Сравнение кандидатных вакцин нового поколения против ортопоксвирусных инфекций человека

Полный текст

ВВЕДЕНИЕ Род Orthopoxvirus семейства Poxviridae включа- ет такие патогенные для человека виды, как виру- сы натуральной оспы (variola virus, VARV), оспы обезьян (monkeypox virus, MPXV), коровьей оспы (cowpox virus, CPXV) и осповакцины (vaccinia virus, VACV). Массовая вакцинация традиционной вакци- ной на основе VACV защищала не только от VARV, но и от близкородственных MPXV и CPXV [1]. После 1980 года в результате ликвидации оспы и повсе- местного прекращения иммунизации против нее доля населения, чувствительного к VARV и другим патогенным для человека ортопоксвирусам, по- стоянно увеличивается. Об этом свидетельствуют участившиеся многочисленные вспышки ортопоксвирусных инфекций среди людей, обусловленных такими вирусами, как MPXV, CPXV и VACV [2-6]. Кроме того, VARV рассматривают как возможный агент биотеррористических атак, которые могут иметь катастрофические последствия для всего на- селения Земли [6]. Отсутствие эффективных проти- вовирусных препаратов и опасность использования классической живой вакцины на основе VACV из-за тяжелых поствакцинальных осложнений требуют разработки современных безопасных вакцин против ортопоксвирусных инфекций и схем их применения [7, 8]. Ранее нами на основе штамма LIVP VACV, ис- пользуемого в Российской Федерации для вак- цинации людей, создан рекомбинантный вариант VACΔ6 с направленным нарушением шести генов, кодирующих гемагглютинин (A56R), гамма-ин- терферонсвязывающий белок (B8R), тимидинки- назу (J2R), комплементсвязывающий белок (C3L), Bcl2-подобный ингибитор апоптоза (N1L), и гена A35R, контролирующего презентацию антигенов главным комплексом гистосовместимости класса II (МНСII). Показано, что инактивация выбранных генов вирулентности не влияет на репродуктивные свойства VACV на культурах клеток млекопитаю- щих. Штамм VACΔ6 характеризуется значительно меньшей реактогенностью и нейровирулентностью и большей иммуногенностью по сравнению с исход- ным штаммом LIVP. При двукратном подкожном введении мышам рекомбинантный вариант VACΔ6 индуцирует появление достоверно более высокого уровня вируснейтрализующих антител, чем роди- тельский штамм LIVP, и обеспечивает полную за- щиту мышей от высокопатогенного для них вируса эктромелии (ectromelia virus, ECTV), что не наблю- дали в данной модели при использовании приня- того в качестве противооспенной вакцины штамма LIVP [9, 10]. Другим независимым подходом к вакцинопро- филактике оспы, реализованным нами ранее, стала разработка поливалентной ДНК-вакцины на осно- ве смеси рекомбинантных плазмид, содержащих под контролем промотора цитомегаловируса гены пяти вирионных белков VARV - A30, F8, M1, вхо- дящих в состав поверхностной мембраны внутри- клеточных вирионов, и A36 и B7, расположенных на оболочке внеклеточной формы вируса. При трех- кратной внутрикожной иммунизации поливалент- ная ДНК-вакцина вызывала наработку вирусней- трализующих антител и обеспечивала полную защиту мышей от инфицирования ECTV в дозе 10 LD50 [11-13]. Для повышения эффективности противооспен- ной вакцинации помимо разработки принципиаль- но новых вакцинных препаратов перспективным представляется сочетание различных типов вакцин, которые смогут дополнять друг друга и вызывать широкий и устойчивый иммунитет [14]. Подобная стратегия гетерологичной вакцинации (prime-boost), в рамках которой для праймирования иммунной си- стемы предлагается использовать субъединичную вакцину (ДНК-вакцину), а для последующей бустер- ной вакцинации - аттенуированный вариант VACV, считается перспективной. В данной работе сравнивали противооспенный иммунитет, формируемый при двукратной имму- низации различными комбинациями поливалентной ДНК-вакцины и высокоаттенуированного штамма VACΔ6. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ Бактерии, вирусы, культуры клеток В работе использовали Escherichia coli XL2-blue, штамм VACΔ6 [10], штамм LIVP VACV (производный штамма Lister, полученный в Институте вирусных препаратов, Москва) и штамм К-1 ECTV из коллек- ции ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор», перевиваемую куль- туру клеток почки африканской зеленой мартышки 4647 [15] из коллекции клеточных культур ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор», культивируемую на питательной среде ДМЕМ с добавлением 10% эмбриональной сы- воротки коров. Поливалентная ДНК-вакцина Набор рекомбинантных плазмид на основе вектор- ной плазмиды pcDNA3.1, несущей гены пяти анти- генов VARV - A30, F8, M1 поверхностной мембра- ны внутриклеточных вирионов, A36 и B7 оболочки внеклеточной формы вируса под контролем промо- тора цитомегаловируса, был получен ранее [11-13]. Плазмидные ДНК нарабатывали в клетках E. coli в препаративном количестве и очищали с помощью набора EndoFree Plasmid Giga Kit (Qiagen, США) в соответствии с рекомендациями производителя. Концентрацию плазмидной ДНК измеряли спектро- фотометрически на приборе Ultrospec 3000 pro (GE Healthcare Life Sciences, США). Наработка и очистка вирусов Монослой клеток линии 4647, выращенный на куль- туральных матрасах с ростовой поверхностью 175 см2 (объем 650 мл), инфицировали VACV (штамм VACΔ6 или LIVP) с множественностью заражения 1 БОЕ/кл. Вирус инкубировали на среде ДМЕМ с 2% эмбрио- нальной сыворотки коров в течение 48 ч при темпе- ратуре 37°С до полного цитопатического действия, затем получали криолизат (три цикла заморажи- вания-оттаивания) инфицированных клеток, об- рабатывали его на ультразвуковом дезинтеграторе типа MSE 500 мощностью 22 кГц 2-3 раза по 10-15 с. От клеточного дебриса освобождались низкоско- ростным центрифугированием (10 мин при 4000 g). Супернатант центрифугировали в течение 1.5 ч при 30000 g. Осадок вируса ресуспендировали в 4 мл физиологического раствора. Инфекционный титр вируса определяли безагарозным методом бляшек в монослое клеток 4647. Изучение иммуногенности и протективности В работе использовали мышей линии Balb/c (сам- ки, вес 14-16 г, возраст 5-6 недель) из питомни- ка ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор». Мышей объединяли в группы по 10 особей. Мышей иммунизировали поливалентной ДНК-вакциной внутрикожно и под- кожно смесью плазмид pcDNA-A30, pcDNA-A36, pcDNA-M1, pcDNA-F8 и pcDNA-B7 (по 50 мкг каж- дой плазмиды, суммарная доза 250 мкг/100 мкл на мышь). Иммунизацию проводили подкожно штам- мами VACΔ6 или LIVP в количестве 107 БОЕ/100 мкл на мышь. Мышам контрольной группы вводили рав- ный объем физиологического раствора, на котором готовили разведения вируса. Иммунизацию прово- дили дважды с интервалом 21 сут согласно табл. 1. Через 19 сут после второй иммунизации у предва- рительно наркотизированных мышей отбирали про- бы крови из ретробульбарного венозного сплетения, инкубировали их при 4°С в течение 24 ч для форми- рования фибринового сгустка, центрифугировали в течение 10 мин при 5000 g. Объединяли препара- ты сывороток одной группы и прогревали при 56°С в течение 30 мин. Титр VACV-нейтрализующих ан- тител определяли на культуре клеток 4647 соглас- но [16], используя последовательные пятикратные разведения сывороток, которые смешивали с VACV штамм LIVP в рабочем разведении 50 БОЕ/лун- ку. Эффективность нейтрализации рассчитывали относительно числа бляшек в лунках без сыворо- ток как -lg от наибольшего разведения сыворотки, при котором достигается 50% нейтрализация VACV. Через 21 сут после второй иммунизации живот- ных в состоянии легкого эфирного наркоза подверга- ли интраназальной инокуляции высокопатогенным для мышей ECTV в дозе 150 LD50/20 мкл на мышь согласно [17]. Наблюдение вели в течение 14 сут, учи- тывали количество выживших и погибших мышей. Анализ данных Статистическую значимость эксперименталь- ных данных оценивали по t-критерию Стьюдента с использованием программы Origin Professional 8.1.10.86. Различия считали статистически значимы- ми при P < 0.05 [18]. РЕЗУЛЬТАТЫ Сконструированные ранее плазмиды pcDNA-A30, pcDNA-A36, pcDNA-M1, pcDNA-F8 и pcDNA-B7 на- рабатывали в клетках E. coli в препаративном коли- честве и очищали с помощью EndoFree Plasmid Giga Kit (Qiagen, США) согласно инструкции производи- теля