Синтетические флуорофоры для визуализации биомолекул в живых системах

Полный текст

ВВЕДЕНИЕ Молекулярные маркеры, основанные на флуорес ценции, давно используются как инструмент для ви зуализации биомолекул in vitro. Флуоресцентное мечение с помощью синтетического флуорофора было впервые описано в 1942 году, когда с использо ванием флуоресцеинизотиоцианата (FITC) получили меченые антитела против пневмококков [1]. Вплоть до 1980-х годов флуоресцентное мечение применя лось в основном для анализа фиксированных био логических образцов. За последнее двадцатилетие разработан ряд методов, позволяющих включать флуоресцентные метки в живые объекты [2], в част ности, в виде генетически кодируемых химер це левых клеточных белков (ЦКБ) с GFP-подобными флуоресцентными белками (ФБ) [3-5]. Однако в ряде случаев для анализа живых систем необходимы низ комолекулярные флуоресцентные зонды [6, 7] и направленная модификация ими ЦКБ [8, 9]. Основное преимущество этих флуорофоров - их небольшой размер и доступность соединений с заданными хими ческими и фотофизическими свойствами. Возможность применения каждого конкретного флуорофора определяется его химическими (ре акционная способность, растворимость, липофиль ность, рКа, стабильность) и фотофизическими (мак симум возбуждения (λex), максимум эмиссии (λem), коэффициент экстинкции (ε), квантовый выход (Φ), время жизни в возбужденном состоянии, фотоста бильность) свойствами. Наиболее универсальный параметр, определяющий чувствительность метода для различных флуорофоров, - произведение ко эффициента экстинкции и квантового выхода (ε × Φ). Эта величина прямо пропорциональна яркости и учитывает количество поглощенного света и эф фективность эмиссии флуорофора. СВОЙСТВА СИНТЕТИЧЕСКИХ ФЛУОРОФОРОВ Флуорофоры с эмиссией флуоресценции в УФ и синей области спектра Флуорофоры с эмиссией в УФ-области спектра не так часто применяются для мечения объектов живых систем, поскольку УФ-свет для них токси чен. Кроме того, флуоресцентные сигналы этих ме ток сложно отличить от автофлуоресценции самой клетки. Классический пример флуорофоров с эмис сией в ближней УФ-области спектра - производные пирена (рис. 1), которые характеризуются λex = 340 нм, λem = 376 нм, высокими значениями квантового выхода Φ = 0.75, химической устойчивостью и боль шими временами жизни флуоресценции, что позво ляет молекулам флуорофора образовывать эксиме ры с батохромным сдвигом в спектрах эмиссии. Эти свойства пиренов используются для мониторинга конформационных изменений в структуре белков [10], а также для определения концентрации ионов некоторых металлов [11, 12]. Производные пирена, такие, как 8-гидрокси-1,3,6-пирентрисульфонат (пиранин, рис. 1), применяют в качестве рН индикаторов, а также сенсоров ионов Cu+ [13]. Производное 8-O-карбоксиметилпиранин имеет λex/λem 401.5/428.5 нм и ε = 2.5 × 104 М-1см-1 (405 нм). Этот флуорофор может использоваться в качестве яркой, фотостабильной метки, излучающей в фио летовой области спектра, для многоцветного мечения клеточных объектов [14]. Флуоресцентные маркеры, основанные на про изводных кумарина, широко используются в ка честве хемосенсоров и в мечении биомолекул [15, 16]. Введение заместителя в 7-й позиции кумарина позволяет получить флуорофоры с эмиссией в ви димой области спектра, например, 7-гидрокси- 4-метилкумарин (рис. 2). Этот флуорофор име ет λex = 360 нм, λem = 450 нм, ε = 1.7 × 103 М-1см-1 и Φ = 0.63. Производные 7-гидроксикумарина служат внутриклеточным флуоресцентным сенсором фос фатазной активности, а его смешанные карбонаты используют для определения липазной и эстераз ной активностей [17, 18]. Родственное соединение 7-амино-4-метилкумарин (рис. 2) проявляет та кие же спектральные свойства, как и гидрокси-про изводное при значениях рН выше 5. Производное индола 4’,6-диамидино-2-фенилиндол (DAPI; рис. 3) впервые синтезировали в 1971 году в лаборатории Отто Данна в поисках лекарств против трипаносомоза. Это соединение оказалось неудач ным в качестве лекарственного средства, но облада ло способностью связываться с ДНК [19]. Поскольку связывание DAPI c ДНК сопровождается значи тельным увеличением флуоресценции в синей обла сти спектра (в связанном с ДНК виде λem = 461 нм), этот маркер широко используется для мечения ДНК в живой клетке [20]. Недавно показали, что