Низкомолекулярный миметик NGF корригирует когнитивный дефицит и депрессивные проявления при экспериментальном диабете

Полный текст

ВВЕДЕНИЕ За несколько десятилетий, прошедших после обна ружения ведущей роли нейротрофических факто ров в развитии и поддержании жизнеспособности нейронов [1], получены факты, показывающие их сходную регуляторную активность на уровне неней ронных систем [2]. Одним из важных следствий этих открытий стало понимание значимости нейротрофи нов для развития β-клеток поджелудочной железы. Получены важные данные, позволяющие полагать, что подобие факторов роста и дифференцировки определяет сходство между β-клетками поджелу дочной железы и нейронами, которые, хотя и проис ходят из различных линий клеток, но формируют ся по одной и той же фундаментальной программе развития [3]. Регуляторная роль нейротрофинов в β-клетках поджелудочной железы подтверждена во многих исследованиях [4, 5]. Установлено, что дей ствие фактора роста нервов (NGF) на β-клетки под желудочной железы опосредуется TrkA - высо коаффинным рецептором нейротрофинов [6]. NGF обеспечивает неогенез β-клеток не только в феталь ный и неонатальный период, но также у взрослых организмов [7]. Удаление NGF из среды культивиро вания β-клеток [8] или воздействие антител к этому нейротрофическому фактору [9] ведет к усилению их апоптоза. Получены убедительные доказательства снижения пролиферации и/или усиления апопто за β-клеток за счет снижения уровня NGF [10-12] при сахарном диабете второго типа (СД2). Вместе с тем, хорошо известны факты коморбид ности СД2 с когнитивным дефицитом (замедление скорости информационных процессов, снижение вербальной памяти, концептуализации), риск развития которого при СД2 существенно выше, чем у здоровых людей. Согласно эпидемиологическим данным, степень этого превышения колеблется от 50 до 150% [13, 14]. Постмортальными исследованиями выявлено снижение содержания NGF во фронталь ной коре пациентов, находящихся в фазе, предше ствующей развитию болезни Альцгеймера (БА) [15]. Уже в этой фазе наблюдается снижение активно сти ацетилхолинтрансферазы - фермента, актив ность которого в холинергических нейронах базаль ных структур мозга регулируется NGF. Показано, что при легких когнитивных нарушениях снижен уровень рецепторов TrkA в гиппокампе - структу ре мозга, ответственной за основные когнитивные функции, в частности память [16]. Атрофия гиппо кампа является важным прогностическим признаком углубления когнитивной патологии и перехода лег ких когнитивных нарушений в БА [17]. Важную роль в этом процессе играет дефицит NGF, поскольку именно этот нейротрофин предотвращает образова ние β-амилоидного пептидa (Аβ1-42) [18]. Снижение содержания NGF при когнитивных нарушениях со четается с повышением уровня его предшественни ка (proNGF), угнетающего пролиферацию и диффе ренцировку структур базального мозга и гиппокампа [19]. Сдвиг в соотношении proNGF/NGF в сторону предшественника рассматривается как важней шая причина холинергического дефицита, ведущего к когнитивной недостаточности [20]. Вероятность развития депрессий и депрессивно подобных состояний у больных СД2 как минимум вдвое выше, чем в группе лиц без инсулинорези стентности [21]. Коморбидность этих заболеваний, носящая двусторонний характер (усугубление те чения диабета депрессией, и течения депрессии - диабетом), является предметом изучения [22, 23]. Наряду с убедительными данными о роли дефицита нейротрофического фактора мозга (BDNF) в патоге незе депрессивных состояний различной этиологии, в том числе при диабете [24], показано, что при де прессиях, как и при диабете, снижена активность NGF, и это считается важным фактором их комор бидности. Результаты метаанализа 21 публикации [25] подтвердили статистически значимое снижение уровня NGF в крови при депрессии, коррелирующее с выраженностью нарушений. Снижение содержания NGF в сыворотке крови предложено рассматривать как биомаркер большой депрессии [26]. Подобное снижение наблюдается и при маниакально-депрес сивном психозе [27], и при депрессиях позднего воз раста [28]. Постмортальное изучение тканей голов ного мозга самоубийц выявило почти двукратное снижение экспрессии NGF и более чем трехкратное снижение плотности TrkA [29]. Совокупность приведенных данных показывает, что NGF может использоваться при сахарном диабете типа 2 благодаря способности поддерживать функци онирование β-клеток и стимулировать