Биоинженерия искусственных лимфоидных органов

Полный текст

В последние годы большой интерес вызывают био инженерные технологии, позволяющие по-новому подойти к решению современных научных и при кладных задач биологии и медицины. Создание ис кусственных биосовместимых материалов открывает широкие перспективы для регенеративной медицины, трансплантологии, лечения инфекционных и онколо гических заболеваний, а также для фундаменталь ных исследований ряда важных аспектов тканевой организации живых организмов, когда необходимо сохранить пространственную структуру изучаемо го объекта. Разработан достаточно широкий спектр биотехнологических материалов, которые биосовме стимы, нетоксичны и позволяют поддерживать функ ции различных клеток в трехмерном пространстве. Кроме того, возможна «функционализация» этих биоматериалов, в частности, каркасов или матриксов, о которых речь пойдет далее, в зависимости от кон кретной задачи. Это послужило заделом для созда ния искусственных органов и тканей на основе поли мерных каркасов, в том числе искусственных костей [1-4], кожи [5, 6], сердечной ткани [7], а также других тканей и органов. Особое внимание привлекает пер спектива получения функциональных искусственных лимфоидных органов, главным образом вторичных или третичных, таких, как лимфоузлы и лимфоид ные фолликулы [8-10]. Этот интерес обусловлен воз можностью применения подобных структур для кор рекции иммунодефицитных состояний и терапии аутоиммунных, инфекционных заболеваний и зло качественных новообразований. Предполагается, что биоинженерные иммунные органы будут частич но или полностью выполнять защитные функции в организме человека при патологических состояни ях [10]. Функциональные искусственные вторичные лимфоидные органы (например, искусственные лим фоузлы) позволят изучать и моделировать не до кон ца понятые стороны иммунного ответа, а в будущем найти применение при иммунотерапии целого ряда заболеваний. Важным отличием новых способов им муномодуляции от распространенных сейчас систем ных подходов (например, системной цитокиновой или антицитокиновой терапии, деплеции популяций лимфоцитов и т.д.) является воздействие на уровне распознавания иммунной системой специфических антигенов, что позволит минимизировать негатив ные последствия системной иммунотерапии и мак симально сконцентрировать действие на причине заболевания. При этом преимущество по сравнению с классической вакцинацией заключается в создании и длительном поддержании наиболее благоприятно го микроокружения, обеспечивающего все ключевые клеточные взаимодействия, вовлеченные в иммунный ответ. Во многих случаях это обстоятельство является решающим фактором успешной терапии [11, 12]. СТРУКТУРА ЛИМФОИДНЫХ ОРГАНОВ И ИХ РОЛЬ В ФОРМИРОВАНИИ ИММУННОГО ОТВЕТА Лимфоидные органы - неотъемлемая структурная часть иммунной системы, нарушения в работе ко торой могут приводить к иммунодефицитам у че ловека и животных [13, 14]. Выделяют три группы таких органов: первичные, вторичные и третичные. Первичные и вторичные лимфоидные органы в нор мальном взрослом организме присутствуют посто янно, тогда как третичные образуются локально в месте возникновения сильной и длительной им мунной реакции, например в области раковой опу холи или хронического воспаления [15]. Первичные лимфоидные органы, тимус и костный мозг, выпол няют функцию генерации клеток иммунной систе мы, а также формирования репертуара рецепторов Т- и В-лимфоцитов, тогда как вторичные и третич ные обеспечивают их выживание, взаимодействие с другими клетками, связь врожденного и адаптив ного звеньев иммунного ответа, а также активацию и поддержание иммунного ответа. Соответственно моделирование различных лимфоидных органов по зволит решить разнообразные проблемы как фунда ментальной науки, так и медицины. Функциональность иммунных органов обеспе чивается их уникальной микроархитектурой, раз нообразием типов вовлеченных клеток и факторов, воспроизведение которых в модельных системах и представляет основную задачу биоинженерии, так как без правильной организации всех компо нентов невозможна их функциональная активность. Понимание механизмов организации клеток в есте ственных органах необходимо для построения их ис кусственных аналогов. Для всех иммунных органов характерно наличие стромы, часто состоящей из нескольких типов кле ток, эндотелиального, мезенхимального, а в некото рых случаях эпидермального происхождения [16, 17]. К основным функциям стромы относятся привлече ние и пространственная организация в органе им мунных клеток, поддержание их жизнеспособности, пролиферации, создание условий для эффективного взаимодействия с антигенами и другими клетками. Каждый орган имеет определенный тип стромы, не обходимый для функционирования данного органа. В костном мозге взрослого организма из стволовых кроветворных клеток (СКК) и кроветворных клеток предшественников образуются все гемопоэтические клетки, в том числе лейкоциты всех типов. Для под держания СКК в костном мозге существуют специ альные ниши, обеспечивающие длительную репопу ляцию СКК, их дифференцировку в кроветворные клетки-предшественники и генерацию всех необхо димых ростков дифференцировки [18, 19]. Помимо этого, костный мозг выполняет важную роль в диф ференцировке и реализации функции В-лимфоцитов, клеток памяти, плазматических и других иммунных клеток, что обеспечивается определенными стро мальными клетками костного мозга [20]. Многие типы гемопоэтических клеток полностью или практически полностью созревают в костном мозге. Однако предшественники Т-лимфоцитов должны дополнительно пройти несколько этапов созревания в тимусе. Строма тимуса - тимусные эпителиальные клетки (ТЭК) - обеспечивает вы живание и селекцию тимоцитов, при этом разные субпопуляции ТЭК помогают осуществить положи тельную или отрицательную селекцию [21]. При от рицательной селекции большую роль играют ассоци ированные со стромой дендритные клетки, активно представляющие аутоантигены [22]. Также в тимусе важен мезенхимальный компартмент, роль которо го заключается в поддержании функционирования как эпителиальных, так и гемопоэтических кле ток. Во всех этих процессах важная роль отводится многочисленным взаимодействиям между гемопо этическими, мезенхимальными и эпителиальными клетками [23]. Строма способствует выходу из тиму са «обученных» зрелых Т-лимфоцитов, способных к распознаванию широчайшего репертуара чужерод ных