Моделирование структуры комплексов потенциал-управляемых калиевых каналов с пептидными блокаторами: методы и результаты

Полный текст

ВВЕДЕНИЕ Калиевые (K+) каналы - это порообразующие транс мембранные белки, регулирующие различные био логические процессы за счет контроля потоков ионов калия через клеточную мембрану. Калиевые кана лы экспрессируются во многих тканях и принимают участие в разнообразных биологических функциях, таких, как поддержание потенциала покоя мембра ны, контроль сердечного и нервного возбуждения, высвобождение нейротрансмиттеров, мышечное со кращение и секреция гормонов [1, 2]. Калиевые ка налы играют важную роль в диагностике и лечении различных заболеваний [3-6]. Калиевые каналы человека включают в себя Ca2+-активируемые (KCa), каналы входящего вы прямления (KIR), двухпоровые каналы утечки (K2p), а также потенциал-управляемые (KV) калиевые ка налы. Наибольшее семейство формируют КV-каналы, включающие в себя 12 подсемейств: Shaker/KV1 (KCNA), Shab/KV2 (KCNB), Shaw/KV3 (KCNC) и др. Они обладают сходным строением и являются (за ис ключением подсемейств KV4-KV9) гомотетрамерами с осью симметрии 4-го порядка. Механизмы актива ции KV-каналов рассмотрены в обзоре [7]. Развитие ряда заболеваний сопровождается нару шением нормального функционирования КV-каналов определенного типа, а в их терапии используют коррекцию активности данных каналов. Например, к таким патологиям относятся нарушения мембран ной возбудимости и функционирования нейронов и сердечно-сосудистой системы [8]. Эпизодическая атаксия-1, аутосомно-доминантное неврологическое расстройство человека, связано с мутациями остатка V408 потенциал-зависимого калиевого канала KV1.1 (KCNA1) [9]. С мутациями генов KCNQ2 и KCNQ3, кодирующих потенциал-управляемые каналы KV7.2 и KV7.3, связано такое генетическое заболевание, как доброкачественные семейные неонатальные судороги [10]. Анализ экспрессии генов на разных стадиях развития болезни Альцгеймера показыва ет, что усиление экспрессии KV3.4 (KCNC4) и нару шение регуляции KV3.1 (KCNС1) изменяет потоки ионов калия в нейронах, что приводит к изменению синаптической активности и может лежать в осно ве нейродегенерации [11]. С нарушениями функций потенциал-управляемых калиевых каналов (KV7.1 (KCNQ1), KV11.1 (KCNH2), KCNE1, KCNE2) связыва ют возникновение такого сердечно-сосудистого забо левания, как синдром удлиненного интервала QT [12]. Возникновение синдрома Бругада связывают с му тациями гена KCND3, кодирующего канал KV4.3 [13]. Исследование экспрессии калиевых каналов у па циентов с острым коронарным синдромом выявило роль канала KV1.3 [14]. Ингибиторы KV1.3 подавляют пролиферацию Т-лимфоцитов (а именно, эффектор ных клеток памяти ТEM), что способствует улучше нию состояния больных рассеянным склерозом, са харным диабетом типа 1, ревматоидным артритом, псориазом и бронхиальной астмой [15]. Блокирование канала KV2.1 оказывает терапевтическое действие при сахарном диабете типа 2 [16]. Токсины из ядов скорпионов, пауков, змей, конусов и морских анемо нов являются природными пептидами-блокаторами, обладающими высоким терапевтическим потенци алом. Эти пептиды классифицируют по механизму действия: - блокаторы поры, которые связываются с внекле точной стороны в области поры канала и препятству ют прохождению через нее ионов калия (пептиды из яда скорпионов и анемонов); - пептиды, которые взаимодействуют с VSD доменом, стабилизируют конформацию с закрытой порой и препятствуют открыванию канала (пептиды из яда тарантулов). В настоящее время установлены структуры лишь нескольких комплексов KV-каналов с блокаторами [17, 18], а недостаток экспериментальных данных об особенностях строения таких комплексов активно восполняется за счет разработки и применения мето дов молекулярного моделирования. Пептидные блокаторы обладают высоким срод ством (пико- и наномолярные константы диссоциации комплексов), но часто сразу к нескольким близко родственным KV-каналам. Поэтому работы в области фармацевтического использования токсинов направ лены на повышение их селективности путем оптими зации структуры. Одним из примеров является разра ботка синтетического производного пептида актинии ShK-186, блокирующего потенциал-управляемый калиевый канал KV1.3 при пикомолярных концен трациях и проходящего в настоящее время стадию 1B клинических исследований в качестве средства против аутоиммунных заболеваний [19]. Другое пре имущество селективных токсинов - возможность их применения для идентификации каналов, изучения распределения каналов в клетках и тканях, а также для выяснения роли каналов в развитии различных патологий. Большую роль в направленной разработке селективных блокаторов призваны сыграть методы молекулярного моделирования. В данном обзоре рассмотрено современное состо яние проблемы изучения