Открытие ядерной ДНК-подобной РНК (дРНК, гяРНК) и рибонуклеопротеидных частиц, содержащих гяРНК

Полный текст

ОТКРЫТИЕ ЯДЕРНОЙ дРНК Работы, о которых пойдет речь, были начаты моей группой в лаборатории И.Б. Збарского в Институте морфологии живот ных им. А.Н. Северцова АН СССР. Основная же их часть была вы полнена в Институте молеку лярной биологии АН СССР, куда в качестве заведующего лабора торией меня пригласил его дирек тор В.А. Энгельгардт, чьим именем позднее был назван этот институт. Моим основным сотрудником в открытии ядерной дРНК была В.Л. Мантьева, позднее кандидат биологических наук. Нас инте ресовала природа ядерной РНК [3]. Для выделения РНК исполь зовали недавно разработанный фенольный метод [4]. Суспензию клеток асцитного рака Эрлиха мышей в 0.14 М NaCl встряхива ли с фенолом, рН 6.0, на холоду, а затем центрифугировали смесь. Неожиданно мы обнаружили, что промежуточный слой, обра зующийся после центрифугиро вания между водной и фенольной фазами, состоит из сохранив ших свою форму клеточных ядер [5]. Эти ядра содержали хрома тин и ядрышки, в которых со храняются ДНК, ядерная РНК и большая часть ядерных бел ков (рис. 1). Поскольку фенол подавляет активность фермен тов, мы предположили, что «фе нольные» ядра могут служить хорошим материалом для при готовления ядерной РНК. В даль нейшем оказалось, что ядерную РНК из «фенольных» ядер можно извлечь с помощью той же про цедуры, но осуществляя встря хивание при температуре 65оС [3]. Выделенная ядерная РНК содержала в своем составе ком поненты с коэффициентом седи ментации 28S и 18S, характерные для рибосомной РНК, и гетеро генный материал. Нуклеотидный состав ядерной РНК был про межуточным между ДНК мыши (G+C/А+Т = 0.72) и рибосомной РНК (G+C/А+Т = 1.65) (рис. 1). Мы предположили, что ядерная РНК представлена рибосомной РНК и новым типом РНК, нукле отидный состав которой сходен с составом ДНК, т.е. информа ционной РНК. Первые же опыты по фракционированию ядерной РНК, выполненные в 1961 г., под твердили это предположение [3]. Наилучшее разделение дал разработанный в 1962 г. метод термического фенольного фрак ционирования, т.е. обработки фенольных ядер смесью 0.14 М NaCl-фенол, рН 6.0, при ступен чато повышающейся темпера туре [6]. При 40оС в водную фазу переходила чистая РНК с нукле отидным составом, соответству ющим рибосомной РНК (рРНК), которая содержала предшествен ники рибосомной РНК. В тем пературном интервале 55-65оС в водной фазе обнаруживалась чистая РНК, имеющая нуклео тидный состав, сходный с соста вом ДНК (G+C/А+U = 0.7-0.74). Существенно, что нуклеотидный состав тотальной РНК выделен ной фракции и присутствующей в ее составе новообразованной РНК, определяемый по меченной радиоактивным фосфором РНК, полностью совпадал [7, 8] (таблица). Открытая и очищенная ДНК-подобная РНК была названа дРНК. Описавшие эту РНК тре мя годами позднее (в 1965 г.) аме риканские авторы обозначили ее термином гетерогенная ядерная РНК (hnRNA, или гяРНК) [9-12]. Далее мы охарактеризова ли ядерную дРНК. Она оказа лась весьма гетерогенной по мо лекулярному весу, который достигал очень высокого уровня. Новообразованная ядерная дРНК имела значительно более высокий молекулярный вес, чем тотальная ядерная дРНК, что предполагало ее расщепление в клеточном ядре (процессинг) [7, 8] (рис. 2). В то же время мы определи ли размеры дРНК цитоплазмы, предположительно, зрелой мРНК. Для этого был разработан метод частичного блока синтеза РНК актиномицином Д, малые дозы которого избирательно подавля ют синтез рРНК, не затрагивая синтез дРНК. Молекулярный вес новообразованной дРНК ядра су щественно превышал таковой у дРНК цитоплазмы [7, 8] (рис. 2). Наконец, были проведены опыты по гибридизации и кон куренции ядерной дРНК и ци топлазматической мРНК с ДНК. Добавление ядерной дРНК пол ностью подавляло гибридизацию мРНК с ДНК, тогда как избыток мРНК лишь частично снижал ги бридизацию ядерной дРНК с ДНК (рис. 2). Мы предположили, что ядер ная дРНК является высокомо лекулярным предшественни ком цитоплазматической мРНК, или про-мРНК, которая частич но разрушается в ходе процес синга дРНК и созревания мРНК, что происходит в клеточном ядре, откуда мРНК экспортируется в цитоплазму. Окончательное до казательство этого потребовало нескольких лет и усилий ряда ла бораторий. Однако первое доказа тельство существования инфор мационной РНК у эукариот было получено в описанных работах [6-8]. ОТКРЫТИЕ РИБОНУКЛЕОПРОТЕИДНЫХ (РНП) ЧАСТИЦ: дРНП (гяРНП) Следующим шагом стало изучение состояния ядерной дРНК в клеточном ядре. Моим глав ным соавтором в этом цикле ра бот была О.