антигенов в контексте молекул MHC и при этом наименее агрессивных к собственным антигенам ор ганизма [16, 24]. В лимфоузлах, белой пульпе селезенки и дру гих вторичных и третичных лимфоидных органах стромальные клетки привлекают зрелые иммун ные клетки и обеспечивают презентацию антигенов и активацию Т- и В-лимфоцитов, приводящую к их дальнейшей дифференцировке, пролиферации и вы полнению эффекторных функций, а также к форми рованию клеток памяти [25-27]. Особую роль играют лимфоидные органы, ассоциированные с кишечни ком - брыжеечные лимфоузлы, Пейеровы бляшки, изолированные лимфоидные фолликулы и крипто патчи [28]. Они участвуют в регуляции взаимоотно шений организма с симбиотической микрофлорой, формировании толерантности к непатогенным бак териям и пищевым антигенам и ответа против пато генных микроорганизмов [29-31]. Особое значение для биоинженерии искусствен ных лимфоидных органов имеют вторичные и тре тичные иммунные органы, так как они являются цен тральным звеном в запуске адаптивного иммунного ответа [26], а потому происходящие в них процессы представляют большой интерес как для изучения, так и для возможного клинического вмешательства при различных патологических состояниях. В связи с этим структура и развитие этих органов будут рас смотрены более подробно на примере лимфатических узлов. На рис. 1 приведена схема строения типичного лимфатического узла, и показаны основные этапы формирования в нем адаптивного иммунного ответа. Анатомически лимфоузлы представляют собой капсулированные органы бобовидной формы, соеди ненные сосудами с кровеносной и лимфатической системами. По расположению в организме выделяют две основные группы лимфоузлов: брыжеечные, уча ствующие в формировании иммунного ответа и то лерантности к антигенам в кишечнике, и перифери ческие, собирающие лимфу от различных отделов тела, преимущественно из барьерных тканей. Такое разделение объясняется не только анатомическим расположением, но и функциональными различи ями, так как эти две группы органов имеют разное происхождение и функции [32-35]. Среди перифе рических лимфоузлов отдельно выделяют также шейные из-за особенностей их образования в эмбри огенезе и участия в иммунитете слизистых [36, 37]. Несмотря на различия в происхождении и функциях, анатомическая структура всех лимфоузлов довольно сходна и представлена двумя основными отделами: кортексом, образующим основную паренхиму ор гана, и медуллой, которая сообщается с эфферент ными лимфатическими сосудами, несущими лимфу из органа [38]. Область кортекса, граничащая с ме дуллой, называется паракортексом. Снаружи лим фатический узел покрыт капсулой, через которую орган сообщается с афферентными лимфатическими сосудами. От капсулы внутрь органа отходят соеди нительнотканные перегородки (трабекулы), идущие вплоть до медуллярного синуса, образующего ворота лимфоузла [39]. Область между капсулой и кортек сом называется субкапсулярным пространством. Кровеносные сосуды соединены с органом через ворота, далее они идут в паракортекс, называемый также Т-зоной, где формируется сеть капилляров. В кортексе лимфоузла располагаются лимфоидные фолликулы, которые также называются B-зонами [38]. Название зон связано с расположением и функ цией этих двух основных групп лимфоцитов в лим фоузле, хотя и не отражает многих нюансов клеточ ных перемещений и взаимодействий, установленных только в последние годы (благодаря развитию техно логий, позволяющих проводить прижизненную визу ализацию отдельных клеток в органах и тканях [40]). B-лимфоциты преимущественно находятся и функ ционируют в B-зонах, тогда как Т-клетки в основ ном располагаются в паракортексе за исключением фолликулярных хелперных лимфоцитов, играющих важную роль в работе B-лимфоцитов [41]. Наличие отдельных В- и Т-зон лимфатических узлов воз можно благодаря формированию в них специально го микроокружения, продуцирующего как факторы выживания лимфоцитов, так и «гомеостатические» хемокины (так, для В-зон основными факторами яв ляются цитокины BAFF, CXCL13, для Т-зон - IL-7, CCL21, CCL19) [25, 42-44]. Эти молекулы синтези руются, в основном, стромальными клетками лим фоузлов, а также другими типами клеток, в том чис ле эндотелиальными и дендритными [42]. В В-зонах присутствуют фолликулярные дендритные клет ки, участвующие в созревании В-лимфоцитов и имеющие мезенхимальное происхождение [45], а в Т-зонах - дендритные клетки гемопоэтического происхождения, участвующие в презентации анти генов Т-лимфоцитам [46]. Дендритные клетки ге мопоэтического происхождения в основном прихо дят с афферентной лимфой из различных участков тела, главным образом, из барьерных тканей, где они встретили антиген, активировались и начали экс прессировать хемокиновый рецептор CCR7, ответ ственный за их перемещение в Т-зоны лимфоузлов. Существуют также резидентные дендритные клетки лимфоузлов, постоянно находящиеся в органе [47]. Их роль заключается в поглощении и презентации антигенов непосредственно из лимфатической жид кости, поступающей в лимфоузел по системе специ альных каналов - кондуитов. Эти каналы образованы разветвленной сетью полимеров, включая коллаген I, II, IV, ламинин, фибронектин, ER-TR7 и др. [48]. Лимфоциты постоянно рециркулируют в организ ме, периодически нанося визиты в различные лимфо узлы под воздействием привлекающих их хемокинов. Попадание этих клеток в лимфоузел очень важно для гомеостаза иммунной системы, так как для зре лых лимфоцитов стромальные клетки лимфоузлов служат основным источником факторов выживания [42]. Время, которое лимфоцит проводит в лимфоид ном органе, определяется балансом хемотактических сигналов. Так, после проникновения в паракортекс лимфоузла под действием градиента концентрации «гомеостатических» хемокинов через специальные венулы с высоким эндотелием в лимфоцитах постепенно усиливается экспрессия рецептора сфингозин-1-фосфата (СФ). Концентрация этого фактора очень высока в крови и лимфе, но он практически не про дуцируется в лимфоузлах [49]. Под действием гра диента концентрации СФ лимфоциты перемещаются в медуллу органа, а затем выходят через эфферент ные лимфатические сосуды в лимфоток. При этом взаимодействие рецептора со своим лигандом СФ приводит к интернализации комплекса и прерыва нию хемотактического сигнала, в результате чего клетки вновь приобретают возможность проникать в лимфоузлы под действием градиента концентраций хемокинов в крови [50]. Эта