комплексов KV-каналов с блокаторами поры методами компьютерного мо делирования, включая предсказание структур этих комплексов, расчет интерфейсов взаимодействия и энергии связывания. Общий обзор теории и мето дов расчета, применимых к моделированию различ ных ионных каналов, а также примеры использова ния методов молекулярного моделирования для ряда ионных каналов, отличных от семейства KV, выходят за рамки данного обзора, а их рассмотрение может быть найдено в недавно опубликованной работе [20]. СТРУКТУРЫ KV-КАНАЛОВ, ПЕПТИДНЫХ БЛОКАТОРОВ ПОРЫ И ИХ КОМПЛЕКСОВ Анализ взаимодействий между калиевыми каналами и токсинами с помощью компьютерного моделиро вания значительно облегчается благодаря установ лению их пространственной структуры методами рентгеноструктурного анализа (РСА), спектроско пии ядерного магнитного резонанса (ЯМР) и элек тронной микроскопии. В настоящее время известны структуры большого числа пептидных блокаторов поры, 12 калиевых каналов [21] и двух комплексов калиевых каналов с блокатором харибдотоксином. Экспериментальные данные о структурах калиевых каналов и их комплексов существенно ограничены из-за известных сложностей в выделении, очистке и кристаллизации мембранных белков. Эти сложно сти придают дополнительную ценность каждой рас шифрованной структуре, проливающей свет на ме ханизмы активации каналов, их функционирование и особенности взаимодействия с блокаторами [22]. Структуры пептидных блокаторов калиевых каналов Большинство пептидных блокаторов KV-каналов найдено в ядах скорпионов и отнесено к семейству α-KTx. Эффективными блокаторами KV-каналов являются также пептид ShK из морского анемона и дендротоксины (α-DTX, DTX-I, DTX-K, δ-DTX) из яда мамбы. Отдельные пептиды способны бло кировать не только KV-, но и KCa-каналы (табл. 1). Методом ЯМР или реже с помощью РСА получена пространственная структура многих блокаторов (табл. 1), что создает основу для моделирования их комплексов с калиевыми каналами. Блокаторы семейства α-KTx (известно более 50 структур) обладают сходным α/β-типом уклад ки (рис. 1, 2), включающим α-спираль, а также два или три β-тяжа. Отличия в структурах связаны с различающейся длиной полипептидной цепи (29-40 остатков) и конкретным аминокислотным составом (рис. 2), который влияет на размер α-спиральных и β-структурированных участков. Пептиды α-KTx содержат три или четыре дисульфидных связи, делающих их структуру конфор мационно жесткой. Система дисульфидных связей постоянна внутри каждого подсемейства за исклю чением подсемейства α-KTx6. Для пептидов α-KTx6 предпочтительно образование дисульфидных связей между остатками цистеина 1 и 5, 2 и 6, 3 и 7, 4 и 8, как, например, в токсине Pi4 (рис. 1, 2). Однако в мау ротоксине (рис. 1, 2) и спинотоксине (α-KTx6.13) свя зи образуются между остатками цистеина 1 и 5, 2 и 6, 3 и 4, 7 и 8. Предполагается, что в этих пептидах воз можно переключение дисульфидных связей без за метного изменения структуры, так как атомы серы в остатках 3, 4, 7 и 8 находятся близко друг к другу [41]. При рН 7 токсины α-KTx имеют суммарный по ложительный заряд, который варьирует от +2 до +8, а отрицательно заряженные остатки встречаются преимущественно в N-концевой половине пептида (рис. 2). Исключение составляют токсины подсемей ства α-KTx8, в частности BmP01 [41] с суммарным зарядом -2 (табл. 1, рис. 2), активный в отношении канала KV1.3 [42]. Токсин ShK и дендротоксин DTX-K по размеру и наличию дисульфидных мостиков схожи с токси нами из яда скорпиона, но существенно отличаются структурой (рис. 1, 2). Экспериментальные структуры калиевых каналов Бактериальный канал KcsA - первый калиевый ка нал, структура которого была определена методом РСА (табл. 2). Канал имеет форму конуса, образо ванного четырьмя α-субъединицами, состоящими из двух трансмембранных α-спиралей M1 и M2 и по ровой области P, которая, в свою очередь, содержит три различающихся фрагмента: P-петлю, P-спираль и селективный фильтр (СФ, рис. 3). СФ образован атомами кислорода главной цепи аминокислотных остатков, входящих в характерный для всех кали евых каналов мотив TVGYG (в некоторых каналах TIGYG или SVGFG), имеет протяженность всего 12 Å и диаметр, точно соответствующий ионам калия. Хотя канал KcsA не является потенциал-управляе мым, в поровой области он обладает высокой гомоло гией с KV-каналами эукариот (рис. 4). Известно около 60 различных структур канала KcsA, отличающихся друг от друга состоянием (от крытая или закрытая конформация), связанными с каналом низкомолекулярными лигандами, ионами в селективном фильтре (K+, Cs+, Rb+, Tl+), а также мутациями и гибридными вставками, призванными имитировать поровые домены эукариотических ка лиевых каналов. Во всех этих структурах конформа ция P-петель и строение интерфейса потенциального взаимодействия с