секрецию ин сулина, одновременно препятствуя развитию сопут ствующих диабету нарушений функций центральной нервной системы. Однако при попытках применения нативного NGF исследователи столкнулись с про блемой неудовлетворительных фармакокинетиче ских свойств этой белковой молекулы (низкая био логическая устойчивость, неспособность в условиях системного введения проникать через биологические барьеры), а также с плейотропностью действия NGF, которая может привести к таким побочным эффек там, как потеря веса и гипералгезия. Вместе с тем, имеются сообщения об эффективности местного при менения NGF при трофических язвах диабетического генеза [30]. Что касается системного введения NGF, то клинические испытания (фазы I и II) рекомбинант ного NGF выявили тенденцию к благоприятному эф фекту у больных диабетической нейропатией, однако при расширении контингента больных в рамках фазы III проявились побочные эффекты при отсутствии те рапевтически значимых результатов [31]. Одна из стратегий, направленных на преодоле ние недостатков нативных нейротрофинов, состоит в создании низкомолекулярных агентов, способных вызывать NGF-подобные терапевтические эффекты при системном введении и свободных от побочных эффектов, свойственных исходному NGF. Описано несколько таких соединений, в частности NGF миметик непептидной структуры, соединение МТ-2 [32] и пептидный NGF-миметик BB14 [33, 34], однако эффекты этих соединений изучены только в систе мах in vitro. В НИИ фармакологии им. В.В. Закусова на ос нове структуры β-изгиба 4-й петли NGF соз дан димерный дипептидный миметик NGF ГК-2 (гексаметилендиамид-бис-(N-моносукцинил глутамил-лизина)), который проявил высокую ней ропротективную активность в экспериментах in vitro, а также in vivo на моделях инсульта, болезней Альцгеймера и Паркинсона при отсутствии побоч ных эффектов, характерных для нативного NGF. Показано, что ГК-2 активирует TrkA-рецепторы [35-37]. В предварительных опытах на крысах обнару жен антигипергликемический эффект ГК-2 [38]. Исходя из коморбидности диабета с когнитивной недостаточностью и депрессией, мы получили мышей со стрептозотоциновым диабетом и изучили влияние ГК-2, оригинального миметика NGF, на нарушение когнитивных функций и депрессивно-подобное состояние у этих животных. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ Животные Эксперименты проводили на самцах мышей линии C57Bl/6 с исходной массой тела 23-28 г, полученных их питомника «Столбовая». Животных содержали в стандартных условиях вивария при свободном до ступе к пище (за исключением 16 ч, предшествую щих введению стрептозотоцина) и воде. Соблюдали этические правила гуманного обращения с животны ми, изложенные в директивах Совета Европейского сообщества 86/609/ЕЕС об использовании животных для экспериментальных исследований. Дизайн эксперимента Сахарный диабет типа 2 моделировали внутрибрю шинным (в/б) введением животным стрептозотоцина (СТЗ, Sigma, США) в дозе 100 мг/кг, эффективной для мышей линии C57Bl/6 [39]. Мыши были случайным образом разделены на че тыре группы: группа 1 пассивного контроля (n = 10), группа 2 активного контроля (n = 11), опытные груп пы 3 (n = 11) и 4 (n = 12). Мышам группы пассивного контроля на протяжении 31 дня внутрибрюшинно или перорально (per os) вводили физиологический раствор (ФР)1. Животным группы активного контро ля в течение 14 дней вводили ФР в/б; на 15-е сут од нократно после 16-часового голодания вводили СТЗ в дозе 100 мг/кг, в/б; далее в течение 16 дней про должали вводить ФР. Достаточно низкая молекулярная масса (831 Да) соединения ГК-2 делает целесообразным изучение эффекта не только внутрибрюшинного, но и перо рального пути введения. Необходимость изучения эффекта перорально вводимого ГК-2 связана с тем, что это соединение планируется в будущем исполь зовать в качестве препарата для длительного клини ческого применения. Свежеприготовленный раствор ГК-2 (на 0.9% NaCl) вводили 1 раз в день: опытной группе 3 в/б в дозе 0.5 мг/кг, а опытной группе 4 - per os в дозе 5 мг/кг в течение 14 дней. На 15-е сут (через 30 мин после последнего введения ГК-2) животным вводили СТЗ в дозе 100 мг/кг, в/б, натощак; затем ГК-2 продолжали вводить обеим группам мышей в течение 16 дней. Уровень глюкозы в крови, взятой из хвостовой вены мышей, измеряли с помощью глюкометра One Touch Ultra (США). Динамику эффекта ГК-2 оцени вали с использованием показателя относительной антигипергликемической активности (Аг) по форму ле: Аг = гл.