при ос вещении УФ-светом либо лазером с длиной волны 405 нм DAPI претерпевает фотопревращение [21, 22]. При возбуждении фотоконвертированной формы DAPI с помощью аргонового лазера при 458 нм максимум эмиссии флуорофора сдвигается в зеленую область спектра (505 нм). Кроме того, фотоконверти рованная зеленая форма флуорофора обесцвечива ется при возбуждении синим цветом [22]. Это свой ство использовано в локализационной микроскопии единичных молекул (метод SMLM субдифракцион ной микроскопии) ДНК, что позволило реконструи ровать точную карту распределения этих молекул в ядрах клеток и в хромосомах в процессе митоза [20]. Флуоресцирующие производные дибензимида зола были впервые получены и применены хими ческой компанией Hoechst AG для флуоресцентной микроскопии. Соединение Hoechst 33342 (рис. 3) флу оресцирует в цианово-синей области спектра и име ет максимум эмиссии при 461 нм. Оно связывается с ДНК, хорошо проникает через клеточную мембрану и пригодно для экспериментов в живой клетке [20]. Биман, 1,5-диазабицикло[3.3.0]окта-3,6-диен- 2,8-дион (рис. 3), имеет λex = 390 нм, λem = 482 нм и Φ = 0.3. Флуоресценция бимана тушится в присут ствии триптофана и тирозина, причем степень туше ния зависит от расстояния между этими остатками (≤ 10-15 нм). Это свойство флуорофора использовали для определения конформационных изменений фер ментов в реальном времени при связывании субстра та [23, 24]. Флуорофоры с эмиссией в зелено-желтой области спектра NBD (4-нитробензо-2-окса-1,3-диазол) и его про изводные обладают эмиссией в зеленой области спектра. NBD-хлорид (рис. 4) реагирует по ами но- и тиоловым группам. Соединения NBD-хлорида с первичными аминами обладают максимумами возбуждения и эмиссии λex = 465 нм, λem = 535 нм (ε = 2.2 × 104 М-1см-1 и Φ = 0.3). Другое производное NBD, селективно взаимодействующее с цистеином, успешно использовали в качестве флуоресцентного сенсора Cys в клетках HeLa [25]. Чувствительность производных NBD к микроокружению оказалась важной при получении липидных маркеров [26, 27] или новых субстратов киназ [28]. На основе NBD соз даны сенсоры Cu2+ и S2-, позволяющие определять концентрацию этих ионов в живой клетке [29]. NBD-SCN использовали для детекции цистеина и гомоцистеина. Замена тиоцианатной группы на ци стеин или гомоцистеин приводит к 470- и 745-кратно му увеличению интенсивности флуоресценции NBD при 550 нм соответственно [30]. Кроме того, NBD-SCN обладает достаточно высокой мембранопроницаемо стью и может применяться для визуализации кон центрационных изменений цистеина и гомоцистеина в живой клетке [30]. В число наиболее часто используемых флуоро форов с эмиссией в зеленой спектральной области входят производные нафталина. Эта группа ме ток включает в себя реагирующий по аминогруп пам дансилхлорид и EDANS (рис. 4). Производные этого соединения имеют λex = 336 нм, λem = 520 нм, ε = 6.1 × 103 М-1см-1 и Φ = 0.27. Флуоресцентные мар керы на основе EDANS в настоящее время приме няют в экспериментах in vivo [31]. Еще один флу орофор - 4-амино-3,6-дисульфонилнафталимид, характеризуется эмиссией флуоресценции в жел той области спектра. Карбогидразид этого соедине ния под названием Люцифер желтый (λex = 428 нм, λem = 534 нм, рис. 4) применяется в качестве полярной метки и в экспериментах при двухфотонном возбуж дении [32]. Флуорофор флуоресцеин (рис. 4) обладает не обычными свойствами: в водных растворах он мо жет существовать в семи прототропных формах, включая наиболее биологически значимые моно анионную и дианионную, которые взаимопревра щаются с рКа ~ 6.4 [33]. Дианион представляет собой форму с наибольшей флуоресценцией (λex = 490 нм, λem = 514 нм, ε = 9.3 × 104 М-1см-1 и Φ = 0.95). рН чувствительность производных флуоресцеина была использована для получения флуоресцентных рН индикаторов [34, 35]. На основе этих производных получены сенсоры ионов различных металлов, на пример, Fluo-3 для измерения концентрации ионов кальция в живых клетках [36, 37]. Флуоресцеин су ществует в двух равновесных формах - в виде лак тона и в хиноидной форме (рис. 4). Ацилирование или алкилирование фенольных групп приводит к фиксации молекулы в виде нефлуоресцентного лактона, что может быть использовано для получе ния флуорогенных субстратов ряда ферментов [38, 39]. Флуорофоры на основе флуоресцеина облада ют