П. Самарина, позднее доктор биологических наук, про фессор, лауреат Ленинской пре мии. Для изучения структур, со держащих гяРНК, использовали мягкую процедуру. Ядра пече ни крысы экстрагировали 0.14 M NaCl, 1 мМ MgCl2, 10 мМ трис буфером, рН 7.0. Некоторая часть РНК переходила в экстракт, и ее нуклеотидный состав был проме жуточным между рРНК и дРНК. Зато последующая трехкратная экстракция тем же раствором, но при рН 7.8-8.0 переводила в раствор значительно большую часть РНК, причем эта РНК име ла нуклеотидный состав такой же, как у чистой дРНК. ДНК подобный состав был характерен и для тотальной, и для новообра зованной РНК экстракта [13]. При ультрацентрифугировании большая часть гяРНК обнаружи валась в гомогенном 30S пике, со держащем частицы с диаметром около 20 нм. Молекулярный вес РНК, выделенной из 30S пика, был незначительным (рис. 3). Это про тиворечило данным о весьма вы соком молекулярном весе гяРНК, выделенной фенольным фракцио нированием. Чтобы разрешить это противоречие, мы провели выде ление экстрактов в присутствии ингибитора РНКаз из суперна танта цитоплазмы печени крысы. Совершенно иной была картина ультрацентрифугирования таких экстрактов: выявлена целая серия пиков, начиная с небольшого 30S пика и кончая материалом с ко эффициентом седиментации 200S и выше (рис. 4). Очевидно, что та кая ситуация была много ближе к нативной [14]. Интересно, что и 30S пик, и все более тяжелые пики имели оди наковую плавучую плотность в CsCl (после фиксации фор мальдегидом), равную примерно 1.4 г/мл, что соответствует от ношению РНК/белок порядка 1 : 4-1 : 5. Далее мы охарактеризовали крупные частицы. Мягкая обра ботка рибонуклеазой А количе ственно превращала их в 30S ча стицы диаметром 20 нм, которые являются, таким образом, мономе ром поличастиц. Действительно, электронная микроскопия с напы лением показала, что 30S частицы представляют собой мономеры, 45S частицы - димеры, 70S части цы - пентамеры, а 90-100S пик содержит поличастицы, состоя щие из 9 мономеров. Определение размеров РНК, выделенной из разных пиков, показало, что во всех случаях на мономер приходится отрезок РНК длиной примерно 700 нуклеотидов. Это согласуется с тем, что плавучая плотность всех пиков гяРНП оди накова (рис. 4). Таким образом, гяРНП пред ставляют собой цепи сходных РНП-частиц, соединенных мо стиками РНК, которые наиболее чувствительны к обработке рибо нуклеазой [15]. Чтобы лучше понять струк туру гяРНП-частиц, мы изучили структуру 30S мономе ра. Интенсивная обработка рибонуклеазой полностью разру шает РНК 30S частиц, что пред полагает ее поверхностную лока лизацию. Далее белки 30S частиц метили I125 и обрабатывали 30S частицы 2 М NaCl, который вы зывает диссоциацию РНК и белка. При ультрацентрифугировании вся гяРНК оставалась в верхних фракциях, тогда как белок откры вался в том же 30S пике, несмотря на удаление РНК. Плавучая плот ность 30S частиц соответственно падала до 1.34 г/см3 [1-6] (рис. 5). При смешивании белковых частиц с гяРНК и удалении диа лизом 2 М NaCl происходит ре конструкция гяРНП-частиц, не отличимых от исходных по целому ряду тестов. При элек тронной микроскопии исходные 30S частицы, белковые частицы и реконструированные гяРНП выглядят одинаково (рис. 5). При реконструкции в присут ствии гяРНК размером около 1.4 тыс. нуклеотидов образуются димерные гяРНП [15]. Белковые 30S частицы были названы ин формоферами (носители инфор мационной РНК), но этот термин в литературе не удержался. Информоферы представляют собой белковые комплексы, содер жащие примерно 20 белков с мо лекулярным весом около 40 кДа, относящихся, по данным других авторов, к шести разным типам [16]. Был сделан вывод, что ядер ные гяРНП - это длинные гяРНК, регулярно намотанные на поверх ность серии похожих или