СТЗ - гл.(СТЗ + ГК-2) / гл.СТЗ - гл.ФР × 100%, где гл.СТЗ - уровень глюкозы в крови в группе ак тивного контроля (группа 2), гл.СТЗ + ГК-2 - уровень глюкозы крови в опытных группах 3 или 4, гл.ФР - уровень глюкозы в крови в группе пассивного кон троля (группа 1). Изучение влияния ГК-2 на обучаемость в тесте водный лабиринт Морриса Через 24 ч после последнего введения мышам ГК-2 (17-е сут после введения СТЗ) с использо ванием метода водного лабиринта Морриса оце нивали пространственное обучение и память [40]. Экспериментальная установка представляла собой бассейн диаметром 150 см со стенками высотой 60 см, который заполняли водой (23-25°С). Бассейн мыслен но делили на четыре сектора, в центр одного помеща ли платформу диаметром 9 см, которая возвышалась над уровнем воды на 1 см. В первый день животным давали возможность об наружить видимую платформу. Если мышь не на ходила платформу в течение 60 с, то ее помещали на платформу на 20 с. Использовали четыре посад ки (по одной из каждого сектора). Через 24 ч в воду, предварительно забеленную молоком, в то же ме сто, что и в первый день, помещали платформу, погруженную в воду на 1 см ниже поверхности. Как и в первый день, проводили четыре посадки, по одной из каждого сектора. Аналогичную проце дуру повторяли на 3, 4, 5 и 8-й дни. Регистрировали число животных, нашедших платформу в течение 60 с. Изучение влияния ГК-2 на модели депрессии На 45-е и 46-е сут после прекращения введения ГК-2 с использованием модифицированного варианта те ста Порсолта оценивали депрессивно-подобное со стояние (поведенческое отчаяние) [41, 42]. Животных помещали в цилиндрические сосуды диаметром 10 см и высотой 30 см (ООО «НПК Открытая наука»). Сосуды наполняли водой на высоту 20 см (23-25°С). В первый день животное опускали в сосуд на 10 мин, при этом со 2-й по 6-ю мин видеорегистрировали по ведение. Через 24 ч проводили повторное тестиро вание в течение 6 мин. Длительность периодов ак тивного плавания и иммобилизации в обоих сеансах определяли с помощью компьютерной программы RealTimer. Согласно определению авторов метода, за активное плавание принимали периоды движения передних лап вверх вдоль стенок цилиндра, а за им мобилизацию - полную неподвижность или совер шение незначительных движений для поддержания головы над поверхностью воды. Основным показателем выраженности депрессивно-подобного состояния в данном тесте была суммарная продолжительность эпизодов иммобилизации за время регистрации. Ориентировочно-исследовательскую активность и общую подвижность животных оценивали с по мощью теста «Открытое поле» за 2-е сут до теста водный лабиринт Морриса. Животных помещали в центр установки и в течение 5 мин регистрировали горизонтальную двигательную активность, число об следованных отверстий и вертикальных стоек. Вес животных определяли каждые 3 дня. Порядок введения веществ и проведения поведен ческих тестов представлен на рис. 1А. Статистическая обработка Экспериментальные данные представлены в виде средних значений с указанием средней и стандарт ной ошибки среднего (M ± SЕM). Статистическую об работку проводили с помощью программы Statistica 8.0. Статистическую значимость различий между группами оценивали с использованием непараме трического метода - критерия Манна-Уитни (Mann- Whitney U test). Для параметров, исчисляемых в %, применяли критерий χ2. Результаты считали стати стически значимыми при p ≤ 0.05. РЕЗУЛЬТАТЫ Наличие у экспериментальных животных гипергли кемии, основного признака диабета, подтверждали следующими показателями. Если в группе пассив ного контроля содержание сахара в периферической крови мышей составляло 6-7 ммоль/л, то введение мышам линии С57Bl/6 СТЗ в дозе 100 мг/кг вело к повышению содержания глюкозы в крови до 16-20 ммоль/л, что близко к значениям, полученным ра нее в опытах на крысах [38]. В полном соответствии с антигипергликемическим эффектом ГК-2, наблю даемым в опытах на крысах, мы отмечали антигипер гликемическое действие соединения ГК-2 у мышей (рис. 1Б). Важно подчеркнуть сходство антигипер гликемического эффекта у крыс и мышей, например, расчетный показатель Аг на 17-е сут после введения СТЗ крысам составлял 80%, а у мышей на 19-е сут - 90%. Оценка когнитивных функций, проводимая че рез 24 ч после последнего введения ГК-2, показала (таблица), что если в группе пассивного контроля при повторном