и существенными недостатками. У них высокая скорость фотообесцвечивания, их широкая полоса эмиссии ограничивает применение этих флуорофо ров в многоцветном мечении клеточных объектов, также они обладают выраженной тенденцией к само тушению при высоких плотностях включения метки в ЦКБ. Еще одна группа синтетических флуорофоров с эмиссией в зеленой области основана на произво дных родамина. Введение различных заместителей в структуру родамина позволяет настраивать его спектральные характеристики. Наиболее харак терный пример - родамин 110 (рис. 5) (λex = 497 нм, λem = 520 нм, ε = 7.6 × 104 М-1см-1 и Φ = 0.88 [40]). Введение заместителей в виде четырехчленных азе тидиновых колец по двум атомам азота значительно увеличивает квантовый выход и яркость флуорофо ра [41], в то время как введение четырех метильных групп по атомам N, N’ приводит к смещению мак симумов возбуждения и эмиссии в более длинно волновую область (λex/ λem 548/572 нм), но снижает квантовый выход флуорофора (Φ = 0.41) в водных растворах [42]. Родамины, содержащие вместо ами ногрупп жесткие циклические системы, имеют бо лее высокие квантовые выходы и спектры, сдвину тые в более длинноволновую область. В частности, сульфородамин 101 (Texas Red) (рис. 5) и его произ водные - одни из наиболее часто применяемых в кле точной биологии [43, 44], используются также в ка честве фотосенсибилизаторов в фотодинамической терапии [45]. Родаминовые метки вместе с флуорес цеином входят в состав FRET-пар [46, 47]. При заме щении обеих аминогрупп родамина можно получить его нефлуоресцирующее производное. Это свойство используется в синтезе фотоактивируемых аналогов родамина [48] и для получения флуорогенных суб стратов при изучении механизмов ферментативного катализа. Производные родамина 110 использовали в качестве субстратов для определения активности различных ферментов [49]. Гибридные флуорофоры, состоящие из квантовой точки и родамина, соеди ненных полипептидом, расщепляемым каспазой-1, использовали в тестах на апоптоз [50]. Производные родамина применяют также при конструировании индикаторов pH и ионов некоторых металлов [51, 52]. Соединения под общим торговым названием Alexa Fluor объединяют большую группу гидрофильных отрицательно заряженных меток, представляющих собой сульфированные производные флуорофоров различных типов, таких, как флуоресцеин, кумарин, цианин или родамин. Хорошо известный Alexa Fluor 488 является производным родамина и обладает свойствами, во многом схожими с FITC (λex = 493 нм, λem = 519 нм). Однако в отличие от FITC, Alexa Fluor 488 более фотостабилен, обладает большей яркостью и меньшей рН-чувствительностью. В сравнительных экспериментах по специфическому мечению моди фицированных гистонов оптимальные результаты показали Fab-фрагменты, меченные Alexa Fluor 488 [53]. Alexa Fluor 488 может служить флуорофором донором для изучения структуры различных кле точных рецепторов с использованием эффекта FRET [54]. Флуорофоры с эмиссией в красной, дальнекрасной и ближней инфракрасной области спектра Флуорофоры с эмиссией флуоресценции в дальне красной и ближней инфракрасной области спектра представляют наибольший интерес, поскольку свет, возбуждающий флуоресценцию этих флуорофоров, не токсичен для живых систем. Кроме того, инфра красные лучи способны проникать в живые ткани на существенно большие расстояния, чем более ко ротковолновые. Также на визуализацию биомоле кул в живых системах с помощью дальнекрасных и инфракрасных флуорофоров фоновая автофлу оресценция практически не влияет. К сожалению, большинство известных синтетических флуорофо ров этой группы страдают существенным недостат ком - низким квантовым выходом флуоресценции в водных растворах. Среди флуорофоров этой груп пы особого внимания заслуживают производные флуоресцеина и родамина, в которых ксантеновые структуры модифицированы за счет добавления ароматических колец. Эти заместители вызывают значительный батохромный сдвиг в спектрах флу оресценции. Одно из таких производных - нафтоф луоресцеин (рис. 5) - в щелочных условиях флуо ресцеирует в значительно более длинноволновой спектральной области (λex/λem - 595/660 нм). Однако все преимущества этой дальнекрасной флуоресцент ной метки нивелируются более низким коэффици ентом экстинкции (ε = 4.4 × 104 М-1см-1) и квантовым выходом (Φ = 0.14). Производные этого ряда успешно использовали в качестве различных сенсоров в жи вых клетках [55, 56]. Для получения более длинноволновых произво дных родамина синтезированы его аналоги, в кото рых атом кислорода между двумя ароматическими циклами заменен на атомы кремния (Si-родамин), германия (Ge-родамин) или олова (Sn-родамин) [57]. Полученные производные сохраняют важные ха рактеристики самого родамина, такие, как высокий квантовый выход в водных растворах, устойчивость к фотообесцвечиванию и хорошую растворимость в воде. При введении дополнительных ароматиче ских заместителей в Si-родамин получены три новых соединения SiR680, SiR700 и SiR720 с флуоресценци ей в ближнем инфракрасном диапазоне (670-740 нм). Показано, что SiR680 и SiR700 обладают достаточно высокими квантовыми выходами в водных растворах (Φ = 0.35 и 0.12 соответственно) [58]. Активированные сукцинимидные производные SiR700 использовали in vivo для визуализации развития опухолей [58, 59]. Замечательными фотофизическими свойствами обладают ксантеновые метки, структура которых расширена одним ароматическим кольцом. В отли чие от симметричных флуоресцеинов и родаминов, резонансные формы этих меток неэквивалентны друг другу и поэтому различаются спектральными свойствами. Таким образом, асимметрия этих меток может использоваться для создания ратиометриче ских флуоресцентных индикаторов. По соотношению (ratio) интенсивностей флуоресценции различных форм таких индикаторов можно точно определять внутриклеточную концентрацию различных ионов. Флуорофоры на основе семинафтофлуоресцеиново го ядра служат рН-сенсорами и индикаторами дру гих ионов. Семинафтоксантены на основе родолового ядра также используются как рН-индикаторы. Один из примеров - ратиометрический рН-сенсор, семи нафтородафлуор (рис. 5) [60, 61]. Это соединение имеет λex = 573 нм, λem = 631 нм, ε = 4.4 × 104 М-1см-1 и Φ = 0.092 при повышенных значениях рН. Резоруфин (рис. 6) используется, в частности, для детекции эндогенной фосфатазной активности в живых клетках в реальном времени [62]. При pH более 7.5 резоруфин существует в виде аниона с эмиссией флуоресценции в красной области спек тра (λex = 572 нм, λem = 585 нм, ε = 5.6 × 104 М-1см-1 и Φ = 0.74). При понижении pH интенсивность флуо ресценции этой метки значительно снижается. Некоторые синтетические флуорофоры могут быть модифицированы таким образом, что их флу оресценция «включается» только после активации светом определенной длины волны. Эти фотоакти вируемые, или скрытые, флуорофоры использу ются для визуализации процессов в динамике, где требуется активация небольших популяций флуо ресцентных маркеров, с разрешением во времени и пространстве. Такие флуорогенные маркеры по лучают, в частности, с помощью реакций флуоро фора с о-нитробензилбромидом. Молекула может быть активирована при облучении светом 365 нм, при этом о-нитробензильная группа отщепляется с высвобождением активного флуорофора (рис. 6). Используя метод фотоактивации метки, конъюгиро ванной с тубулином, впервые было показано актив ное передвижение микротрубочек в процессе митоза и изучена динамика актиновых микрофиламентов [63]. Получен ряд фотоактивируемых аналогов ку марина, способных проникать в клетку [64, 65]. После проникновения внутрь клетки небольшая популяция молекул кумарина была активирована и использова лась как флуоресцентный репортер для наблюдения за миграцией молекул через щелевые контакты [65]. Соединения на основе бордифтордипиррометена, широко известные под названием BODIPY, служат основой для создания флуоресцентных маркеров [66, 67], в том числе для мечения биомолекул в живых клетках [68]. Они характеризуются высокой фото стабильностью и квантовым выходом, нейтральным зарядом и узкими полосами поглощения и эмиссии. Метки этого ряда можно настроить на нужную длину волны с помощью определенных заместителей [69]. Однако широкое использование этих замечательных флуорофоров ограничено их плохой растворимостью в воде. Некоторые флуорофоры ряда BODIPY (рис. 7) обладают спектральными свойствами, сходными с флуоресцеином, например BODIPY FL (λex = 505 нм, λem = 511 нм, ε = 9.1 × 104 М-1см-1 и Φ = 0.94). Введение дополнительных ароматических заместителей в мо лекулу BODIPY FL (рис. 7) сдвигает эмиссию в крас ную и дальнекрасную область (BODIPY