с последующим подтверждением правильности вставок рестрикционным анализом с использованием эндонуклеаз AsuNHI и HindIII (рис. 1) и секвениро- вания. Штаммы VACΔ6 и LIVP вируса осповакцины на- рабатывали на культуре клеток 4647, рекомендован- ной для производства противооспенной вакцины [15], очищали по описанной выше методике, подлинность штаммов подтверждали с помощью ПЦР-анализа по локусам шести инактивированных генов (табл. 2, рис. 2). Иммуногенность различных комбинаций (табл. 1) поливалентной ДНК-вакцины и высокоаттенуиро- ванного штамма VACΔ6 при двукратной иммуниза- ции оценивали по уровню индуцируемых вирусней- трализующих антител в сыворотках крови мышей, полученных через 21 сут после второй иммунизации. Как видно из данных, приведенных на рис. 3, ком- бинация вакцинных препаратов DNA&VACΔ6 вы- зывает наработку VACV-нейтрализующих антител, уровень которых сопоставим с уровнем антител, ин- дуцируемых двукратной вакцинацией родительским штаммом LIVP. При этом двукратная иммунизация штаммом VACΔ6 индуцировала значимо более высо- кий уровень вируснейтрализующих антител, что со- гласуется с полученными нами ранее данными [10]. Трехкратная иммунизация поливалентной ДНК- вакциной или двукратная иммунизация штаммом VACΔ6 обеспечивают, как показано нами ранее, 100% защиту мышей при последующем инфициро- вании ECTV в дозе 10 LD50/мышь [10, 12]. Поэтому с целью выявления различий между эффективно- стью использованных схем иммунизации была вы- брана принципиально большая разрешающая доза ECTV - 150 LD50/мышь. В результате для трех ис- следуемых групп выявили частичный защитный эф- фект при двукратной иммунизации: DNA&VACΔ6, LIVP&LIVP и VACΔ6&VACΔ6 (рис. 4). Максимальную выживаемость наблюдали в группе лабораторных животных VACΔ6&VACΔ6, двукрат- но вакцинированных штаммом VACΔ6, и в группе DNA&VACΔ6, в которой праймирование иммунной системы проводили поливалентной ДНК-вакциной, а для последующей бустерной вакцинации использо- вали аттенуированный вариант VACΔ6. В контроль- ной группе на 8-е сут, а в группе DNA&DNA на 9-е сут после заражения вирусом эктромелии наблюдали гибель всех животных. Отсутствие полной защиты мо- жет объясняться использованием слишком высокой дозы гетерологичного для VACV вируса эктромелии. ОБСУЖДЕНИЕ Первым способом защиты людей от опустоши- тельных эпидемий натуральной оспы была варио- ляция, т.е. внутрикожное внесение инфекционно- го материала от больных оспой здоровым людям. Индуцированное таким образом заболевание имело короткий инкубационный период и протекало в от- носительно легкой форме по сравнению с обычной респираторной передачей вируса от человека к че- ловеку. Смертность при вариоляции составляла 0.5-2% вместо 20-30%, наблюдавшихся во время эпидемий натуральной оспы [19]. Открытие возмож- ности вакцинации людей путем инокуляции вируса оспы коров, а затем вируса осповакцины, привело к значительному снижению риска тяжелых побоч- ных реакций. Во второй половине XX века при ис- пользовании для иммунизации VACV смертность составляла 1-25 человек на 1 млн вакцинированных [20]. В группу риска при такой вакцинации попада- ют прежде всего люди с иммунодефицитом, такие, как пациенты, перенесшие трансплантацию, ВИЧ- инфицированные, лица, принимающие иммуноде- прессанты и др. В связи с этим активно разрабаты- вали модифицированные вакцины на основе VACV с улучшенными характеристиками безопасности, на- пример, в России в конце XX века получили живую вакцину на основе рекомбинантного штамма LIVP VACV, которая была испытана на людях [21]. На сегодняшний день массовая вакцинация от на- туральной оспы не проводится, однако, есть ряд ка- тегорий людей, которые имеют риск инфицирования натуральной оспой или другими патогенными орто- поксвирусами ввиду особенностей своей работы. Эти категории входят в группу риска, они проходят вак- цинацию от оспы в обязательном порядке. В первую очередь, это касается работников, осуществляющих эпидемиологический надзор; медицинский персонал инфекционных отделений больниц; сотрудников ви- русологических лабораторий, в которых проводятся