеральный университет им. М.К. Аммосова

Email: kuznecov.artem@mail.ru
Россия

В. С. Каймонов

Северо-Восточный федеральный университет им. М.К. Аммосова

Email: kuznecov.artem@mail.ru
Россия

Г. Н. Александров

Северо-Восточный федеральный университет им. М.К. Аммосова

Email: kuznecov.artem@mail.ru
Россия

С. A. Смагулова

Северо-Восточный федеральный университет им. М.К. Аммосова

Email: kuznecov.artem@mail.ru
Россия

Список литературы

Дополнительные файлы