TR, BODIPY 630/650 и BODIPY 650/665). Большая часть меток, полученных на основе BODIPY, относятся к стабильным флуоресцентным маркерам. Помимо этого, получены флуорофоры с оптическими свойствами, изменяемыми при фото активации или присоединении к биологически важ ным молекулам [70, 71]. Нейтрально заряженный BODIPY способен проникать через клеточную мем брану. BODIPY и некоторые его производные облада ют значительной липофильностью и, как следствие, накапливаются в основном в мембранах субклеточ ных структур [72]. Поэтому для визуализации био молекул, локализованных в цитозоле, необходимо иметь модифицированные производные BODIPY, содержащие гидрофильные заместители. BODIPY и его производные имеют небольшой сдвиг Стокса, что является причиной самотушения этих маркеров при большой плотности мечения био молекулы. Это свойство используется для создания флуорогенных субстратов протеиназ, интенсивность флуоресценции которых возрастает при протеолизе белков, меченных этой меткой с большой плотностью [73]. Карбоцианиновые метки (цианины) представля ют собой соединения с полиметиновыми цепями раз личной длины с нечетным числом атомов углерода, расположенных между двумя атомами азота (R2N- (CH=CH)n-CH=N+R2) [70] (рис. 8). Структура этих соединений очень похожа на структуру хромофора зрительного пигмента родопсина [74]. Это свойство недавно использовали для получения конструкции, кодирующей специфический белок, связывающий ретиноевую кислоту (CRABPII), способный образо вывать комплекс с флуорогенным производным циа ниновой метки. Этот комплекс, в отличие от исходно го профлуорофора, обладает яркой флуоресценцией в дальнекрасной области спектра и высоким кван товым выходом [75]. Гемицианиновыми называют метки, у которых только один концевой атом азота включен в ароматический гетероцикл. Гемицианины используют в качестве ратиометрических флу оресцентных сенсоров pH в экспериментах in vivo [76]. Цианиновые метки, у которых несущие заряд концевые атомы непосредственно связаны с мети новой цепью, называются стрептоцианиновыми. Стрептоцианиновые метки использовали в качестве индикатора активности супероксиддисмутазы [77]. Карбоцианиновым соединениям присвоены назва ния, соответствующие количеству атомов углерода между дигидроиндольными составляющими моле кулы. Cy3 (рис. 8) по спектральным характеристикам сопоставимо с тетраметилродамином (λex = 554 нм, λem = 568 нм). У Cy5 спектры сдвинуты в длинновол новую область (λex = 652 нм, λem = 672 нм), а у более протяженных конструкций, таких, как Cy7, наблюда ется эмиссия флуоресценции в ближнем инфракрас ном диапазоне (λex = 755 нм, λem = 788 нм). Цианины имеют высокие значения коэффициента экстинкции (до 300 000 M-1cм-1) и хорошо растворимы в воде. Поглощение и эмиссию можно сдвигать в более длинноволновую область либо за счет увеличения протяженности полиметиновой цепи, либо за счет ароматической части концевых гетероциклических фрагментов. Удлинение полиметиновой цепи на два атома углерода сдвигает максимум поглощения на ~ 100 нм, в то время как добавление бензольного кольца к концевому индольному остатку приводит к сдвигу поглощения примерно на 30 нм [78]. Такие структурные модификации, как в последнем случае, обозначают индексом «.5», например, Cy5.5. п-Нитробензоильное производное гептацианино вого флуорофора с эмиссией в ближнем инфракрас ном диапазоне использовали как ратиометрический сенсор цистеина в митохондриях при окислительном стрессе. Показана возможность применения это го флуорофора в живых мышах в качестве сенсора уровня Cys [79] и глутатиона в живых клетках [80]. CАЙТ-НАПРАВЛЕННЫЕ РЕАКЦИИ ВКЛЮЧЕНИЯ СИНТЕТИЧЕСКИХ ФЛУОРОФОРОВ В ЦКБ Реакции ковалентного связывания В настоящее время для связывания синтетических флуорофоров с функциональными группами биомо лекул используют различные химические реакции [81]. Наиболее часто применяется сукцинимидный эфир (рис. 9), который после реакции с первичными и вторичными аминогруппами образует стабильную амидную связь, также используется изотиоцианат. Флуорофоры, модифицированные йодацетамидом, малеимидом или дитиолами, применяют для мечения по сульфгидрильным группам. Особое внимание привлекает метод биоортого нального конъюгирования [82] и так называемая «клик»-химия [83-85]. В этом случае химические группы, вступающие в