блокаторами поры остаются прак тически неизменными. Еще один прокариотический калиевый канал, кри сталлографическую структуру которого удалось по лучить, - потенциал-управляемый канал KVAP ар хей (табл. 2). Главное отличие этого канала от KcsA состоит в более сложной структуре α-субъединиц, которые содержат шесть спиралей (S1-S6). Спирали S5 и S6 четырех субъединиц, подобно спиралям M1 и M2 канала KcsA, собраны в конусообразную струк туру и образуют пору канала, а спирали S1-S4 фор мируют потенциал-чувствительный домен (VSD домен). В настоящее время известно лишь несколь ко структур эукариотических калиевых каналов (табл. 2), первой из которых стала структура KV1.2 [43], улучшенная позднее [44]. Как и в случае канала KVAP, α-cубъединицы KV1.2 имеют в своем составе шесть спиралей (S1-S6), образующих пору кана ла (спирали S5-S6), и VSD-домен (S1-S4). В улуч шенной структуре KV1.2 дополнительно различимы петли S1-S2, S2-S3 и S3-S4, соединяющие спирали VSD-домена, а также боковые цепи ряда остатков спиралей S2, S4 и петли S5-P. Анализ структуры KV1.2 выявил значительное сходство в строении по рового домена этого канала и KVAP, и KcsA (рис. 4). Так, структура СФ и примыкающих к нему остатков характеризуется удивительной консервативностью (среднеквадратичное отклонение положения Сα атомов остатков 65-85 KcsA от положения соответ ствующих им остатков KV1.2 составляет менее 0.8 Å) при сходстве последовательностей, составляющем 65%. В то же время поровые домены KV1.2 и KcsA не много отличаются по длине и конформации P-петель (рис. 3), а также по конформации трансмембран ных спиралей ближе к цитоплазматической стороне мембраны. Сравнительный анализ кристаллогра фических структур канала KV1.2 показал, что кон формация P-петель определена неоднозначно: наи более часто реализуется конформация, характерная для структур с pdb-кодами 2A79 и 3LNM, а конфор мация, наблюдаемая в структуре с pdb-кодом 3LUT, уникальна. При высоком сходстве поровых доменов KV1.2 и KVAP структура их VSD-доменов значительно от личается. Предполагается, что эти отличия связаны с искажением структуры, возникающим при выделе нии и кристаллизации канала KVAP [43]. Структуры других эукариотических KV-каналов пока не определены, но на основании высокой гомо логии предполагается, что структура их поровых до менов сходна с каналом KV1.2. Экспериментальные структуры комплексов калиевых каналов с пептидными блокаторами Первая структура комплекса калиевого канала с пептидным блокатором была определена методом ЯМР для модифицированного KcsA и харибдотокси на (табл. 2) благодаря использованию уже извест ных индивидуальных структур канала и блокатора [17]. В структуру природного KcsA, не связывающе го известные пептидные блокаторы эукариотиче ских калиевых каналов, были введены три мутации (Q58A, T61S, R64D), повысившие сродство KcsA к ха рибдотоксину и усилившие тем самым его сходство с эукариотическими каналами семейства Shaker. Еще три мутации (F103Y, T107F, L110V) были вве дены в центральную полость для придания сходства с каналом KV11.1 человека. Анализ спектров ЯМР показал, что связывание харибдотоксина приводит к структурным перестройкам участков канала, от ветственных за взаимодействие, а расположение спиралей M1 и M2 остается неизменным. Главная цепь токсина не претерпевает существенных изме нений в процессе связывания. Доказано связывание K27 харибдотоксина с порой канала, а также описан интерфейс взаимодействия. Недавно методом РСА получили структуру ком плекса гибридного канала KV1.2-2.1 с харибдоток сином (табл. 2, рис. 5). Гибридизация затронула VSD-домен: в канале KV1.2 «лопасть» сенсора потен циала (voltage-sensor paddle; участок S3b-S4 спира ли) была заменена на аналогичную от канала KV2.1, как уже опробовано ранее [45]. Анализ структуры комплекса показал, что ни канал, ни токсин не пре терпели заметных изменений структуры при связы вании [18]. Рассмотрение структур комплексов харибдотокси на с каналами (модифицированным KcsA и гибрид ным KV1.2-2.1) показывает, что значительное число взаимодействий реализуется между аминокислотны ми остатками токсина и петлями каналов. Заметим, что Р-петли являются наиболее вариабельным фраг ментом КV-каналов и, возможно, что именно этой ва риабельностью обусловлены отличия в силе взаимо действий блокатора с различными каналами. МОДЕЛИРОВАНИЕ КАЛИЕВЫХ КАНАЛОВ И ИХ КОМПЛЕКСОВ ПО ГОМОЛОГИИ В ситуации, когда известна трехмерная структура лишь нескольких калиевых каналов и их комплексов с пептидными блокаторами, методы молекулярно го моделирования важны и востребованы для ана лиза структурных особенностей всего многообразия KV-каналов и комплексов. Основным вычислитель ным подходом здесь является моделирование по го мологии [46], которое состоит в построении трех мерной модели белка с неизвестной