Протеомные подходы в изучении микобактерий

Полный текст

ВВЕДЕНИЕ Системная биология прокариот стремится к пониманию того, каким образом физико-химические свойства и характер взаимодействия биомолекул связаны с формированием фенотипических свойств микроорганизмов. Нуклеотидную последовательность прокариотического генома в настоящее время можно расшифровать в течение нескольких часов. Тем не менее, несмотря на то, что геном прямо или косвенно кодирует основные биомолекулы клет ки, такие, как РНК и белки, описать особенности их функционирования, только опираясь на информацию о геномной последовательности, невозможно. Для исследования структуры, функций и механизмов регуляции таких молекулярных систем необходимы точные и воспроизводимые методы количественного измерения всех компонентов в различных состояниях. Сегодня такие измерения стали обычными для РНК [1-4], однако из-за технических ограничений на уровне белка они пока отстают в чувствительности и репрезентативности. Наиболее интенсивно методами системной биологии изучают клинически значимые микроорганизмы, в частности микобактерии. На сегодняшний день описано 213 видов микобактерий, многие из которых ассоциированы с инфекционными процесса ми у человека или животных [5]. К ним относятся Mycobacterium tuberculosis, M. leprae и M. ulcerans, вызывающие туберкулез, лепру (проказу) и язву Бурули соответственно. Согласно международной статистике, возбудителем туберкулеза инфицирована примерно треть населения Земли, при этом в 2015 году зарегистрировано около 1.3 миллиона смертельных исходов от этой инфекции [6]. Не уди вительно, что наибольший интерес вызывают особенности физиологии и молекулярной организации M. tuberculosis. До недавнего времени основные усилия были со средоточены на изучении особенностей геномной организации возбудителя туберкулеза. Сегодня до ступны данные геномного секвенирования более 10000 штаммов M. tuberculosis с различными фенотипами и генотипами. Однако опыт применения технологии полногеномного секвенирования с по следующим сравнительным анализом выявляет ограниченную пригодность такого подхода для пол ноценного описания причин развития лекарствен ной устойчивости и проявления патогенности [7]. Так, большинство точечных мутаций, отличающих группы штаммов, обнаружены в промоторных областях генов и/или участках, кодирующих белки с ги потетической функцией, роль которых в физиоло гии микобактерий неясна. В этой связи актуальным становится функциональный анализ информации, реализуемой геномом патогена, проводимый с при влечением методов протеомного тестирования, в том числе количественной протеомики. Стоит отметить, что на сегодняшний день выделение ДНК и РНК микобактерий и дальнейшие манипуляции с ними регламентированы достаточно большим количеством протоколов [8-10], которые применяются в различных лабораториях [11-16]. Иначе обстоят дела с выделением белков, особенно полной белковой фракции, необходимой для полу чения протеома. Особенности организации клеточной стенки, устойчивой к воздействию факторов внешней среды, в том числе к действию кислоты и щелочи, де лают M. tuberculosis достаточно сложным объектом для протеомного анализа. Последнее в свою очередь требует отработки уникальных условий экстракции белков. Реализуемые протоколы протеомного ана лиза M. tuberculosis должны быть также достаточно эффективными, учитывая сложность накопления значительной бактериальной массы из-за крайне медленного роста культуры. В данном обзоре рассмотрено развитие средств протеомного анализа микобактерий в хронологическом аспекте повышения их информативности и точности измерений. ПРОТЕОМНЫЕ ПОДХОДЫ В ИЗУЧЕНИИ МИКОБАКТЕРИЙ Развитие методов протеомного анализа микобактерий Марк Уилкинс в 1986 году впервые ввел термин «протеом», объединив два слова: «белок» (англ. PROTein) и «геном» (англ. genOME) [17]. Протеом - это совокупность белков в клетке, включая их изменения, происходящие со временем или под действием каких-либо факторов. В 1997 году по аналогии с геномикой, изучающей гены и их функции [18], появился термин «протеомика». Протеомика исследует совокупность белков, синтезируемых организмом/клеткой в данной среде и на конкретном этапе клеточного цикла. Она описывает качественный состав белков, их относительную представленность, взаимодействие с другими макро молекулами, а также посттрансляционные модификации (ПТМ) [19-21]. Протеомика все еще отстает от геномики и транс криптомики из-за инструментальных проблем и не достаточной чувствительности существующих методов, однако появляется все больше работ, в которых протеомные методы использовали для изучения инфекционных агентов. Стоит отметить, что наиболее весомый вклад в раз витие протеомики микобактерий внесли работы группы R. Aebersold [22, 23]. Основные работы по изучению белков микобактерий представлены в таблице. Ранние исследования в области протеомики M. tuberculosis, выполненные в конце прошлого века, опирались на стратегию так называемой «нисходя щей» (top down) протеомики, в основе которой лежит первичная сортировка интактных белков, вы деленных из биологического образца, согласно их физико-химическим свойствам (с использованием гель-электрофореза, гель-фильтрации) с последую щей идентификацией их масс-спектрометрическими (МС) методами (рис. 1). При таком подходе удавалось идентифицировать и квантифицировать около 100 белков микобактерий [24], что не превышает 3% общего протеома M. tuberculosis. Дальнейшее развитие средств протеомного анализа открыло новые пути изучения туберкулеза, об легчив исследование многих сложных вопросов, в том числе и взаимодействий бактерии с клеткой хозяина. Для получения полного протеома наиболее эф фективными считаются технологии, реализующие стратегию так называемой «восходящей» (bottom up) протеомики [20, 21], основанной на том, что общую массу белков, изолированных из биологического объекта, сначала протеолитически расщепляют на пептиды, которые затем непрерывным потоком анализируют с помощью высокоэффективной жид костной хроматографии, сопряженной с тандемной масс-спектрометрией (ВЭЖХ-МС/МС, от англ. liquid chromatography-coupled tandem mass spectrometry) (рис. 1). Все разнообразие «восходящих» мето дик на уровне МС-эксперимента можно разделить на (1) исследовательские или панорамные (shotgunproteomics) и (2) подтверждающие (таргетные, целевые) (рис. 2). Первые предназначены для идентификации и количественного анализа как можно большего числа белков и позволяют описать до 1000 белков M. tuberculosis за один запуск МС [25]. Вторые созданы для отслеживания во множестве образцов сравнительно небольшого, определенного до начала эксперимента, набора белков/пептидов с наивысшей доступной чувствительностью, точностью, воспроизводимостью и пропускной способностью метода (на пример, мониторинг множественных реакций (ММР), от англ. Multiple Reaction Monitoring). Стоит отметить, что при реализации панорамного подхода наиболее точные результаты количествен ного сопоставления образцов достигаются при изотопном мечении одного из аналитов [38]. В частности, метод изотопного мечения белков в культуре клеток (от англ. Stable Isotope Labeling by Amino acids in cell Culture, SILAC) основан на встраивании в структуру белка незаменимых аминокислот, содержащих стабильные изотопы (обычно 13С/15N аргинин и/или лизин) [39, 40]. Подразумевается, что анализируемые клетки не должны синтезировать лизин и аргинин самостоятельно и использовать исключительно находящиеся в среде меченые аминокислоты. Однако M. tuberculosis обладает способностью синтезировать лизин эндогенно, что сразу ограничивает возможности данного подхода. В последнее время основной акцент в количественной протеомике микобактерий сделан на использовании безметочных методов МС квантификации белков, обладающих большей чувствительностью и производительностью [31, 41]. Новые подходы к накоплению и обработке масс спектров, например SWATH™ от компании ABSciEX, совмещают панорамные (data-independent acquisition, DIA) и подтверждающие (data-dependent acquisition, DDA) методики с целью минимизировать огра ничения каждой из них [42]. При этом для SWATH™ не требуется отбор единичных