система обеспечивает эф фективную рециркуляцию лимфоцитов в организме, что необходимо для отбора лимфоцитов с оптималь ной специфичностью Т- и В-клеточных рецепторов (TCR и BCR) к появившимся в данный момент анти генам [51]. Помимо привлечения и поддержания гомеостаза иммунных клеток, лимфатические узлы обеспечи вают формирование всех необходимых взаимодей ствий для эффективного иммунного ответа, который обусловлен не только свойствами презентирующих и эффекторных клеток, но и особой архитектурой лимфоузла [26]. Так, кортекс органа пронизан систе мой кондуитов, по которым перемещаются лимфоци ты и на которых оптимально расположены антиген презентирующие клетки. Такая пространственная организация обеспечивает наибольшую вероятность встречи клеток этих двух типов, что облегчает поиск рецепторов, специфичных к конкретному антигену, представленному на дендритных или других анти генпрезентирующих клетках, среди огромного ре пертуара Т-клеточных рецепторов [8, 48, 51]. СТРОМАЛЬНЫЕ КЛЕТКИ ЛИМФАТИЧЕСКИХ УЗЛОВ Вклад отдельных типов стромальных клеток в под держание и функционирование лимфоузла, их вза имодействие и происхождение пока недостаточно понятны. На сегодняшний день самыми изученны ми мезенхимальными стромальными клетками вторичных лимфоидных органов являются фи бробластные ретикулярные клетки (ФРК) и фол ликулярные дендритные клетки (ФДК) [33, 40, 43, 50, рис. 1]. Первые играют важную роль преимуще ственно в работе Т-лимфоцитов, тогда как ФДК не обходимы для полноценной функции В-зон [25, 42]. ФРК образуют и поддерживают систему кондуи тов, необходимую для миграции и взаимодействия иммуноцитов и доставки антигенов из лимфы [48, 52]. Для функционирования лимфоузла важны три основных типа эндотелиальных клеток: лимфати ческие эндотелиальные клетки (ЛЭК), кровеносные эндотелиальные клетки (КЭК) и их разновидность - клетки высокого эндотелия венул (КВЭВ) [33, 42]. Роль этих клеток заключается в поддержании по стоянного контакта органа с лимфатической и кро веносной системами, точнее, обеспечении обмена иммунными клетками и антигенами. ЛЭК обеспе чивают привлечение и проникновение в лимфоузел мигрирующих дендритных клеток, а также перенос антигенов из лимфы в систему кондуитов лимфо узла [53, 54]. Обычные КЭК выстилают кровенос ные сосуды, проходящие в органе, тогда как КВЭВ обеспечивают миграцию лимфоцитов из кровотока в паракортекс лимфоузла, откуда те распределяют ся по соответствующим зонам в органе [42]. Недавно был открыт еще один тип стромальных клеток, рас полагающихся в субкапсулярной зоне лимфоузлов, а также обнаруживаемых в других вторичных лим фоидных органах, но отсутствующих в третичных - ретикулярные клетки маргинальной зоны (РКМЗ) [55, 56]. Показано, что РКМЗ являются непосред ственными предшественниками ФДК, в том числе при формировании зародышевых центров в фол ликулах [57]. Также постулируется их роль в под держании пула ФРК, но это утверждение требует строгого доказательства. Основная проблема в этой области исследова ний состоит в том, что, несмотря на достаточно полное описание функций стромальных клеток, их точный фенотип все еще остается предметом дис куссий, и разные авторы придерживаются разных точек зрения [33, 42, 45, 58]. Отчасти это связано с тем, что универсальные поверхностные маркеры обнаружены далеко не на всех стромальных клет ках. Многие из изучаемых поверхностных молекул относятся к неизбирательным маркерам многих клеточных популяций. Так, основными маркерами большинства зрелых стромальных клеток лимфо узлов и их предшественников считаются молекулы адгезии ICAM-1 и VCAM-1, которые обеспечивают как межклеточные контакты в строме, так и взаи модействие с приходящими иммунными клетками, экспрессирующими на своей поверхности соответ ствующие интегрины [32, 59]. Важным маркером некоторых типов стромальных клеток лимфоузлов, главным образом ЛЭК и ФРК, является гликопроте ин подопланин (gp38). Эта молекула играет важную роль в поддержании нормального состояния эндоте лиальных клеток сосудов и капсулы в лимфоузле, регулирует снабжение органа кровью и лимфой, ми грацию дендритных клеток и адаптивную реакцию ФРК при сильном воспалении [54, 60]. Для всех эн дотелиальных клеток характерна экспрессия CD31 как основного маркера эндотелия. Специфические поверхностные маркеры большей части стромаль ных клеток лимфоузлов не известны, их характеризуют либо по совокупности ряда «пан-маркеров», либо по экспрессии специфических генов и продук ции соответствующих факторов, однако это еще не устоявшаяся классификация. Так, еще недавно экспрессия хемокина CXCL13 в зрелом лимфоуз ле приписывалась исключительно ФДК, предпо лагаемым основным участникам B-клеточного от вета. На сегодняшний день существуют данные о том, что ретикулярные клетки маргинальных зон (РКМЗ) и даже ФРК также способны синтезировать CXCL13, а нарушение его продукции этими клет ками оказывает существенное влияние на функ цию B-лимфоцитов и иммунный ответ [42, 44]. Тем не менее часть стромальных клеток можно выделить по совокупности экспрессии нескольких поверхност ных маркеров. Так, ФДК экспрессируют CD35, CD21 (рецепторы комплемента), FcγRIIB, улавливающие иммунные комплексы для последующей презентации B-лимфоцитам в герминативных центрах, и не несут при этом на поверхности типичных маркеров гемо поэтического ряда (например, CD45) [45]. РКМЗ и, возможно, ФДК экспрессируют молекулы адгезии MAdCAM-1 [55]. ФРК часто выделяют по признаку продукции компонентов межклеточного матрикса, необходимых для сборки кондуитов, например, ERTR7 [58], однако такие маркеры можно использо вать только при иммуногистохимическом окраши вании срезов лимфоузлов, но не при цитометрии, когда клетки не связаны с компонентами матрикса. Для ЛЭК характерна экспрессия маркера Lyve-1, а КВЭВ в зрелом лимфоузле, в отличие от КЭК, специфически экспрессируют адрессин PNAd и мо лекулы адгезии MAdCAM-1 [42]. Таким образом, стромальный компартмент лим фатических узлов и других вторичных лимфоидных органов находится в стадии активного изучения, и остается много вопросов, которые требуется про яснить для полноценного понимания функций всех клеток-участников. Такое понимание важно для био инженерии искусственных лимфоидных органов, целью которой является создание функционального органа из минимального числа хорошо охарактери зованных компонентов. На основе данных о функ ционировании лимфоидных органов можно