структурой на основе данных о структуре гомологичного белка. Моделирование по гомологии включает в себя не сколько этапов [47]: - поиск потенциальных шаблонов - белков с из вестной структурой, максимально гомологичных моделируемому белку, например, с помощью веб сервисов BLAST [48] или FASTA [49]; - выравнивание последовательностей шаблона и моделируемого белка, например, с помощью веб сервиса CLUSTALW [50]; - построение структурной модели неизвестно го белка по шаблону путем сохранения одинаковых остатков, замены различающихся и достройки фраг ментов, отсутствующих в шаблоне, например, с по мощью программы Modeller [51]. Отметим, что использование веб-сервиса Swissmodel [52] позволяет выполнить все эти три этапа ав томатически. Необходимое условие применимости моделирова ния по гомологии - значительное (не ниже 20-30%) сходство последовательностей моделируемого белка и шаблона [53]. Поровые домены калиевых каналов идеально соответствуют этому условию: сходство KV-каналов в этом домене достигает 80% и более, а основные различия локализованы в небольшой по размеру поровой петле. Расшифровка структу ры канала KV1.2-2.1 в комплексе с харибдотоксином [18] подтвердила данные других экспериментальных методов о том, что VSD-домен не участвует в связы вании блокаторов поры. Поэтому при моделировании комплексов блокаторов с КV-каналами ограничива ются рассмотрением только поровых доменов. Сходство последовательностей поровых доменов KV-каналов и бактериального канала KcsA достигает 30%, поэтому структура последнего также исполь зуется в качестве шаблона для моделирования по ровых доменов KV-каналов и их комплексов с блока торами [55, 69, 70, 72] наряду с некоторыми другими структурами (табл. 2). Обоснованием такого подхода к моделированию служат, в том числе, эксперимен тальные данные, показывающие, что гибридные ка налы KcsA-KV1.x (KcsA, в котором P-петля заменена гомологичной петлей канала KV1.х, x = 1, 2, 3, 6) со храняют специфический профиль высокоаффинного связывания блокаторов, характерный для каналов KV1.х [73-75]. Моделирование по гомологии, как правило, сопро вождается дальнейшим изучением структуры по лучаемых моделей с помощью методов броуновской динамики (БД), молекулярного докинга или молеку лярной динамики (МД). БРОУНОВСКАЯ ДИНАМИКА Метод БД - это разновидность метода стохастиче ской динамики, рассматривающий движение моле кул как твердых тел под действием внешних сил, сил трения, имитирующих взаимодействие с моле кулами растворителя, и случайных сил. БД широко применяется для анализа ионного транспорта [76, 77] и ограниченно - для моделирования взаимодействий токсинов с каналами [78, 79]. При этом используют приближение, в котором каналы и блокаторы полага ют жесткими структурами, растворитель - неявным, а мембрану - идеализированным диэлектрическим слоем [20]. Расчеты БД в данном приближении по зволяют значительно снизить требования к вычисли тельным ресурсам и достичь таких времен расчета, на которых проявляются макроскопические эффек ты [80]. Расчет методом БД связывания токсина Lq2 (табл. 1) с модифицированным каналом KcsA по зволил построить модель комплекса, выявить взаи модействующие с каналом аминокислотные остатки пептида и описать характер их взаимодействий [78]. Поскольку в методе БД структуры блокатора и ка нала считаются жесткими, то для учета конформа ционной подвижности блокатора использовали все 22 варианта структуры Lq2, представленные в pdb файле. Один из этих вариантов обеспечил получение модели комплекса, хорошо соответствующей экспе риментальным данным. Подвижность канала в рас четах не учитывали. Более совершенный способ учета конформацион ной подвижности в расчетах БД - их сочетание с рас четами МД, как это сделано при анализе комплексов канала KV1.3 с аджитоксином, харибдотоксином, ка лиотоксином, маргатоксином и ноксиустоксином [79]. Сравнение расчетных значений энергии электроста тического взаимодействия в комплексах и логариф мов констант диссоциации комплексов выявило их высокую корреляцию (R2 = 0.60). Отметим, что в слу чае калиотоксина обнаружено несоответствие этой корреляции, которое можно объяснить использовани ем некорректной структуры пептида (pdb-код 1KTX), значительно отличавшейся от структур гомологич ных пептидов аджитоксина и OSK1. Уточненные структуры калиотоксина (pdb-коды 1XSW, 3ODV), полученные позже, не имеют такого отличия. МОЛЕКУЛЯРНЫЙ ДОКИНГ Молекулярный докинг - метод, цель которого со стоит в поиске наиболее достоверной ориентации и конформации лиганда в сайте связывания белка мишени, широко используется для моделирования комплексов блокаторов с калиевыми каналами [38, 62, 80]. При выполнении расчетов белок-белкового до кинга одна из молекул фиксируется в пространстве, а вторая пристыковывается к ней с разных сторон и в