оди наковых белковых глобулярных частиц. Подобная структура при водит к сильной компактизации длинных гяРНК, в то же время оставляя ее доступной для взаи модействия с более специфичны ми факторами, участвующими в процессинге и экспорте РНК. Интересно, что сходный прин цип организации позднее обна ружили и в нуклеосомах хрома тина [17]. ДАЛЬНЕЙШЕЕ РАЗВИТИЕ ИССЛЕДОВАНИЙ мРНК В ИНСТИТУТЕ БИОЛОГИИ ГЕНА РАН Автор статьи далее переключил ся на другие проблемы, связанные с организацией генома (открытие и характеристика мобильных ге нетических элементов в клетках животных) и хроматина. Однако изучение регуляции синтеза гяРНК и экспорта мРНК актив но развивается в организованном 25 лет назад Институте биологии гена РАН, где является основным направлением. Другое важное направление, разрабатываемое в Институте, - новые подходы к терапии рака. В этом направле нии сейчас участвует автор. Ниже кратко указаны некоторые клю чевые исследования, связанные с мРНК. Прежде всего, были откры ты новые свойства инсуляторов, важных цис-элементов в регу ляции транскрипции. Оказалось, что их функционирование во мно гом зависит от способности оди наковых инсуляторов прочно связываться между собой [18, 19]. Это их свойство определя ется димеризацией ряда бел ков, входящих в состав инсуля торных комплексов, например, белка Mod(mdg4), открытого в Институте [20] (рис. 6). В отличие от энхансеров, инсу ляторы обладают полярностью: они взаимодействуют, только на ходясь в одинаковой ориентации. Поэтому в зависимости от ори ентации инсуляторов в геноме конфигурации петель ДНК, об разуемых в результате их взаимодействия, различаются, что, в свою очередь, определяет, ка кой ген будет активирован [21, 22] (рис. 6). Были открыты сверхдальние взаимодействия в геноме [23, 24]. Они достигают десятков милли онов пар нуклеотидов и могут происходить даже между него мологичными хромосомами. Они зависят от взаимодействия меж ду инсуляторами и могут вести к активации промотора энхансе ром. Вырезание одного из инсу ляторов ведет к полной утрате сверхдальнего взаимодействия, что отражается в инактивации зависящей от него транскрипции (рис. 7). Наконец, было установлено, что инсуляторы способны взаи модействовать с промоторами (с низкой избирательностью), акти вируя их, и с энхансерами (более избирательно). Поэтому инсуля тор, расположенный между эн хансером и промотором, может взаимодействовать с обоими, об разуя непродуктивный комплекс. Это может объяснять хорошо из вестное разобщающее действие инсулятора [25, 26] (рис. 8). Были открыты два новых бел ка, играющих важную роль в кон троле транскрипции гяРНК и по следующих этапах формирования и экспорта мРНК, Е(у)2/ENY2 и SAYP [27, 28]. SAYP связывает белковый инициирующий комплекс TFIID и ремоделирующий хроматин комплекс SWI/SNF в единый суперкомплекс. Нокдаун SAYP блокирует рекрутирование TFIID и SWI/SNF на промото ре и подавляет транскрипцию многих генов. Можно предполо жить, что объединение комплек сов позволяет TFIID, как только вызванное SWI/SNF движение нуклеосом вдоль ДНК приведет к освобождению промотора от ну клеосом, сразу с ним связаться [29] (рис. 9). Было у с т а н о в л е н о , что E(y)2/ENY2 является многофунк циональным белком. Он входит в состав комплекса SAGA, его модуля DUB, участвуя в акти вации инициации транскрипции [30]. ENY2 также входит в белко вый комплекс ТНО, участвующий в элонгации гяРНК, связываю щийся с гяРНП и вовлеченный в экспорт ряда мРНК. ЕNY2 - важный компонент белкового комплекса AMEX дрозофилы, связывающийся с гяРНП и игра ющий ключевую роль в экспор те многих мРНК. Нокдаун ENY2 с помощью РНК-интерференции ведет к полному блоку транспор та мРНК из ядра в цитоплазму. Вся мРНК задерживается в ядре [31] (рис. 10). Наконец, ENY2 вхо дит в состав некоторых инсуля торных комплексов, выполняя при этом барьерную функцию инсулятора [32]. Это только часть работ Института по контролю синтеза и экспорта мРНК. Таким образом, ранние рабо ты по выявлению информацион ной РНК у эукариот продолжают успешно развиваться.

Об авторах

Г. П. Георгиев

Автор, ответственный за переписку.
Email: georgiev@igb.ac.ru
Россия

Список литературы

Дополнительные файлы