предпо ложить, что для эффективного выполнения своей функции искусственный лимфоузел должен иметь соответствующую инфраструктуру, представлен ную, в первую очередь, правильно организованным стромальным компартментом. Внесение всех нужных компонентов стромы будет определять эффектив ность той или иной иммунной реакции, происходя щей в данной системе, а также позволит отслеживать стадию развития искусственного органа на основании анализа состава стромальных клеток. ЭМБРИОНАЛЬНОЕ РАЗВИТИЕ ЛИМФАТИЧЕСКИХ УЗЛОВ Для успешной биоинженерии искусственных лим фоузлов важно понимать процессы, определяю щие развитие лимфоидных органов в эмбриогенезе. Такое знание может позволить дифференцировать все необходимые типы клеток из клеток-предше ственников, выделенных из эмбриональной ткани, либо получать из клеток-предшественников цельный орган. Краткая схема развития лимфоидного орга на на примере лимфоузла представлена на рис. 2. Установлено, что в процессе эмбриогенеза зача ток лимфоузла (анлаген) закладывается в опреде ленных местах в результате дифференцировки эндотелия венул в лимфатический эндотелий [61] и формирования эндотелиального кармана, кото рый в дальнейшем участвует в образовании капсулы и сети кондуитов в лимфоузле, а также связывает орган с лимфатической и кровеносной системами [32]. Дальнейшие события затрагивают малодиф ференцированные мезенхимальные клетки вокруг сосудов (перициты), являющиеся предшественни ками ФДК и, по-видимому, всех других стромаль ных клеток, кроме эндотелиальных [45]. Недавно это было показано для развития селезенки, где из кле ток-предшественников, экспрессирующих важные для эмбриогенеза селезенки и поджелудочной же лезы транскрипционные факторы Nkx2-5 и Islet-1, образуются ФДК, ФРК и другие стромальные клетки [62], хотя происхождение всех типов стромальных клеток из одной популяции клеток-предшественни ков в случае лимфоузлов еще требует строгого до казательства. Эндотелиальные карманы дают на чало лимфатической системе организма, а также лимфоузлам. Выбор местоположения лимфатиче ского узла определяется локальной секрецией ре тиноевой кислоты (РК) окончаниями нервных во локон [63]. Под воздействием РК мезенхимальные предшественники начинают секретировать хемокин CXCL13, привлекающий клетки-индукторы лимфо идной ткани (lymphoid tissue inducer cells - LTiC), на поверхности которых появляются молекулы ад гезии ICAM-1 и VCAM-1. С этого момента мезенхи мальные предшественники называют клетками-ор ганизаторами лимфоидной ткани (lymphoid tissue organizer cells - LToC). LTiC мигрируют к анлагену лимфоузла, главным образом, под действием гради ента концентрации хемокина CXCL13 и взаимодей ствуют с LToC [63]. Установлено, что на этом этапе крайне важна передача сигнала через LTβR, кото рый находится на поверхности LToC [64]. Основной лиганд LTβR, участвующий в эмбриогенезе лимфо узлов, - гетеротример LTα1β2, который появляется на поверхности LTiC после их взаимодействия с рас творимым фактором TRANCE (RANK-L), точный ис точник которого пока не известен, но предполагает ся, что им могут быть сами LTiC [59, 65, 66]. У мышей с дефицитом LTβR или LTα полностью отсутству ют вторичные лимфоидные органы (кроме лимфо идной ткани, ассоциированной со слизистой носовой полости [67]), а у мышей с генетической инактива цией LTβ развиваются только шейные и брыжееч ные лимфоузлы, что указывает на исключительную важность этого сигнального пути в эмбриональном развитии [34, 59]. Этот сигнальный путь запускает дальнейшую дифференцировку LToC, что приво дит к усилению экспрессии молекул адгезии, появ лению на поверхности клеток MAdCAM-1 и PNAd, а также к увеличению экспрессии хемокинов, при влекающих все новые гемопоэтические клетки в очаг формирования будущего лимфоузла [32, 59, 64]. Еще один важный для развития лимфоидных органов мо лекулярный каскад - передача сигнала через рецеп тор TNFR1. Показано, что генетическая инактива ция как TNF, так и TNFR1 приводит к нарушению развития ФДК у мышей и, как следствие, к отсут ствию зародышевых центров в лимфоидных органах [68]. Стоит отметить, что члены суперсемейства TNF играют важную роль в образовании и поддержании не только лимфоузлов, но и всех других лимфоид ных органов [34, 59, 65, 68-71]. Таким образом, на блюдается синергия различных сигнальных путей, приводящая в итоге к полноценному формированию и функционированию иммунной системы. На следующем этапе развития органа, по видимому, происходит накопление гемопоэтических клеток в формирующемся лимфоузле, что приводит к его разрастанию, дальнейшей дифференцировке стромальных клеток, образованию венул с высоким эндотелием, зачаточных фолликулов и других ком партментов, характерных для лимфоузлов [32, 59, 72]. На начальных этапах формирование структур ных отделов лимфоузлов происходит независимо от Т- и B-лимфоцитов, тогда как на поздних ста диях они активно проникают в органы и участвуют в окончательном созревании лимфоидных фолли кулов и дальнейшем поддержании инфраструкту ры стромы за счет передачи сигнала через LTβR и TNFR [26, 36]. В данном случае важную роль игра ет не только LTα1β2, но и еще один лиганд для LTβR - LIGHT [65]. Таким образом, формирование и функционирование полноценного лимфоузла (как и других вторичных лимфоидных органов) сильно зависит от взаимодействия мезенхимальных и ге мопоэтических клеток, что необходимо учитывать при биоинженерии этих органов. Оба клеточных компонента (в виде зрелых клеток или, возможно, клеток-предшественников) должны быть правиль но организованы в зоне закладки и формирования лимфоузла для его эффективного развития и даль нейшего функционирования. БИОМАТЕРИАЛЫ ДЛЯ ИНЖЕНЕРИИ ИСКУССТВЕННЫХ ОРГАНОВ Помимо минимального набора типов клеток, необ ходимых для функционирования искусственного лимфоузла, важно также сформировать некий кар кас, который будет служить структурной основой для правильного расположения клеток в простран стве, что требуется для их эффективного взаимодей ствия. В ходе онтогенеза стромальные клетки сами выстраивают необходимую структуру, состоящую из полимерных, преимущественно коллагеновых, волокон [58, 59]. В случае биоинженерии искус ственного лимфоузла необходимо изначально иметь трехмерный остов, на основе которого клетки бу дут формировать трехмерную клеточную культу ру, а затем и полноценный орган. Это крайне важно на начальных этапах, когда клетки еще не создали свой собственный