разных ориентациях. Для каждой конфигура ции полученного комплекса производят расчеты оценочной функции, основанной на комплементар ности свойств поверхности, электростатических вза имодействиях, ван-дер-ваальсовском отталкивании, энергии десольватации, энергии внутренних напря жений (деформации валентных связей), водородных связей и взаимодействия ароматических групп. Для молекулярного докинга необходимо примене ние одной из специализированных программ, таких, как AutoDock (http://autodock.scripps.edu/) [81], RosettaDock [82], BiGGER [83], HADDOCK (http:// haddock.science.uu.nl/) [84] или ZDOCK (http:// zdock.umassmed.edu/) [85]. Наиболее часто и успеш но структуры комплексов канал-блокатор предска зывают с использованием трех последних программ [37, 86, 87]. Особенностью программы HADDOCK является ее ориентация на моделирование взаимодействия боль ших и гибких пептидных лигандов. Эту программу применяли при создании универсального протоко ла докинга для предсказания профилей селектив ности токсинов семейства α-KTx [87] и добились су щественных успехов при моделировании структуры комплексов, но традиционная проблема всех задач молекулярного докинга - выбор наиболее правиль ной из предсказываемых конформаций - была реше на не полностью, что указывает на несовершенство используемых оценочных функций. Молекулярный докинг может использоваться и для учета конформационной подвижности ток синов. Так, в работе по улучшению селективности связывания аналогов токсина Css20 [58] проанализи ровали более миллиона решений молекулярного до кинга, выполнив визуальное рассмотрение 2000 луч ших решений. Недостатком такого подхода, помимо очевидной трудоемкости, является отмеченное выше несовершенство используемых оценочных функций: методы молекулярного докинга позволяют получить сотню лучших решений, среди которых гарантиро ванно есть правильное, но не позволяют однозначно распознать его. Более оптимально проводить молеку лярный докинг не столь масштабно, но сопровождать его оптимизацией получаемых решений с помощью МД, а константы связывания вычислять с помощью расчетов свободной энергии [20]. МОЛЕКУЛЯРНАЯ ДИНАМИКА В расчетах молекулярной динамики временная эво люция системы взаимодействующих атомов или ча стиц отслеживается интегрированием их уравнений движения. Точность расчетов МД зависит от выбора так называемого силового поля, т.е. математических функций и их параметров, используемых для опи сания потенциальной энергии системы частиц. Функции силового поля и наборы параметров полу чают из экспериментальных работ и квантово-меха нических расчетов. При правильном использовании существующие в настоящее время силовые поля по зволяют получать удивительно точные результаты [88]. Полноатомные силовые поля, такие, как OPLSAA и различные варианты CHARMM, учитывают все типы атомов в системе. Альтернативно, силовые поля с объединенными атомами, такие, как GROMOS и OPLS-UA, рассматривают тяжелые неполярные атомы (углерод, сера) и связанные с ними атомы во дорода в качестве единых центров взаимодействия [89]. При моделировании KV-каналов наиболее часто используют программный пакет NAMD [90] в соче тании с силовым полем CHARMM [91], включая его варианты CHARMM22, CHARMM27 и CHARMM36 (табл. 3). Отметим, что поле CHARMM27 оптимизи ровано для расчетов ДНК, РНК и липидов, а в ком бинации с полем CHARMM22 - для исследования ДНК-белковых взаимодействий. Хотя применение CHARMM27 для анализа белок-белковых взаимо действий представляется не совсем оптимальным, результаты расчета свободной энергии связывания, выполненные с его применением [60, 66, 92], хоро шо согласуются с экспериментальными значениями (табл. 3). В CHARMM36 по сравнению с CHARMM22 введены изменения, улучшающие исследование кон формационного пространства при сворачивании бел ков, их сборке в комплексы и функционально значи мых конформационных изменениях [93]. Современные МД-расчеты комплексов кана лов с токсинами позволяют учитывать взаимодей ствия с липидами мембраны. При этом расчетная структура комплекса токсинов, связывающихся с VSD-доменом каналов, зависит от липидного со става мембраны [94]. При моделировании комплек сов с пептидными блокаторами поры не обязательно учитывать липидный бислой в явном виде [55]. Это подтверждается хорошим согласием между экспери ментальными данными и результатами расчетов сво бодной энергии образования таких комплексов, оп тимизированных методом МД [95, 96]. Обоснованный отказ от учета липид-белковых взаимодействий при моделировании комплексов значительно умень шает требования к вычислительным ресурсам, по зволяя увеличить длину рассчитываемых МД тра екторий и полноту исследования конформационного пространства. Еще один прием, позволяющий сни зить ресурсоемкость расчетов, - применение моде ли неявного растворителя, в