родительских ионов, а ионы прекурсоры пропускаются большими окнами (к примеру, в 25 Да). Таким образом, SWATH™ позволяет идентифицировать и квантифицировать боль ой набор белков, подобно классическим панорамным подходам, но с точностью и воспроизводимостью ММР для большего числа образцов. ОСОБЕННОСТИ ПРОТЕОМА ОТДЕЛЬНЫХ ГРУПП МИКОБАКТЕРИЙ Протеомная характеристика штамма M. tuberculosis H37Rv На сегодняшний день M. tuberculosis H37Rv является наиболее хорошо изученным штаммом микобактерий. Отметим, что геномная последовательность этого штамма была полностью расшифрована еще в 1998 году [43]. Закономерно, что протеом этого штамма также изучен максимально полно. К настоящему моменту с использованием комплексных протеомных подходов подтверждено существование 97% белков из 4012 аннотированных на основании геномной по следовательности [23]. Описаны пулы мембранных белков и клеточной стенки [32, 44], цитозольные белки [25, 30, 45], секретируемые белки, определяемые в культуральном фильтрате [46]. Анализ белков регулона DosR, ассоциированного с анаэробным выживанием M. tuberculosis, позволил выявить изменения их представленности в бактери альной культуре штамма H37Rv, помещенного в условия гипоксии [29]. В частности, при гипоксии пред ставленность белка HspX увеличивалась в 340 раз по сравнению с культурой, находящейся в нормальных условиях. Стоит отметить, что до этого данный регулон изучали исключительно на уровне транс криптов [47, 48]. Отдельно стоит упомянуть исследования, в которых моделировали инфекционный процесс и оценивали белковый профиль M. tuberculosis в условиях, максимально приближенных к существованию бактериальных клеток в живом организме. В работе Cho и соавт. [49] проведен сравнительный протеомный анализ бел ков латентной формы штамма H37Rv в экспоненциальной, логарифмической и стационарной фазах роста с использованием технологии сайт-специфического мечения остатков цистеина (от англ. isotope-coded affinity tags, ICAT), основанной на ковалентном мечении остатка цистеина в полипептидной цепи химически идентичными, но изотопно разными реагентами [22, 29]. По результатам были описаны высокопредставленные белки, характерные для экспоненциаль ной и стационарной фазы - 193 и 241 соответственно. Большинство этих белков относилось к системам де градации и энергетическому метаболизму. С целью изучения факторов вирулентности M. tuberculosis и поиска потенциальных кандидатов для разработки вакцин оценивали различия в про теомных профилях вирулентного штамма H37Rv и авирулентных микобактерий (M. tuberculosis H37Ra, M. bovis BCG). Выявлена одинаковая представленность большинства мембранных белков в штаммах H37Rv и H37Ra, тогда как представленность 121 белка в этих штаммах различается более чем в 5 раз. Дальнейшее изучение мембранных липопротеинов и данные о регуляции этих белков позволили предположить, что изменение метаболического состояния может играть роль в повышен ной вирулентности [32]. Изучение белков системы Esat-6 и ESAT-6-подобных белков, которые обнаруживаются только в штаммах H37Rv, но не в H37Ra, выявило мутации в генах пяти ESAT-6-подобных белков в штамме H37Ra. Стоит отметить, что анти ген 6 кДа (Esat-6) образует гетеродимерный комплекс с белком CFP-10 [50]. Таким образом, предполагают, что система ESAT-6/CFP-10 ассоциирована с вирулентностью M. tuberculosis и препятствует слиянию фагосомы и лизосомы внутри макрофагов хозяина, тем самым предотвращая разрушение клеток микобактерий [51]. Несмотря на то что H37Rv и M. bovis BCG на ге номном уровне имеют более 99.9% гомологии, выявлено 294 белка, статистически отличающихся между двумя штаммами [41]. Ранее при помощи сравни тельного геномного анализа этих штаммов обнаружили отсутствие определенных регионов различия (от англ. Regions of difference, RD) в геноме BCG, и с потерей соответствующих генов было связано отсутствие патогенности [52]. Таким образом, ряд раз личающихся белков соответствовал описанным RD [41, 53, 54]. Среди них особое внимание было уделено системе ESAT-6, белки которой ранее предложили в качестве кандидатов