реакцию конъюгирования с биомолекулой, не реагируют с другими функцио нальными группами. Включение этих химических групп в молекулу происходит либо за счет мета болического аппарата клетки [86, 87], либо за счет ферментативной активности ЦКБ [88, 89]. Всем требованиям биоортогональной химической груп пы удовлетворяет азидная группировка, так как ей свойственна высокая реакционная способность при селективности реакций, устойчивости в водной среде и низкой реакционной способности по отно шению к функциональным группам биологических молекул. Введение небольшой азидной группы при водит лишь к незначительным структурным пер турбациям биомолекулы. Включенная в клеточный объект биоортогональная метка может ковалентно связываться с флуорофором за счет высокоселек тивных химических «клик»-реакций, классическим примером которых служит циклоприсоединение ази да к алкинам (рис. 9), катализируемое одновалент ной медью [90, 91]. Однако катализируемые медью реакции могут применяться в основном в опытах in vitro, поскольку в живых системах катализатор должен доставляться к месту реакции. Кроме того, медь в концентрациях, используемых для мечения, токсична. Бертоцци и соавт. [92] разработали метод модификации, в котором алкин включен в состав на пряженного восьмичленного кольца (рис. 9). В этой системе алкин проявляет повышенную реакцион ную способность и не требует катализатора. Позднее получили дифторциклооктины [93] с гораздо более высокой реакционной способностью, позволяющей применять «клик»-химию для меченных азидом био молекул в живых организмах [94]. Еще один пример биоортогональной реакции, используемой для мече ния in vivo, - реакция лигирования по Штаудингеру (рис. 9) [95, 96]. Реакции с образованием сульфидов и металл хелатных комплексов флуорофора с ЦКБ Один из перспективных методов конъюгации син тетических флуорофоров с ЦКБ - введение с по мощью генетических манипуляций небольшой по следовательности аминокислот в целевой белок. Эта последовательность должна иметь достаточно высокое сродство к выбранному флуоресцентному маркеру. Например, последовательность Cys-Cys- Pro-Gly-Cys-Cys, благодаря вставке -Pro-Gly-, об разует структуру, подобную шпильке [97]. Четыре остатка цистеина, таким образом, образуют кластер, имеющий высокое сродство к органическим соедине ниям мышьяка [98]. В частности, дважды замещен ное мышьяком производное флуоресцеина FlAsH (λex = 508 нм, λem = 528 нм) образует с такой тетраци стеиновой последовательностью комплекс с констан той диссоциации в пикомольном интервале (рис. 10А) [8, 99]. Кроме того, FlAsH обладает ярко-зеленой флуоресценцией только в связанном с тетрацисте иновой последовательностью виде, что существенно снижает фоновую флуоресценцию. Кроме FlAsH, су ществует ReAsH (λex = 593 нм, λem = 608 нм), маркер на основе резоруфина (рис. 10А), который обладает флуоресценцией в красной области спектра [8, 100]. Следует отметить, что FlAsH и ReAsH проникают через мембрану, что облегчает их введение в клетку. Их недостаток - побочные реакции с монотиолами, однако неспецифическое связывание может быть по давлено избытком дитиотреитола. Мечение с помо щью FlAsH и ReAsH затруднено также в окислитель ных условиях вследствие окислительных реакций последовательности тетра-Cys. В еще одном методе включения флуорофора в ЦКБ используются координационные соедине ния с металлами [101]. Комплексообразователем здесь служит полигистидиновая последователь ность ((His)n, где n ≥ 6), которая образует комплексы с нитрилотриацетатом никеля (Ni2+-NTA) (рис. 10Б). Для специфического мечения белков с поли-His последовательностью синтезированы производные цианиновых меток с ковалентно присоединенными одним или двумя Ni2+-NTA. Двузамещенные произ водные Cy3 и Cy5 показали более высокую аффин ность по сравнению с однозамещенными и исполь зовались в экспериментах FRET для определения расстояний при образовании комплекса ДНК с поли- His-меченым белком [102]. Ключевой недостаток системы поли-His/Ni2+-NTA для in vivo экспериментов - низкая аффинность свя зывания (значения Kd в пределах 1-20 мкM), что не гативно сказывается на стабильном включении метки и, в конечном итоге, на визуализации ЦКБ. Пиелер и соавт. синтезировали производные флуоресце ина с ковалентно связанными 1-4 остатками NTA и охарактеризовали их