частности обобщенной борновской модели (generalized Born solvation model). Вне зависимости от используемой модели раство рителя расчеты МД в настоящее время проводят с длиной траектории от 15-20 нс [68, 92] до 40-50 нс [62, 97]. В ряде случаев для расчета и анализа комплексов токсинов с каналами используют метод направлен ной МД. Метод заключается в расчете МД при по степенном уменьшении расстояния между одной или несколькими парами остатков, взаимодействие которых при образовании комплекса представляется наиболее существенным. Достоинство этого метода состоит в учете экспериментальных данных о вза имодействующих остатках, что позволяет считать образуемые контакты более точными. Метод направ ленной МД хорошо зарекомендовал себя при анализе связывания мауротоксина с каналом KV1.2 [92], а так же маргатоксина и хонготоксина с KV1.3 [62]. РАСЧЕТ ЭНЕРГИИ КОМПЛЕКСА КАНАЛ-ТОКСИН Для оценки достоверности структуры комплексов, полученных в результате моделирования, применя ют расчеты свободной энергии связывания ΔG. Такие расчеты имеют фундаментальное значение для тео ретической оценки возможности осуществления мно гих важных биологических процессов, в том числе формирования прочных комплексов лигандов с ре цепторами и конформационных изменений в них [98]. Свободную энергию взаимодействия калиевых ка налов с токсинами чаще всего оценивают с исполь зованием метода расчета потенциала средней силы (ПСС), включающего получение набора конформаций методом зонтичной выборки [99]. Во многих случаях этот метод позволяет получить значения ΔG, кото рые согласуются c экспериментальными данными (табл. 3), что свидетельствует о хорошей точности численного моделирования и применимости такого анализа для конструирования пептидных блокаторов с заданными свойствами. В работе [59], где рассчи танное значение ΔG превышало измеренное более чем в 2 раза, это расхождение объяснено различиями в ионной силе растворов, использованных для рас четов и в эксперименте. Альтернативно причина рас хождения может быть связана с меньшей точностью расчетов на основе силового поля OPLS-AA по срав нению с вариантами поля CHARMM (табл. 3). Менее распространенный метод расчета свободной энергии - MM-PBSA (molecular mechanics/Poisson-Boltzmann surface area), сочетает использование мо лекулярной механики для расчета потенциальной энергии молекул в вакууме и решение уравнения Пуассона-Больцмана для расчета свободной энер гии сольватации. Метод реализован в программных пакетах AMBER [100] и GROMACS [101] и примени тельно к комплексам калиевых каналов с блокатора ми качественно согласуется с экспериментальными данными [102]. ПРИМЕНЕНИЕ МЕТОДОВ МОЛЕКУЛЯРНОГО МОДЕЛИРОВАНИЯ Моделирование комплексов KV-каналов с природны ми и модифицированными пептидными блокаторами позволяет глубже понять структурные особенности и ключевые принципы межмолекулярных взаимо действий в них, детально описать интерфейсы взаи модействий, объяснить наблюдаемые интенсивность и спектр активностей блокаторов. Моделирование по гомологии с использованием шаблонов мауротоксина (табл. 1) и KcsA позволило объяснить экспериментальные результаты по свя зыванию токсина Pi1 и его мутантов с каналом KV1.2 [86]. Выполнив молекулярный докинг, обнаружили важную роль основных остатков R5, R12, R28 и K31 пептида в стабилизации комплекса. Аналогичный подход использован для определе ния интерфейса взаимодействия канала KV1.2 с ко батоксином (табл. 1) и его искусственным аналогом ACoTx1, отличающимся заменами T7P и D9Q [37]. Установили, что направление дипольного момента токсина не является определяющим для объяснения его селективности, и заключили, что молекулярное моделирование облегчает разработку более аффин ных и/или селективных аналогов существующих блокаторов. Сравнительный анализ результатов молекуляр ного докинга токсина Vm24 и ряда других токсинов позволил найти объяснение высокой селективности Vm24 в отношении канала KV1.3 [38]. Эта селектив ность, как полагают, связана с образованием плотных контактов N-конца Vm24 с каналом, что нехарактер но для других токсинов семейства α-KTx (рис. 2). С использованием молекулярного докинга для предсказания структуры комплекса ShK с кана лом KV1.3 и молекулярной динамики для оптимиза ции этой структуры обнаружены два вероятных по ложения блокатора в комплексе [55]. В первом случае СФ канала закрывался остатком K22 токсина, во вто ром - остатком R24. На основе расчета методом MMPBSA изменения ΔG при замене некоторых остатков в молекуле токсина на аланин и сопоставления рас четов с экспериментальными данными о константах диссоциации комплексов предпочтение было отдано второму варианту с участием R24. Для исследования образования комплексов ка налов с токсинами предложен метод анализа цик ла мутаций (mutant cycle analysis), разработанный при