для разработки новой вакцины [55]. Дополнительно для разработки диагностических и вакцинных препаратов предложены 22 дифференциально экспрессирующихся белка, таких, как ацетил-CoA ацетилтрансфераза (Rv0243) и некоторые Esat-6-подобные белки (Rv1198, Rv1793) [54]. Протеомная характеристика семейства штаммов Beijing M. tuberculosis Как уже отмечалось выше, большинство работ посвящено изучению протеома лабораторного штамма M. tuberculosis H37Rv и лишь в небольшом количестве приведены протеомные характеристики других генетических семейств. Согласно современной классификации штаммы M. tuberculosis делят на семь генетических линий [56]. С клинической точки зрения несомненный интерес представляет семейство Beijing. Штаммы данного семейства относятся к филогенетической линии 2 и представлены в наибольшем количестве стран на глобальном уровне: 13% от мирового количества изолятов [57]. Также для них характерна ассоциация с формированием лекарственной устойчивости [58] и большая, чем у других семейств, вирулентность [59]. Сравнение протеомов штаммов Beijing и H37Rv выявило существенные различия между ними. В штаммах Beijing представленность белков Rv0129c, Rv0831c, Rv1096, Rv3117 и Rv3804c, относящихся к известным факторам вирулентности [60], была выше, чем в H37Rv, а содержание белков Hsp65 (Rv0440), Pst1 (Rv0934) и Rv1886c - основных анти генов, снижение выработки которых может способствовать уходу микобактерий от иммунного ответа хозяина [61, 62], было уменьшено. Кроме того, белки эффлюксных помп Rv0341, Rv2688c и Rv3728 найдены исключительно в штаммах Beijing [35]. Однако нам известны только две работы [31, 35], в которых изучали белковое разнообразие штаммов Beijing. В первой из них de Souza и соавт. сравнили протеомы гипо- и гипервирулентных штаммов данного семейства и описали около 50 белков, высоко представленных в каждой группе, при том, что всего идентифицировано 1668 белков [31]. Показано, что в гипервирулентных штаммах представленность белка ESAT-6 ниже, чем в гиповирулентных, причем этот результат дополнительно подтвержден срав нительной оценкой экспрессии соответствующего гена на уровне РНК-транскриптов. Стоит отметить, что увеличение относительной представленности белка ESAT-6 ранее рассматривали как характеристику вирулентных штаммов [51, 55]. Этот неоднозначный результат доказывает всю сложность роли путей секреции ESAT-6 в патогенности M. tuberculosis. Дополнительно он может свидетельствовать в пользу фенотипических различий между штамма ми семейства Beijing и штаммами H37Rv. Другая работа de Keijzer и соавт. посвящена сопоставлению белков штаммов M. tuberculosis, относящихся к древним (атипичным) и современным (типичным) сублиниям семейства Beijing [35]. Методом изотопного мечения аминокислот в культуре клеток в сочетании с ВЭЖХ-МС/МС идентифицировано и квантифицировано 2392 белка. Несмотря на то что по белковому профилю обе сублинии оказались крайне схожи, удалось выявить различия в представленности четырех белков - MmpL4 (Rv0450c), Rv3137, Rv1269c и SseA (Rv3283). Из них представленность белков MmpL4 (Rv0450c) и Rv3137 в группе типичных штаммов была значительно выше, чем в атипичных. Cреди белков, низкопредставленных в современных Beijing, отмечают SseA (Rv3283), уровень транскриптов которого также был снижен. Стоит отметить, что в структуре популяции воз будителя туберкулеза в России штаммы семейства Beijing занимают доминирующее положение (от 50 до 80%) [63, 64]. На основании VNTR-анализа представители данного семейства могут быть разделены на несколько типов [65, 66]. На территории страны наиболее распространены типы M2 и M11, составляющие около 80% всех выявляемых изолятов [66, 67]. Исследуя штаммы Beijing B0/W148, относящиеся к типу M11, мы подтвердили их ассоциацию с развитием мультирезистентности, обнаружили новые потенциальные пути формирования устойчивости к противотуберкулезным препаратам, а также описали уникальную геномную перестройку [15]. В свою очередь, нами проведен сравнительный протеомный анализ штаммов кластера Beijing B0/ W148 и штамма H37Rv [37]. В