взаимодействие с поли-His последовательностью (His6 и His10). Стабильность связывания мультивалентных хелатирующих групп возрастала более чем на 4 порядка и достигала суб наномолярного уровня в сравнении с моно-NTA [103]. Еще одно серьезное препятствие для примене ния Ni2+-NTA-комплекса in vivo - плохое прохож дение через клеточную мембрану. Для доставки Ni2+-NTA внутрь клетки Тампе и соавт. исполь зовали мембранотранслоцирующий ТАТ-пептид (49RKKRRQRRR57) [104]. Полученный комплекс trisNTA/His6-TAT49-57 использовали в качестве переносчика флуоресцентно меченного NTA в клет ку - в цитозоль и ядро, далее trisNTA преимуще ственно связывался уже с His10-меченым внутри клеточным белком. При этом транслоцирующий His6-TAT49-57 пептид высвобождался, поскольку имел большую аффинность связывания (Kd = 0.1 нM) с His10 [103]. Другой подход к получению мембранопроницае мых конструкций применили Сан и соавт. [105]. Они синтезировали соединение, в котором NTA ковалент но связан с флуорофором и арилазидом (Ni2+-NTAAC). Ni2+-NTA-AC прекрасно проходил через кле точную мембрану и связывался с внутриклеточными белками, несущими поли-His-последовательность. После активации светом арилазид ковалентно свя зывался с ЦКБ, что приводило к 13-кратному уве личению флуоресценции и образованию устойчивой связи с флуоресцентной меткой. Помимо тетрацистеиновой и поли-His-последовательностей для мечения ЦКБ использовали также поли-Asp ((Asp4)n, где n = 1-3). Хамачи и соавт. син тезировали многоядерные комплексы Zn2+, меченные флуоресцеином (на рис. 10В показан двухъядерный комплекс Zn2+) [106]. Увеличение аффинности в этом случае наблюдалось при большей длине цепи поли- Asp. С помощью тетраядерных комплексов Zn2+ про ведено флуоресцентное мечение мускаринового аце тилхолинового рецептора, при котором сохранялась его исходная активность. Сайт-направленное мечение с помощью ферментативных реакций Еще один метод включения флуорофора в ЦКБ ос нован на ферментативных реакциях. В этих техно логиях используются так называемые методы SNAPtag [107], CLIP-tag [108], HALO-tag [109] и TMP-tag [110-112]. В методе SNAP-tag O6-алкилгуанинтрансфераза (АГТ, рис. 11А) используется в качестве белка слия ния с ЦКБ. АГТ имеет молекулярную массу 20 кДа, она переносит алкильные группы с O6 алкилиро ванного остатка гуанина на остаток цистеина в ак тивном центре фермента (см. обзор [113]). Показано, что при инкубации клеток, экспрессирующих АГТ- ЦКБ, с O6-бензилгуаниновым субстратом, в котором бензильная группа в пара-положении несет флуоро фор, происходит флуоресцентное мечение АГТ-ЦКБ по цистеину в активном центре АГТ [9]. Получены также мутантные формы АГТ, которые катализиру ют реакцию переноса алкил-радикала на АГТ-ЦКБ в 50 раз быстрее, чем фермент дикого типа [107]. В настоящее время технология SNAP-tag наиболее часто используется для мечения внутри- и внекле точных белков. Метод CLIP-tag похож на SNAP-tag, в нем ис пользуется мутантная форма АГТ, субстратами которой являются флуоресцентные аналоги O2 бензилцитозина (рис. 11Б) [108]. Несмотря на сход ство этих технологий, SNAP-tag и CLIP-tag имеют различную субстратную специфичность и могут при меняться для визуализации одновременно несколь ких клеточных объектов. В методе HALO-tag белком слияния служит ген но-инженерный вариант фермента галоалкандега логеназы, которая вступает в специфическую реак цию с галогензамещенными алканами, ковалентно связанными с флуорофором (рис. 11В) [114, 115]. Эта реакция, в которой образуется ковалентная связь между ферментом и флуоресцентно меченным ал каном, высокоспецифична и позволяет быстро вво дить метку в белки in vitro и in vivo (103-106 M-1 с-1) в физиологических условиях, причем, что важно, эта реакция необратима. Стоит отметить, что во всех перечисленных мето дах для достижения высокого контраста требуется тщательная отмывка непрореагировавшей метки. Для устранения этого недостатка были синтезирова ны флуорогенные субстраты для SNAP-tag, которые содержат ферментативно удаляемый тушитель флу оресценции (рис. 11А). В результате ферментативной реакции с SNAP-tag химическая группа-тушитель отщепляется, что дает почти 50-кратное увеличе ние интенсивности флуоресценции. Преимущество таких «no wash» флуорофоров показано с помощью пространственно-временной динамики рецепторов