картировании взаимодействий канала Shaker с аджитоксином [103]. Интуитивно понятно, что влия ние одновременной замены остатка токсина и остатка канала на константу диссоциации комплекса зави сит от того, взаимодействуют ли эти аминокислотные остатки, и может быть описано коэффициентом вза имосвязи. Учет экспериментальных данных о взаи модействующих остатках позволяет смоделировать структуру комплекса с помощью молекулярного докинга. По мере развития алгоритмов расчета ΔG метод анализа цикла мутаций находит все более ши рокое применение в молекулярном моделировании комплексов блокаторов с калиевыми каналами [55, 57, 95, 102, 104]. В ходе изучения взаимодействия мауротоксина с каналом KV1.2 [105] методами молекулярного до кинга и МД были рассмотрены несколько возможных ориентаций токсина в комплексе. Расчеты методом MM-PBSA изменений ΔG при введении аланино вых замен в сопоставлении с экспериментальными данными позволили установить наиболее вероят ную ориентацию токсина и идентифицировать важ ные для формирования комплекса аминокислотные остатки токсина (K23, I25, Y32) и канала (R254, F359, P360, D379, V381, T383). Изучение связывания блокатора ADWX-1 с ка налами KV1.1 и KV1.3, поддержанное молекулярным моделированием структуры их комплексов [106], по зволило предложить три варианта расположения поровых петель при взаимодействии с блокаторами: открытое, полуоткрытое (полузакрытое) и закры тое. В первом случае токсин взаимодействует лишь с остатками, окружающими СФ, и петли не влияют на связывание. Именно так, согласно [105], форми руется комплекс мауротоксина с KV1.2. Во втором случае петли оказывают небольшое влияние на свя зывание, как, например, в комплексах ADWX-1 с каналами KV1.1 и KV1.3. В третьем случае и петли, и область вокруг СФ определяют интенсивность и се лективность взаимодействия с токсином. Показано [60], что электростатические взаи модействия в комплексах харибдотоксина, OSK1 и ShK с каналом KV1.3 превалируют над ван-дер ваальсовыми, а ключевыми аминокислотными остат ками токсинов в этих взаимодействиях являются лизин и аргинин: K27 и R25 у харибдотоксина, K27 и R24 - у OSK1, а также K22 и R11 - у ShK (рис. 2). Анализ энергии связывания, выполненный посред ством расчета ПСС, дал значения, согласующиеся с экспериментальными данными (табл. 3). Высокая ресурсоемкость расчетов, необходимая для обеспе чения их точности, сдерживает широкое применение численного анализа энергии связывания и требует разработки более эффективных вычислительных процедур. Отметим, что отличия моделей комплексов ShK с KV1.3, полученных в работах [55, 62], требуют проведения дополнительных исследований. Применение МД для изучения конформационных изменений в гибридном канале KcsA-KV1.3 при вза имодействии с калиотоксином [72] позволило постро ить структурную модель комплекса и выдвинуть гипотезу об участии в связывании токсина остатков Y78 и D80 канала, которое сопровождается изме нением их ориентации. Эта гипотеза подтверждена данными спектроскопии ЯМР. На раннем этапе изучения блокаторов калиевых каналов была выдвинута [107] и приобрела попу лярность гипотеза о том, что способность различных животных токсинов распознавать KV-каналы связа на с эволюционно-консервативной функциональной диадой, состоящей из лизина, взаимодействующе го с СФ и отстоящего от него на 6-7 Å гидрофобно го остатка (Tyr, Phe или Leu). В дальнейшем, в том числе и с применением методов молекулярного мо делирования, показали, что избирательность свя зывания токсинов с различными KV-каналами за висит от многих других аминокислотных остатков. Степень, в которой функциональная диада опреде ляет силу взаимодействия, также варьирует у раз ных токсинов и модулируется вкладом в комплек сообразование дополнительных аминокислотных остатков этих пептидов [108]. Результаты моле кулярного моделирования позволяют заключить, что интерфейсы взаимодействия токсинов с кана лами формируются сразу многими аминокислотами, создающими сложные системы связей. Эти системы существенно отличаются не только для пептидов из разных групп и подсемейств, но и токсинов с вы сокой гомологией. Повышение селективности блокаторов KV-каналов представляет актуальную задачу современной фар макологии, поскольку природные токсины зачастую имеют высокую аффинность сразу к нескольким типам каналов. Выявление достоверных отличий во взаимодействиях исследуемого токсина с род ственными КV-каналами, которое обеспечивают методы молекулярного моделирования, открывает возможность подбора аминокислотных замен, уси ливающих или ослабляющих сродство токсина к за данному каналу. Токсин Css20 характеризуется избирательностью связывания с каналами KV1.2 и KV1.3 по сравне нию с KV1.1 и KV1.4 [58]. Моделирование структуры комплексов показало, что аминокислотные остатки каналов KV1.2 