полимерный каркас, необходимый для их дальнейшей дифференцировки и обеспечения их выживания и функциональности. Наиболее перспективными для биоинженерии лимфоидных органов представляются искусствен ные каркасы на основе биоматериалов. Такие мате риалы состоят в основном из модифицированных полимеров природного происхождения как полиса харидного, так и белкового: фиброина (основного ком понента шелка кокона тутового шелкопряда Bombyx mori) (рис. 3) [35, 36], спидроина (основного компонен та паутины) [73-75], альгината (смесь полисахари дов клеточной стенки водорослей) [76], коллагена [77] и др. Используют также синтетические полимеры, например, PLG (полилактат-ко-гликолат), PLA (по лилактат), PGA (полигликолат) и др. [78]. Для улуч шения таких свойств полимеров, как упругость, им муногенность, адгезивность, устойчивость к внешним воздействиям, применяют различные модификации субстрата, например гидроксиапатитом или колла геном (желатином) [79]. Обязательное требование к биоинженерным ма териалам - отсутствие антигенных, канцерогенных, токсических и других свойств, ограничивающих их применение в медицине. Подобные эффекты, как правило, связаны с присутствием в полимерном субстрате активных групп, образованных мономе рами или инициаторами реакции полимеризации. Поэтому необходимо тщательно контролировать со став материала, его очистку и модификации для по следующего применения [80]. Нежелательные эф фекты in vivo являются основной причиной того, что многие созданные биоматериалы пока не нашли широкого клинического применения. В связи с этим проводится работа по улучшению свойств биоинже нерных материалов, и уже отобраны несколько видов структур, биосовместимых в экспериментах на жи вотных [11, 75]. Впрочем, полностью избежать им мунной реакции организма не удается, так как поч ти всегда используются чужеродные материалы. Главная цель при разработке этих материалов состо яла в том, чтобы избежать системного ответа и силь ного воспаления. Все обсуждаемые биоматериалы, как правило, представляют собой трехмерный каркас с сетчатой структурой, максимально приближенной к струк туре волокон внеклеточного матрикса в животных тканях. По аналогии с ними такие биоинженерные структуры тоже называют матриксами, подчер кивая тем самым их применение в качестве карка са - трехмерного остова для роста заселенных в них клеточных популяций. Этот подход нашел примене ние, в первую очередь, в получении 3D клеточных культур, так как известно, что многие особенности взаимодействия клеток в функционирующем органе нельзя воспроизвести в неестественной для клеток среде на поверхности культурального пластика [81]. Матрикс может представлять собой гелеподобную сеть полимеров, например, коллагеновый матрикс, а может иметь более твердую оформленную струк туру, которая сохраняет свою форму при проведении механических манипуляций, например при имплан тации в организм животного. Последнее обстоятель ство наиболее важно для возможного применения материала в медицине, изучения поведения клеток непосредственно в живых объектах, а также в био инженерии искусственных органов. Для формирова ния соответствующей формы и текстуры матрикса используется множество подходов [78]. Необходимо, чтобы при полимеризации того или иного мономера, из которого будет сформирован матрикс, образова лась соответствующая трехмерная пористая струк тура, в противном случае объем каркаса не будет доступным для заселения клетками или насыщения каким-либо веществом. В некоторых работах для улучшения биосовмести мости каркасов используют подход с применением естественного внеклеточного матрикса из организма животных, предварительно освобожденного от насе лявших его клеток [82]. Полученные таким образом материалы не вызывают иммунного ответа при их имплантации, так как не являются чужеродными для организма, однако, как правило, они более под вержены деградации ферментами, что может быть как достоинством, так и недостатком, в зависимости от поставленной задачи. Однако каркас для искусственного органа - не единственное применение подобных систем. Все больший интерес вызывает использование матрик сов для связывания различного рода растворимых биологических факторов с их последующей посте пенной диффузией из толщи матрикса, что сможет обеспечить постепенный и протяженный во времени выход биологически активных веществ. В контексте биоинженерии искусственных лимфоузлов эта об ласть интересна тем, что позволяет создать искус ственный градиент хемокинов и ростовых факторов, что может быть необходимым для начального запу ска программы по поддержанию развития органа. Как уже обсуждалось, в эмбриогенезе привлечение клеток к месту закладки лимфоузла и последующая их дифференцировка достигаются за счет экспрес сии предшественниками стромальных клеток, глав ным образом, хемокина - CXCL13. В случае констру ирования искусственного органа источником этого хемокина могли бы стать специальные полимерные частицы, разработкой которых сейчас занимается несколько групп ученых. Так, сообщается [83] о соз дании альгинатных микросфер, которые можно на сытить каким-либо хемокином с его последующим постепенным высвобождением в среду. Такие микро сферы имеют размер 5-20 мкм, что позволяет про водить с ними различные манипуляции, например, использовать как источник веществ, привлекающих клетки при моделировании органов и тканей in vitro. Другой подход к созданию материалов, обеспечива ющих контролируемый выход факторов, обусловлен использованием биоразлагаемых полимеров, кова лентно сшитых с каким-либо активным веществом. При действии ферментов или спонтанном гидролизе будут постепенно высвобождаться и связанные с ма триксом факторы, с последующим выполнением сво ей биологической функции [84]. ДОСТИЖЕНИЯ В БИОИНЖЕНЕРИИ ИСКУССТВЕННЫХ ЛИМФОИДНЫХ ОРГАНОВ Как мы уже отмечали, задача биоинженерии ис кусственных органов важна, в первую очередь, из за своего возможного клинического применения. Крайне заманчивой представляется возможность использования таких органов для репрограммирова ния иммунного ответа при целом ряде заболеваний. При этом для каждой конкретной задачи итоговая система может иметь не все характеристики нор мальных органов, а только те, которые необходимы для выполнения данной функции. Если искусствен ные лимфатические узлы смогут обеспечить при влечение, выживание, взаимодействие, активацию и функцию иммунных клеток, то это позволит