эпидермального фактора роста в процессе миграции клеток [116]. Альтернативную систему представляет собой TMPtag, в котором в качестве фермента, соединенного с ЦКБ, используется мутант дигидрофолатредуктазы (еДГФР L28C) из Escherichia coli (мол. масса ~18 кДа). В результате ферментативной реакции флуоресцент но меченный 2,4-диамино-5-(3,4,5-триметоксибензил) пиримидин (триметоприм, или TMP) связывается с еДГФР-ЦКБ (рис. 11Г), экспрессируемой в живот ных клетках. Система имеет достаточно низкие зна чения фоновой флуоресценции и быструю кинетику [111]. Для дальнейшего снижения фоновой флуорес ценции, обусловленной несвязавшейся или неспецифически связавшейся флуоресцентной меткой, по лучено нефлуоресцирующее TMP-производное, содержащее флуорофор и его тушитель. В процес се ферментативной реакции TMP-лиганд связыва ется с еДГФР-ЦКБ, при этом тушитель удаляется. Эффективность данного метода показана при мечении гистонов в ядрах клеток HEK 293T [117]. ЗАКЛЮЧЕНИЕ За последние годы методы визуализации биомоле кул в живых системах с помощью синтетических флуорофоров претерпели значительные изменения, последовательно преодолевая различные экспери ментальные и концептуальные ограничения, что, в первую очередь, касается сайт-направленных ре акций, позволяющих вводить флуоресцентную метку в ЦКБ. На основе новых фотопереключаемых флу орофоров стремительно развивались современные технологии, такие, как субдифракционная микро скопия, позволяющая визуализировать клеточные объекты с разрешением в нанометровом диапазоне. Метод биоортогонального мечения позволил вво дить в ЦКБ синтетические флуорофоры, которые по своим размерам значительно меньше ФБ. Этот ме тод также предоставляет возможность мечения вну тренних сайтов ЦКБ, в отличие от N- и C-концевых областей при использовании ФБ. Кроме того, спек тральные свойства синтетических флуорофоров подвергаются более легкой настройке по сравнению с ФБ. Также с помощью синтетических флуорофоров возможно осуществлять мечение небелковых объ ектов (нуклеотидов, липидов, гликанов, метаболитов и т.п.). Хотя конструкции, применяемые в фермента тивных методах введения флуорофора (SNAPtag, CLIP-tag, HALO-tag и TMP-tag), сопоставимы по размеру с ФБ, эти методы позволяют вводить лю бые небольшие молекулы в ЦКБ. Ферментативные методы включения флуорофоров в ЦКБ в последние годы все чаще привлекаются для решения сложных задач современной биологии и медицины. Следует отметить, что описано использование этих техноло гий в трансгенных животных [118]. В настоящее время метод с образованием металл хелатных комплексов и сульфидов также часто ис пользуется для флуоресцентного мечения in vivo. В отличие от предыдущих, в нем используется не большой пептидный фрагмент, слитый с ЦКБ. Со времени появления первой публикации, в которой описано использование FlAsH, созданы новые флуо рофоры с большей аффинностью связывания и боль шей яркостью флуоресценции. На основе металл-хе латных технологий получены также ЦКБ, меченные фотопереключаемыми флуоресцентными метками. Учитывая множество прикладных задач, суще ствующих в визуализации биомолекул в живых системах, маловероятным представляется созда ние единого универсального флуорофора, удовлет воряющего всем возможным требованиям. Кроме того, исследование сложных систем с несколькими целевыми объектами требует применения одновре менно нескольких различных флуорофоров. В этой связи дальнейший прогресс в этой области целиком зависит от синтеза новых флуорофоров, удовлет воряющих таким требованиям флуоресцентной ми кроскопии, как высокая фотостабильность, низкая фототоксичность при длительной визуализации объ екта, а также возможность мечения множественных объектов в живых системах.

Об авторах

В. И. Мартынов

Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН

Автор, ответственный за переписку.
Email: vimart@list.ru
Россия

A. A. Пахомов

Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН

Email: vimart@list.ru
Россия

Н. В. Попова

Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН

Email: vimart@list.ru
Россия

И. Е. Деев

Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН

Email: vimart@list.ru
Россия

A. Г. Петренко

Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН

Email: vimart@list.ru
Россия

Список литературы

Дополнительные файлы