и KV1.3, контактирующие с Css20, со средоточены в основном вокруг СФ и в Р-петле (семь из восьми остатков, различающихся в рассматрива емых каналах). Установлено, что остаток K28 важен для связывания с KV1.2 и KV1.3, а остатки Q11, I30, K33 и Y37 образуют благоприятные контакты толь ко с каналом KV1.2. Показано, что дополнительные благоприятные контакты с KV1.2 могут возникнуть при замене A19 и А20 токсина на положительно за ряженные Arg или Lys. Предполагается, что вве дение подходящих мутаций позволит повысить се лективность аналогов Css20 по отношению к одному из каналов KV1.2 и KV1.3. Методику, включающую проведение расчетов МД и ПСС, применили к изучению взаимодействия OSK1 с каналами KV1.1, KV1.2, KV1.3 и подбору ами нокислотных замен, способствующих увеличению се лективности этого блокатора по отношению к KV1.3 [65]. Сделан вывод, что замены K9S и S11R приве дут к улучшению связывания с KV1.3 при снижении связывания с KV1.1 и KV1.2. Расчеты констант свя зывания показали, что данные замены тысячекрат но повышают селективность связывания пептида с каналом KV1.3 и в 100 раз усиливают аффинность к этому каналу. Сайт-направленный мутагенез использовали для создания высокоаффинного по отношению к ка налу KV1.3 токсина ADWX-1 путем введения замен G11R, I28T и D33H в токсин BmKTX [102]. Остатки, подлежащие замене, определяли, исходя из анализа пространственной структуры комплекса ADWX-1 с KV1.3, полученной методами молекулярного моде лирования. Расчеты энергии связывания ADWX-1 и ряда его мутантов (R23A, F24A, K26A, N29A, T35A) выявили важную роль положительно заряженных остатков в узнавании токсином канала KV1.3. Кроме того, установлено, что замены R23A и F24A меша ют взаимодействию ключевого остатка K26 с порой канала. Экспериментально измеренная аффинность ADWX-1 к KV1.3 повысилась почти в 100 раз по срав нению с исходным BmKTx, а избирательность взаи модействия с каналом KV1.3 усилилась в 340 и более чем 105 раз по сравнению с каналами KV1.1 и KV1.2. ЗАКЛЮЧЕНИЕ Более 30 масштабных исследований, проведенных с применением компьютерного моделирования, по зволили существенно углубить наше понимание особенностей структуры калиевых каналов и их комплексов с токсинами. Вычислительные экспери менты обеспечили изучение механизмов взаимодей ствия и межмолекулярных контактов в комплексах пептидных блокаторов с KV-каналами, создали ос нову для изучения молекулярных основ селективно сти и сродства токсинов к каналам, заложили базис для направленной разработки блокаторов с задан ными свойствами. Наиболее распространенный алгоритм моделиро вания комплексов канал-блокатор включает модели рование структуры блокатора и канала по гомологии с уже существующими структурами, молекуляр ный докинг для предсказания структуры комплекса, а также проведение МД для релаксации структу ры комплекса и расчет свободной энергии связыва ния методом MM-PBSA или методом расчета ПСС. Конкретная реализация этого алгоритма, использу емое программное обеспечение и параметры расче тов варьируют с учетом конкретных решаемых задач и индивидуальных предпочтений исследователей. Прослеживается общая тенденция в отказе от бро уновской динамики при моделировании и переходе от моделей с неявным растворителем к явному учету растворителя, а также от расчета свободной энергии методом MM-PBSA к расчетам ПСС. Для успешного и быстрого расширения разра ботанных методов молекулярного моделирования на различные типы калиевых каналов желательно иметь структуры высокого разрешения представите лей этих каналов и (или) их комплексов с блокатора ми. В свою очередь, построение правильных моделей комплексов требует совершенствования силовых по лей, дальнейшей разработки высокопроизводитель ных алгоритмов докинга и методов оценки свободной энергии образования комплексов. С учетом важного биологического и медицинского значения калиевых каналов вычислительные методы будут все более востребованы, поддерживая, допол няя, а во многих случаях облегчая и даже заменяя сложные и дорогостоящие экспериментальные ис следования.

Об авторах

В. Н. Новоселецкий

Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова

Автор, ответственный за переписку.
Email: valeryns@gmail.com
Россия

A. Д. Волынцева

Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова

Email: valeryns@gmail.com
Россия

K. В. Шайтан

Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова

Email: valeryns@gmail.com
Россия

M. П. Кирпичников

Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова; Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН

Email: valeryns@gmail.com
Россия

A. В. Феофанов

Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова; Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН

Email: valeryns@gmail.com
Россия

Список литературы

Дополнительные файлы