общей сложности идентифицировано 1868 белков штаммов кластера B0/ W148 и 1560 белков штамма H37Rv, из которых вы делена группа из 266 дифференциально представ ленных белков. Представленность 41 белка в штам мах кластера Beijing B0/W148 была выше, чем в штамме H37Rv, в то время как представленность 225 белков была ниже. Потенциальный биологический эффект этих различий мы оценили по обогащению функциональных категорий белков в ходе GeneOntology (GO) анализа и с привлечением регулятор ной сети генов [68]. Мы предполагаем, что некоторые из описанных нами особенностей представителей кластера Beijing B0/W148 способствуют повышенной вирулентности и успешному распространению этих штаммов. В частности, мы наблюдали увеличение представленности ферментов, ответственных за биосинтез длинноцепочечных жирных кислот, наряду со снижением представленности белков, ответственных за их деградацию. Микобактерии используют длин ноцепочечные жирные кислоты для получения ми котиоловых кислот и различных липидов, которые рассматривают как основные факторы вирулентности M. tuberculosis, проявляющиеся на начальных стадиях инфекции, когда бактерии попадают в макрофаг. Мы также отметили увеличение представленности белка HsaA, вовлеченного в деградацию стероидов. Показано, что M. tuberculosis используют внеклеточный холестерин в качестве источника энергии и для биосинтеза липидов клеточной стенки. Указанные наблюдения могут свидетельствовать в пользу повышенной выживаемости микобактерий в макрофагах, что является известной характеристикой штаммов кластера Beijing B0/W148 [69, 70]. Кроме того, нами зафиксирован очень низкий уровень белка SseA в штаммах B0/W148, что, возможно, приводит к накоплению активных форм кислорода и, как следствие, к повреждению ДНК. Это, в свою очередь, может вести к образованию широкого спектра генетических вариантов, способствующих выживанию бактериальной клетки под действием селективного отбора, в частности, во время лекарственной терапии. Отдельно стоит рассмотреть работы в области протеомики лекарственно-устойчивых штаммов M. tuberculosis [71-73]. Так, сравнение устойчивых и чувствительных штаммов позволило обнаружить пять белков (Rv0491, Rv1446c, Rv2145, Rv2971 и Rv3028c) с повышенной представленностью в штаммах, устойчивых к изониазиду [72]. Это мембранные белки, которые потенциально могут служить мишенью для новых лекарственных средств. Анализ штаммов, устойчивых к аминогликозидам, выявил в них повышенную представленность белков Rv0685, Rv1876 и Rv3841, ассоциированных с метаболизмом железа [73]. Ассимиляция и утилизация железа играют важную роль в росте, вирулентности и формировании латентной формы M. tuberculosis. Pandey и Rodriguez предположили, что ферритин (Rv3841) обязателен для поддержания гомеостаза железа в клетках микобактерий, при его недостатке бактерии становятся более восприимчивыми к воз действию антибиотиков [74]. В сходном исследовании также отмечено увеличение представленности бел ков Rv1876 и Rv3224, участвующих в обмене желе за, с указанием их возможной роли в формировании устойчивости к противотуберкулезным препаратам второго ряда [71]. Комплексное сравнение чувстви тельных штаммов и штаммов с множественной ле карственной устойчивостью позволило определить в резистентных штаммах такие факторы вирулент ности, как каталаза/пероксидаза (Rv1908c), акти вирующаяся в фагосомах [50]. Ранее было показано, что каталазная/пероксидазная активность необхо дима для роста клеток и их персистенции в мышах и морских свинках [75], а также в моноцитах пери ферической крови человека [76]. Дополнительно идентифицировали белки Rv0036, Rv2032c, Rv0635, Rv1827 и Rv2896c, вовлеченные в клеточный метаболизм и способствующие внутриклеточному выживанию. В одной из работ последних лет белки Rv2031c, Rv3692 и Rv0444c предлагается использовать в качестве биомаркеров для эффективной серодиагностики резистентных штаммов микобактерий [77]. Анализ посттрансляционных модификаций Развитие методов протеомного анализа позволяет не только провести инвентаризацию белков, сопоставить их представленность, но