на правлять формирование иммунного ответа в опре деленном, наиболее эффективном направлении. Искусственные лимфоузлы можно заселять in vitro активированными и насыщенными определенными антигенами ДК. После имплантации полученных систем дендритные клетки будут эффективно вза имодействовать с приходящими лимфоцитами, на правляя их дифференцировку и функциональную активность. Преимущество таких систем перед вак цинацией антигеном или введением в организм су спензии активированных ДК состоит в том, что они будут представлять подавляющее большинство ан тигенпрезентирующих клеток в искусственном лим фоузле, а значит, с высокой вероятностью каждый пришедший лимфоцит, специфический к данному антигену, будет подвержен влиянию определенных цитокинов и костимуляторных молекул на поверх ности ДК. Предполагается, что имплантация таких систем непосредственно в очаг опухолевого роста или аутоиммунной реакции позволит репрограмми ровать специфические лимфоциты и оказывать те рапевтическое воздействие. Хотя до реализации этой идеи требуется пройти длительный путь создания полноценного функционального искусственного лим фоузла, уже возможно создание редуцированных систем, которые также могут иметь определенное клиническое значение. Основные опубликованные достижения в этой области суммированы в таблице. Так, показана возможность применения матрик са для вакцинации против меланомы у мышей [11, 85]. С этой целью PLG-матрикс насытили грануло цитарно-макрофагальным колониестимулирующим фактором (ГМ-КСФ), синтетическим олигонуклео тидом, содержащим неметилированный CpG, а так же частично лизированными клетками меланомы, терапевтическое действие против которой изуча ли. Предварительно установили, что ГМ-КСФ не обходим для привлечения и активации дендритных клеток мыши. CpG добавляли для стимуляции диф ференцировки ДК в направлении, приводящем к ак тивации Т-хелперов первого типа, что считается наи более адекватным ответом на опухоль [86]. Показано, что имплантация таких «структурных вакцин» в виде трехмерного матрикса приводит к рекрути рованию кожных ДК мыши, их активации и после дующей миграции в дренирующий лимфатический узел. Там они участвуют в созревании специфиче ских Т-хелперов первого типа, что, в конечном ито ге, приводит к усилению противоопухолевого ответа у мышей, который проявляется снижением смерт ности в модели перевиваемой опухоли. В этой работе матрикс, насыщенный факторами дифференциров ки, привлечения дендритных клеток и опухолевыми антигенами, частично выполнял функции третично го лимфоидного органа. Это - простейшая модель, в которой, тем не менее, наблюдали функциональную связь имплантированной структуры с лимфатиче ской системой мыши, что приводило к специфиче скому направленному иммунному ответу. Показано, что опухоли отторгались в результате индукции сильного цитотоксического ответа лимфоцитов CD8+. Важно, что эта схема терапии уже адаптиро вана для человека и в настоящее время находится на первой стадии клинических испытаний (https:// clinicaltrials.gov/show/NCT01753089). В другой модели, более близкой к настоящему иммунному органу [10], пытались создать прототип человеческого лимфатического узла in vitro. С этой целью разработали биореактор, имитирующий по ложение органа относительно сосудистой системы организма. Он содержал в себе первую ячейку, в ко торой находился матрикс с дендритными клетками, соответствующий лимфатическому узлу, и вторую ячейку, в которую помещали суспензионные лимфо циты как модель кровотока. Ячейки сообщались меж ду собой через пористую мембрану, что обеспечивало свободную циркуляцию как растворимых факторов, так и клеток. Показано, что такая система, при усло вии регулярной смены среды, достаточно стабиль на и может существовать на протяжении минимум 2 недель с сохранением активности клеток. Через 2 недели культивирования оказалось, что, помимо дендритных клеток, в матриксе присутствуют попу ляции Т- и В-лимфоцитов, пришедших из смежной ячейки биореактора. Лимфоциты, как и дендритные клетки, формировали внутри матрикса кластеры, что могло свидетельствовать об их возможной функ циональной активности. Эту модель представляют в качестве возможной тест-системы для изучения действия некоторых лекарственных средств, а так же клеточных взаимодействий in vitro. Эта модель достаточно хорошо отображает часть происходящих в лимфоузле процессов, а именно, миграцию лимфо цитов и их взаимодействие с дендритными клетками. Однако, несмотря на успехи, достигнутые в био инженерии редуцированных моделей лимфоуз лов, стало ясно, что полноценный орган не может существовать и функционировать без специаль ной образующей его стромы. Это привело к актив ному изучению как биологии стромальных клеток, так и к попыткам использования их для моделиро вания лимфоидной ткани. Эти два направления были объединены в одной работе [87]. Известно, что при до статочно сильном локальном воспалении увеличи ваются размеры и клеточность дренирующих лим фоузлов. Эта адаптивная реакция обеспечивается увеличением скорости деления ФРК проксимально го к очагу воспаления лимфоузла, а также увеличе нием уровня экспрессии хемокинов CCL21 и CCL19, что приводит к привлечению к этот лимфоузел боль шего количества лимфоцитов и дендритных клеток. Так как одним из первых изменений при локальном воспалении является значительное увеличение ско рости тока лимфы в дренирующий лимфоузел [88], была выдвинута гипотеза, согласно которой ФРК могут реагировать на скорость движения лимфы по системе кондуитов, что приводит к ряду функци ональных изменений, например, усилению экспрес сии этими клетками хемокинов. Для проверки этой гипотезы авторы сконструировали in vitro модель лимфоузла, состоящую из матрикса, заселенного стабильной линией фибробластных ретикулярных клеток, через который проходил регулируемый по ток лимфатической жидкости. Показано, что в ус ловиях потока жидкости секреция CCL21 и CCL19 клетками больше, чем в статичной системе. Более того, ток лимфы влиял не только на экспрессию хе мокинов, но и на скорость деления клеток, а также на их пространственную организацию в матриксе. Интересно, что в случае тока жидкости часть кле ток формировала специфические каналоподобные структуры, ориентированные по направлению тока. Подобная организация не наблюдалась в статичных условиях. Также под влиянием потока лимфы клетки реорганизовывали матрикс, в котором находились, создавая