тестировании значительно увеличи валось число животных, обнаруживших платформу в течение 60 с, то в группе активного контроля это происходило медленнее (на 4-е и 8-е сут различия между двумя группами были статистически значи мыми). Эти результаты соответствуют данным о на рушении когнитивных функций при СТЗ-диабете [43]. Внутрибрюшинное введение ГК-2 приводило к статистически значимому увеличению числа жи вотных, нашедших платформу, на 2, 4 и 8-е сут об учения по сравнению с животными группы активного контроля. При пероральном введении существенное улучшение обучаемости наблюдали только во второй день тестирования. Следует отметить, что на ранних сроках эксперимента обучаемость мышей при обо их путях введения даже превосходила обучаемость в пассивном контроле. Различия между группами были значимыми и на 3-й, и на 5-й дни тестирова ния (за исключением 5-го дня в группе перорально го введения ГК-2, когда различия между активным контролем и опытной группой не достигали уровня статистической значимости). Влияние ГК-2 на выраженность депрессивно-по добного состояния оценивали в отдаленные сроки после введения СТЗ (45-е сут), поскольку описана большая длительность депрессивно-подобных про явлений в модели диабета [25]. Сравнение показателей активного плавания и вре мени иммобилизации в разных группах позволило выявить следующие закономерности (рис. 2). У мы шей группы активного контроля длительность им мобилизации увеличивалась, а активного плавания снижалась по сравнению с группой пассивного кон троля, тогда как в/б введение ГК-2 уменьшало время иммобилизации и увеличивало время активного пла вания, доводя их до контрольных значений. В условиях перорального введения выраженность эффекта ГК-2 была такой же, как при в/б введении. На второй день наблюдали аналогичные зако номерности: увеличение времени иммобилизации и уменьшение времени активного плавания в группе активного контроля, ГК-2 снижал степень депрессии как при в/б, так и при пероральном введении. Для объяснения полученных результатов нужно было понять, не связаны ли нарушения поведения, вызванные стрептозотоцином, с ухудшением обще го состояния животных - снижением двигатель ной активности и уменьшением массы тела. Чтобы ответить на этот вопрос за 2-е сут до теста водный лабиринт Морриса провели тест «Открытое поле», в котором не выявили изменений ориентировочно исследовательской активности и общей подвижности у животных, которым вводили СТЗ. ГК-2 при обоих режимах введения также не влиял на эти показате ли. Показано, что, в отличие от группы пассивного контроля, в которой масса тела животных нарастала в течение всего эксперимента (10.5% по отношению к исходному уровню на момент тестирования в во дном лабиринте Морриса и 16.7% к выполнению те ста Порсолта), в группе активного контроля наблю далось кратковременное маловыраженное снижение веса к моменту обучения в водном лабиринте (-6.7%) и прибавка в весе к моменту оценки депрессивно-по добного состояния (1.8%). Соединение ГК-2 ослабля ло этот эффект СТЗ как при внутрибрюшинном (-2 и 4.6% соответственно), так и при пероральном вве дении (1 и 10% соответственно). Таким образом, по лученные данные позволяют исключить изменение общего состояния животных как причину вызван ных СТЗ нарушений поведения и их нормализацию на фоне действия миметика NGF. ОБСУЖДЕНИЕ На мышах C57Bl/6 мы воспроизвели известную мо дель сахарного диабета с характерными поведен ческими проявлениями [25, 43] и впервые описали способность ГК-2, низкомолекулярного миметика фактора роста нервов, устранять эти нарушения по ведения. Известно, что в развитии дефицита NGF при диабете основную роль играет снижение его об разования из предшественника, рroNGF, вследствие вызванного гипергликемией окислительного стресса [44, 45], который приводит к подавлению активности протеаз и сдвигу соотношения proNGF/NGF в сто рону предшественника, способствующего, в отличие от зрелого NGF, апоптозу инсулинпродуцирующих клеток (рис. 3). Стрептозотоцин способствует образованию сво бодных радикалов, алкилирует ДНК [46]. Введение СТЗ полностью воспроизводит не только характерное для диабета снижение содержания NGF [47], но также и повышение содержания рroNGF [48]. Экспериментально показано, что степень повышения уровня proNGF и снижения зрелого NGF и фосфори лированных TrkA-рецепторов коррелирует с выра женностью когнитивного дефицита [49]. Сдвиг в соот ношении