и выявить известные посттрансляционные модификации. На сегодняшний день описаны такие ПТМ белков M. tuberculosis, как О-гликозилирование [33, 78-84], фосфорилирование [85, 86], метилирование [87], аце тилирование [88], липидизация [33, 81, 82, 89-93], дезамидирование [94], N-формилирование [95, 96] и убиквитинирование [94, 97-102]. В частности, характеристика убиквитин-подобного белка Rv2111c M. tuberculosis стала первой описан ной убиквитин-подобной системой бактерий [101]. Убиквитинирование (присоединение к белку цепи из нескольких молекул короткого белка убиквитина) является универсальной ПТМ у эукариот, служащей сигналом к расщеплению этого белка протеасомой. Идентификация соответствующих белков затрудни тельна, так как они довольно быстро элиминируются. Изначально сайты убиквитинирования были обнаружены в 41 белке M. tuberculosis [103]. На сегодняшний день описаны 602 убиквитин-подобных белка мико бактерий, но только у 55 из них экспериментально установлены сайты модификаций [102]. Другая распространенная ПТМ - фосфорилирование. В 301 белке M. tuberculosis выявлено 516 сайтов фосфорилирования серина/треонина киназами. Эти данные использовали для поиска возможных мотивов для объяснения фосфорилирования киназами. Удивительно, но шесть из восьми исследованных киназ содержали консервативные мотивы, что указывает на высокий уровень избыточности функций киназ в M. tuberculosis [86]. Липопротеины, экспортируемые общим секреторным путем и процессируемые сигнальной пептидазой II, модифицируются путем ацилирования N-концевого цистеина. У микобактерий эти модификации недостаточно хорошо охарактеризованы. Некоторые липопротеины также могут подвергаться О-гликозилированию вблизи N-конца. В дан ной области часто содержатся несколько остатков треонина, которые служат мишенью для описанных модификаций. Роль таких модификаций пока не известна, однако, есть предположение, что они защищают белки от протеолитического расщепления. По крайней мере, некоторые липопротеины экспортируются на поверхность бактериальной клетки [104, 105] с помощью липидного хвоста, заякоренного в наружной мембране [106]. Следовательно, N-концевые части полипептидной цепи уязвимы для протеолитического расщепления, и многие ли попротеины в несколько усеченной и растворимой форме можно обнаружить в культуральных супер натантах. В настоящее время наиболее хорошо оха рактеризованы гликозилированные липопротеины MPT 83 [107] и SodC [82]. На мышиной модели показано, что О-маннозилирование (частный случай гликозилирования) приводит к ослаблению патогенных свойств M. tuberculosis [108], и с помощью протеомных подходов в супернатанте культуры M. tuberculosis выявлено более 40 O-гликозилированных белков [83, 109]. Стоит отметить, что известен только один гликозилированный белок MPT 32, или Apa [78], не относящийся к липопротеинам. Apa является од ним из наиболее распространенных внеклеточных белков, секретируемых через общий секреторный путь [110]. Наконец, интерес вызывает обнаружение противотуберкулезного антигена - поверхностного гепаринсвязывающего гемагглютинина, который рассматривается как компонент для разработки новой вакцины [111, 112]. Уникальность этого белка состоит в метилировании нескольких остатков лизина [87]. Похоже, что эти метилированные остатки лизина имеют иммунологическое значение и входят в состав Т-клеточных эпитопов в гепаринсвязывающем гемагглютинине [113]. Существует достаточно доказательств того, что многие посттрансляционные модификации имеют большое значение для иммунитета и защиты организма от туберкулеза. Как известно, путем ПТМ может регулироваться продолжительность жизни белков в клетке, их взаимодействие с другими белками, а также ферментативная активность. ПТМ многих эукариотических белков относятся к обязательным стадиям созревания белка. Белки, не подвергнутые ПТМ, оказываются функционально неактивными [114]. На сегодняшний день роль ПТМ белков микобактерий изучена недостаточно. Протеогеномный анализ Все описанные исследования показывают, что геномная вариабельность штаммов микобактерий