в нем пространственно-ориентированные структуры. Предполагается, что, помимо участия в реакции лимфоузла на воспаление, ток лимфы мо жет играть роль и при организации структуры орга на, регулируя положение и функцию стромальных клеток. Это очень интересное наблюдение, сделанное на простом прототипе лимфоузла, состоящем из все го одного типа стромальных клеток, наглядно пока зывало сложную системную взаимосвязь всех ком понентов, которую можно изучить исключительно на модели искусственного лимфоидного органа. Наибольшего успеха в биоинженерии искус ственного лимфоузла добились японские ученые, разработавшие систему на основе коллагеново го матрикса [89, 90]. Они заселяли такие матриксы эпителиальными клетками тимуса линии TEL-2 [91], предварительно трансфицированными вектором, со держащим ген лимфотоксина α (LTα), а также ДК, полученными из культуры костного мозга. Такие структуры подсаживали под капсулу почки мышам и наблюдали миграцию в матрикс лимфоцитов ре ципиента, пространственную кластерную организа цию Т- и В-клеток в матриксе, похожую на органи зацию в лимфатическом узле. При этом показали, что предварительное заселение матрикса дендрит ными клетками необходимо для эффективной мигра ции в него клеток реципиента. Кроме того, в матрик се обнаружены клетки, экспрессирующие маркеры эндотелия, что свидетельствовало о росте сосудов. Матрикс, который в течение некоторого времени на ходился в организме мыши, извлекали и переносили в мышей с тяжелым комбинированным иммуноде фицитом (SCID). После трансплантации у мышей с иммунодефицитом наблюдали миграцию клеток из матрикса в селезенку и секрецию антител класса IgG. Показано, что если матриксы с клетками сна чала имплантировать мышам, предварительно им мунизованным белковым антигеном (использовали модифицированный овальбумин NP-OVA), а уже затем мышам с иммунодефицитом, то антитела, об наруживаемые у мышей с иммунодефицитом после трансплантации такого матрикса, имели специфич ность к этому антигену. Совокупность полученных данных дала основание назвать полученную систему искусственным лимфатическим узлом. Следует от метить, что в этой работе использовали коллагеновые матриксы, хотя они достаточно быстро деградирова ли и уменьшались в размерах, что могло сказаться на их эффективности в длительных экспериментах. Для обеспечения длительного нахождения и функ ционирования искусственного лимфоидного органа в организме реципиента желательно использовать в качестве биоинженерного каркаса более инертные материалы. Не менее важной задачей является создание ис кусственного тимуса, что может иметь большое зна чение для медицины, поскольку с возрастом проис ходит инволюция тимуса и, как следствие, снижение количества новых Т-лимфоцитов в организме чело века, что способствует снижению иммунного ответа на новые инфекции. Создание искусственного тиму са могло бы помочь решить эту проблему. Недавно была опубликована многообещающая работа [92], в которой разработана система получения тимус ных эпителиальных клеток (ТЭК), необходимых для функционирования тимуса, с помощью in vitro репрограммирования эмбриональных фибробластов мыши (МЭФ) под действием важного для ТЭК транс крипционного фактора Foxn1. Показано, что в ходе дифференцировки трансформированные клетки приобретают фенотип нормальных ТЭК: экспресси руют поверхностные маркеры (EpCAM) и гены фак торов, важных для их функциональной активности (Dll4, CCL25, Kitl и др.). При этом, несмотря на уча стие фактора Foxn1 в развитии эпителиальных клеток кожи, в трансформированных МЭФ не обна ружено экспрессии специфических для них генов, что свидетельствует об их ориентации в направлении эпителия тимуса, а не кожи. Далее полученные клет ки были охарактеризованы по способности обеспечи вать созревание предшественников Т-лимфоцитов in vitro, подобно тому, как это происходит в нор мальном тимусе. Показано, что сокультивирование трансформированных МЭФ и предшественников Т-лимфоцитов приводит к образованию транзи торных популяций тимоцитов (CD4+CD8+), а также терминально дифференцированных CD4+ и CD8+ наивных Т-клеток в количествах, сопоставимых с по лучаемыми при использовании в качестве стромы ТЭК, выделенных из эмбрионального тимуса мыши. При этом нетрансформированные МЭФ не обе спечивали созревания тимоцитов. Немаловажно, что полученные клетки экспрессировали моле кулы MHC класса II на уровне, сравнимом с нор мальными ТЭК. При этом молекулы МНС класса II экспрессировались только после добавления пред шественников Т-лимфоцитов в культуру, что еще раз подчеркивает важность взаимосвязи стромаль ных и гемопоэтических клеток в функционировании лимфоидных тканей. Известно, что молекулы MHC класса II на поверхности ТЭК важны для селекции тимоцитов в тимусе по способности распознавать молекулы главного комплекса гистосовместимости и при этом незначительно связывать аутоантигены, чтобы на выходе получить функциональные ауто толерантные клетки. Примечательно, что для по следней функции важен ген AIRE ТЭК, который экспрессируется, как показано, и в трансформиро ванных Foxn1 фибробластах. Наконец, полученные клетки использовали в качестве основы модели ис кусственного тимуса. С этой целью получили тка невые агрегаты, состоящие из трех типов клеток: предшественников Т-лимфоцитов, мезенхимальной стромы эмбрионального тимуса в качестве источника факторов выживания и трансформированных МЭФ. После получения такие агрегаты имплантировали мышам под капсулу почки и через 3-4 недели на блюдали формирование тимусной ткани. Изучение состава этой ткани показало, что агрегаты, получен ные с использованием трансформированных фибро бластов, после имплантации структурно и функци онально воспроизводили ткань нормального тимуса. Эти органоиды были сопоставимы с искусственной тканью, полученной при имплантации агрегатов с эмбриональными ТЭК, тогда как клеточные агре гаты с добавлением нетрансформированных МЭФ оказались неспособными к формированию тимусной ткани. Полученную систему с уверенностью можно назвать прототипом искусственного тимуса. В нем обнаружено формирование двух подтипов ТЭК, не обходимых для полноценной селекции тимоцитов, и их пространственное разделение на зоны, подоб но нормальному тимусу. Профили экспрессии генов и поверхностных маркеров, характерных для ТЭК, были сопоставимыми с профилями в нормальном эмбриональном тимусе. Искусственный тимус ока зался способным поддерживать