proNGF/NGF в сторону предшественника считается важнейшей причиной холинергического дефицита, ведущего к когнитивной недостаточности [20]. ГК-2, подобно нативной молекуле NGF, активи рует ТrkA-рецепторы и ослабляет токсические эф фекты Н2О2 [35]. Кроме того, он снижает содержание малонового диальдегида в крови диабетических мы шей [50]. На основании этих данных можно предпо ложить, что антигипергликемический эффект ГК-2 обусловлен как его прямым влиянием на рецепторы NGF, так и способностью устранять токсическое дей ствие свободных радикалов, что может нормализо вать образование NGF из предшественника. Экспериментально воспроизведен не только ос новной метаболический эффект СТЗ - гиперглике мический, но и его поведенческие эффекты, имити рующие нарушения поведения у больных диабетом, а именно, нарушение когнитивных функций [14, 16] и развитие депрессивно-подобных состояний [51-53]. Выявлена способность ГК-2 ослаблять выраженность когнитивного дефицита, возникающего в модели диа бета. Этот факт согласуется с положительным ког нитивным эффектом ГК-2, наблюдаемым в моделях болезни Альцгеймера [54]. Впервые описан антиде прессивный эффект соединения ГК-2. Сочетание ан тидиабетического эффекта ГК-2 с антидепрессант ным действием представляется особенно важным в связи с тем, что классические антидепрессанты не только не ослабляют проявления диабета, но могут повысить вероятность развития диабета [55]. Важно подчеркнуть сохранение активности ГК-2 при пероральном введении, что необходимо для ле карственных средств, используемых при хрониче ских заболеваниях. Сочетание антидиабетического эффекта ГК-2 с его длительным положительным влиянием на когнитивные функции и антидепрес сивными свойствами представляется важной допол нительной характеристикой этого соединения. ГК-2 предполагается использовать в терапии последствий инсульта, поскольку известно о коморбидности ин сульта и диабета, а также о высокой частоте раз вития когнитивного дефицита и депрессивных рас стройств в постинсультном периоде [56]. Ранее было показано [57], что активируя TrkA, ГК-2, миметик NGF, селективно активирует толь ко один из двух основных сигнальных путей - путь PI3K/Аkt, вовлеченный в нейропротективные эф фекты нейротрофинов [58]. Данные о антидиабети ческой активности ГК-2 позволяют предположить, что Аkt-сигнализации достаточно для поддержания функционирования β-клеток. Значение этих дан ных состоит прежде всего в том, что они могут спо собствовать появлению новых представлений о ме ханизмах развития диабета и станут фундаментом для разработки противодиабетических средств, осу ществляющих цитопротекцию β-клеток. Наличие у ГК-2 как нейропротективного, так и антидиабети ческого эффектов находится в согласии с ранее вы сказанной фундаментальной концепцией общности механизмов регуляции функций нейронов и β-клеток поджелудочной железы [59] и вытекающего из этой концепции положения о целесообразности изучения возможных антидиабетических свойств у нейропро тективных веществ, устраняющих дефицит нейро трофических факторов [60]. ЗАКЛЮЧЕНИЕ В нашей работе воспроизведены эффекты СТЗ: ги пергликемический, амнестический и депрессивно подобный. Выявлена способность ГК-2, димерного аналога 4-й петли фактора роста нервов, оказы вать антигипергликемический эффект, ослаблять выраженность возникающего в модели диабета когнитивного дефицита, впервые выявлено анти депрессивное действие соединения. Сочетание анти диабетического эффекта с положительным влияни ем на когнитивные функции и антидепрессивными свойствами, а также сохранение активности при пе роральном введении определяют перспективность исследования ГК-2. В свете полученных ранее в НИИ фармакологии данных о выраженной нейропротективной активно сти ГК-2 антидиабетическую активность этого соеди нения можно рассматривать как важный аргумент в пользу фундаментальной концепции общности ме ханизмов регуляции функций нейронов и β-клеток поджелудочной железы.

Об авторах

Р. У. Островская

НИИ фармакологии им. В.В. Закусова

Автор, ответственный за переписку.
Email: rita.ostrovskaya@gmail.com
Россия

С. С. Ягубова

НИИ фармакологии им. В.В. Закусова

Email: rita.ostrovskaya@gmail.com
Россия

T. A. Гудашева

НИИ фармакологии им. В.В. Закусова

Email: rita.ostrovskaya@gmail.com
Россия

С. Б. Середенин

НИИ фармакологии им. В.В. Закусова

Email: rita.ostrovskaya@gmail.com
Россия

Список литературы

Дополнительные файлы