от ражается на протеомном уровне, и, таким образом, сравнительные протеомные данные могут помочь в понимании фенотипических различий разных групп бактерий, таких, как степень лекарственной чувствительности или вирулентности. С другой сто роны, протеомные исследования способствуют корректной расшифровке геномной информации. Большинство масс-спектрометрических тех нологий опирается на базы данных, содержащие аннотированные аминокислотные последовательности белка. Однако в результате сравнительного анализа было показано, что аннотация на основании геномных данных зачастую неполная и содержит ошибки. Так, к примеру, последовательность генома M. tuberculosis штамма H37Rv была полностью расшифрована в Сенгеровском институте в 1998 году [43] и содержала 3924 открытые рамки считы вания (ОРС), но уже через несколько лет авторы сообщили об увеличении ОРС до 3995 [115]. В на стоящее время аннотированная версия M. tuberculosis H37Rv (27-я версия согласно базе данных TubercuList) содержит 4018 белоккодирующих генов, из которых 26% относятся к классу белков с гипотетической функцией. При этом протеомные исследования в значительной мере помогли пере работать геномную аннотацию, представляя экспериментальные доказательства в случае ряда не аннотированных ранее генов, или генов, сайты инициации транскрипции которых были неправильно идентифицированы, а также просто подтверждая существующие ОРС (рис. 3). Kelkar и со авт. в 2011 на основании данных MС/MС-анализа идентифицировали 3176 белков M. tuberculosis H37Rv, а также 250 пептидов, не соответствующих имеющейся аннотации. В итоге аннотацию дополни ли 41 белком и уточнили сайты инициации транскрипции 33 генов [34]. В том же году исследователи из Норвегии с помощью МС-подходов исправили аннотацию еще 24 генов штамма H37Rv [116]. В целом же следует отметить, что за последние не сколько лет проведено несколько крупных протеогеномных исследований M. tuberculosis, в каждом из которых описано от 20 до 40 не аннотированных ранее белков и были скорректированы текущие ан нотации генома [23, 34, 116, 117]. ЗАКЛЮЧЕНИЕ Развитие протеомики открыло новые подходы к изучению туберкулеза, облегчив решение многих сложных вопросов, в том числе и взаимодействий бактерии с хозяйской клеткой. Несмотря на то что протеомика отстает от геномики и транс криптомики из-за инструментальных проблем и не достаточной чувствительности, появляется все больше работ, в которых инфекционные агенты изучают с использованием протеомных подходов. Так, с по мощью протеомного анализа описаны факторы вирулентности и механизмы их действия, реакция хозяина и патогена на инфекционный процесс. Протеомика позволила более полно описать уникальные отличи тельные особенности различных штаммов M. tuberculosis. Изучение возбудителя туберкулеза на протеомном уровне может способствовать установлению метаболических и физиологических особенностей, необходимых для успешного протекания инфекционного процесса, а также механизмов вирулентности, позволяющих M. tuberculosis модулировать иммунный ответ хозяина. Белки, синтезируемые при попадании микобактерий внутрь клеток хозяина, важны для их выживания в этих условиях, поэтому они считаются потенциальными мишенями для разрабатываемых лекарственных препаратов. Создание новых препаратов и схем лечения особенно необходимо именно сейчас, когда широкое распространение получили штаммы с множественной и широкой лекарственной устойчивостью. Таким образом, изучение полного протеомного профиля микобактерий может способствовать лучшему пониманию физиологии патогена и, возможно, лечению туберкулеза.

Об авторах

Ю. A. Беспятых

Федеральный научно-клинический центр физико-химической медицины ФМБА России

Автор, ответственный за переписку.
Email: JuliaBespyatykh@gmail.com
Россия

E. A. Шитиков

Федеральный научно-клинический центр физико-химической медицины ФМБА России

Email: JuliaBespyatykh@gmail.com
Россия

E. Н. Ильина

Федеральный научно-клинический центр физико-химической медицины ФМБА России

Email: JuliaBespyatykh@gmail.com
Россия

Список литературы

Дополнительные файлы