дифференциров ку Т-лимфоцитов в направлении как TCRαβ CD4+/CD8+, так и TCRγδ Т-лимфоцитов. Наконец, при им плантации полученных систем бестимусным (Nude) мышам в их периферической крови и селезенке фор мировались зрелые наивные Т-лимфоциты, что до казывало полноценную функциональность органа. Эта работа является важным этапом на пути к биоин женерии искусственного тимуса, в том числе с целью клинического применения [92]. Открытым остается вопрос получения мезенхимального компартмента, так как в указанной работе он был образован эмбри ональной тимусной тканью, что невозможно в случае создания искусственного органа для взрослого ор ганизма. Решение этой проблемы позволит создать полностью биоинженерный функционально актив ный орган, который может помочь лучше понять при роду происходящих в тимусе процессов селекции ти моцитов и стать важным инструментом при лечении иммунодефицитов человека. Следует подчеркнуть, что подходы, использующие трансформированные линии клеток, удобны для экс периментальной науки, однако не имеют потенци ального клинического применения. Более того, даже в лабораторных исследованиях такие модели будут ограничены одной линией животных, из которых по лучена культура. Рассматриваются два возможных подхода к решению этой проблемы: использование бесклеточных систем или первичных культур кле ток. Первая идея подразумевает внесение в матрикс, служащий основой формирующегося искусственного органа, определенной смеси факторов, которые при влекают и обеспечивают выживание и дифферен цировку лимфоидных и стромальных клеток-пред шественников как в случае развития нормального лимфоузла. Для создания градиента этих факторов можно использовать дополнительные биоматериа лы, обеспечивающие постепенное высвобождение веществ, например альгинатные микросферы. В ка честве кандидатных факторов можно применять хемокины CCL19, CXCL13, цитокины BAFF, IL-7, VEGF, PDGF и др. Задавая индивидуальную динами ку высвобождения каждого фактора, можно добиться привлечения и дифференцировки клеток-предше ственников из кровотока, не заселяя предварительно матрикс какими-либо клетками. Недавно опублико вали модельную работу, в которой в матрикс заклю чали два цитокина - VEGF и PDGF [93]. Показано, что определенным образом подобранная динамика высвобождения каждого фактора позволяет эффек тивно стимулировать ангиогенез в месте импланта ции матрикса, что необходимо для миграции в него клеток и питательных веществ. Для создания искус ственных органов с использованием этого подхода, разумеется, потребуется комбинация большего числа факторов. Если бесклеточной системы будет недостаточно для биоинженерии клинически полноценных искус ственных лимфоидных органов, то потребуется раз работать протокол с использованием клеток. В этом случае наиболее перспективным представляется подход с использованием индуцированных плюри потентных стволовых клеток человека (iPSC), на ко торые возлагаются большие надежды в области пер сонализированной медицины [94]. На сегодняшний день опубликовано несколько работ, в которых iPSC успешно применили для создания моделей челове ческих органов, например тонкого кишечника [95, 96]. В контексте искусственных лимфоидных орга нов iPSC могут служить источником стромального компартмента, обеспечивающего функциональную активность органа. Эту возможность недавно рассмо трели в обзоре, посвященном биоинженерии искус ственного тимуса [97]. В дальнейшем этот перспек тивный подход смогут использовать и для других лимфоидных органов. ЗАКЛЮЧЕНИЕ Хотя на сегодняшний день уже разработано не сколько моделей искусственных лимфоидных орга нов, критический анализ выявил несколько проблем, которые еще ждут своего решения. Использование трансформированных клеток имеет очевид ные ограничения для клинического применения. Биоинженерия органов с использованием первич ных культур клеток пока также имеет ограничен ное применение. Это связано с тем, что для многих типов клеток, особенно стромальных, в должной мере не разработаны экспериментальные прото колы выделения, культивирования и поддержания в дифференцированном состоянии. Основной ин терес для клинического применения представляет возможность получения всех или большинства кле точных типов либо из предшественников, либо путем трансдифференцировки зрелых клеток, например, через этап получения iPSC. Некоторые типы клеток легко получить в первичной культуре, в том числе и клеток человека, что уже является основой неко торых видов терапии, например адоптивный пере нос дендритных клеток или лимфоцитов. Возникает естественная идея объединить два подхода, поместив в каркас искусственного лимфоузла часть клеток в виде первичных культур, а недостаток других за менить добавлением факторов, ожидая, что подобной комбинации будет достаточно для запуска процесса формирования органа, тогда как все необходимые клетки появятся там уже позднее из привлеченных предшественников. Во всех этих направлениях сей час ведутся активные работы. Подводя итог, можно сказать, что создание ис кусственных лимфоидных органов является важной задачей современной иммунологии и биомедицины как с теоретической, так и с практической точек зрения. Успех в этой области обеспечен не только достижениями биоинженерии, но связан и с недав ним прогрессом в понимании процессов формирова ния лимфоидных органов и их функционирования. Безусловно, эта тематика находится на стыке не скольких наук: биоинженерии, иммунологии, си стемной биологии и регенеративной медицины, а по тому требует комплексного подхода к изучению, объединения различных подходов, чтобы учесть все или большинство факторов, ответственных за работу таких сложных систем, как лимфоидные органы.

Об авторах

M. A. Носенко

Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН; Московский государственный университет; Немецкий научно-исследовательский центр ревматологии

Автор, ответственный за переписку.
Email: maxim-nosenko@yandex.ru
Россия

M. С. Друцкая

Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН

Email: maxim-nosenko@yandex.ru
Россия

M. M. Мойсенович

Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова

Email: maxim-nosenko@yandex.ru
Россия

С. A. Недоспасов

Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН; Московский государственный университет; Немецкий научно-исследовательский центр ревматологии

Email: maxim-nosenko@yandex.ru
Россия

Список литературы

Дополнительные файлы