работы с ортопоксвирусами. В случае вспышки на- туральной оспы (например, в результате биотерро- ристической атаки) необходимо будет вакциниро- вать всех жителей данного региона. Классическая противооспенная вакцина первого поколения на ос- нове штамма LIVP, которая в настоящее время ис- пользуется для вакцинации, имеет значительное количество противопоказаний и может приводить к различным по своей тяжести осложнениям. Стоит отметить определенную сложность демонстрации формируемого защитного иммунитета против оспы при вакцинации новыми профилактическими пре- паратами - натуральная оспа была ликвидирована, поэтому в отсутствие эпидемий невозможно проте- стировать эффективность этих вакцин в отношении естественного заболевания. Ранее нами были реализованы два независимых подхода к разработке безопасных вакцин против ортопоксвирусных инфекций человека. Был создан высокоаттенуированный вариант вируса осповакци- ны VACΔ6 с направленным последовательным нару- шением шести генов и поливалентная ДНК-вакцина на основе пяти антигенов вируса натуральной оспы. В независимых экспериментах показано, что трех- кратная иммунизация ДНК-вакциной и двукратная иммунизация VACΔ6 обеспечивали защиту мышей против летальной дозы (10 LD50) высокопатогенного для них вируса эктромелии [10, 12]. В данной работе сравнили иммунный ответ, кото- рый развивается против ортопоксвирусов, при раз- личных схемах иммунизации ДНК-вакциной и VACΔ6. Один из шести генов, удаленных в реком- бинантном варианте VACΔ6, - ген A35R, продукт которого снижает презентацию антигенов главным комплексом гистосовместимости класса II. Поэтому закономерно, что штамм VACΔ6 индуцирует бо- лее высокий, чем родительский клон LIVP, уровень VACV-нейтрализующих антител и более эффектив- но защищает животных от заражения ECTV в дозе 150 LD50. Комбинированная иммунизация ДНК- вакциной и рекомбинантным вариантом VACΔ6 при- водила к меньшему уровню вируснейтрализующих антител, чем двукратная иммунизация VACΔ6, од- нако обеспечивала такой же уровень протективности. Последнее, по-видимому, может объясняться индук- цией ДНК-вакциной в большей степени клеточного звена иммунного ответа при первичной иммуниза- ции, также необходимого для эффективной элимина- ции ортопоксвирусов из организма [22, 23]. ЗАКЛЮЧЕНИЕ В настоящей работе для повышения эффективности противооспенной вакцинации применили страте- гию гетерологичной вакцинации, в рамках которой для праймирования иммунной системы использо- вали поливалентную ДНК-вакцину на основе пяти генов VARV, а для последующей бустерной вакци- нации - аттенуированный вариант VACΔ6. Уровень индуцируемой при этом протективности был таким же, как в варианте с двукратной иммунизацией штаммом VACΔ6 и превосходил уровень, обуслов- ленный двукратной иммунизацией штаммом LIVP VACV, используемым в Российской Федерации для вакцинации людей. Предложенные схемы им- мунизации могут быть использованы для разработ- ки стратегии безопасной вакцинации против нату- ральной оспы и других ортопоксвирусных инфекций человека. Вариант ДНК-вакцинации с последую- щей вакцинацией живым аттенуированным виру- сом VACΔ6 может рассматриваться как предпочти- тельный в плане безопасности. Следует отметить, что схема двукратной вакцинации не является опти- мальной при проведении экстренной профилактики натуральной оспы, в этом случае предпочтительно однократное введение классической противооспен- ной вакцины на основе VACV штамм LIVP.

Об авторах

Р. A. Максютов

Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» Роспотребнадзора

Автор, ответственный за переписку.
Email: maksrinat@yandex.ru
Россия

С. Н. Якубицкий

Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» Роспотребнадзора

Email: maksrinat@yandex.ru
Россия

И. В. Колосова

Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» Роспотребнадзора

Email: maksrinat@yandex.ru
Россия

С. Н. Щелкунов

Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» Роспотребнадзора; Институт цитологии и генетики СО РАН

Email: snshchel@rambler.ru
Россия

Список литературы

Дополнительные файлы