Роль инсерционного α-спирализованного домена АТР-зависимой Lon-протеазы из E. coli в функционировании фермента

Полный текст

ВВЕДЕНИЕ АТР-зависимая Lon-протеаза Escherichia coli (Ес- Lon [КФ 3.4.21.53]; MEROPS: клан SJ, семейство S16, ID S16.001) - представитель семейства Lon-протеаз, которое играет ключевую роль в системе контроля качества клеточного протеома, функционирующей во всех доменах жизни [1-4]. Семейство Lon состо ит из двух подсемейств - LonA, включающего бак териальные и эукариотические ферменты, и LonB, объединяющего ферменты архей. Протеазы подсе мейств А и В различаются доменной организацией субъединиц, а также окружением каталитических остатков протеолитического центра [5]. Ес-Lon от носится к подсемейству А, деградирует аномальные и дефектные полипептиды, а также ряд регулятор ных клеточных белков по процессивному механиз му в условиях сопряжения протеолиза с гидролизом АТР [4-7]. Отличительной характеристикой Ес-Lon, как и других LonА-протеаз, является их способность к связыванию ДНК [8-10]. Субъединица Ес-Lon (784 аминокислотных остатка) состоит из пяти доменов: N-HI(CC)-NB- H-P ( рис. 1А), где нуклеотидсвязывающий (NB) и α-спирализованный (Н) домены формируют АТР азный модуль, относящийся к суперсемейству ААА+-белков (АТР-аз, ассоциированных с различ ными клеточными активностями) [11, 12], С-концевой Р-домен представляет серин-лизиновую пептидги дролазу, а N-концевой и следующий за ним «инсер ционный» α-спирализованный домены образуют не каталитическую область (N-HI(CC)), включающую фрагмент последовательности со специфической coiled-coil (СС) конформацией [13, 14]. Определены кристаллические структуры индивидуальных до менов (за исключением HI(CC)-домена) Ес-Lon и не которых других LonА-протеаз. Пространственные структуры полноразмерных ферментов подсемей ства LonА до сих пор не известны. Двухдоменная организация N-концевой обла сти является уникальной характеристикой Ес-Lon и всего пула LonA-протеаз. От других ААА+-белков системы контроля качества, представленных со вокупностью АТР-зависимых протеаз (ClpAP, ClpXP, FtsH, HslUV) и шаперонов-дезагрегаз (ClpB, Hsp104), LonA-протеазы отличает наличие вставочного HI(CC)-домена. Ранее нами было по казано, что HI(CC)-домен Ес-Lon проявляет вы раженное сходство как с Н-доменом собственного ААА+-модуля, так и с α-спирализованным доме ном (Н1(М)) первого из двух ААА+-модулей ClpB шаперонов [13, 14]. При этом участие НI(СС)-домена в функционировании Ес-Lon-протеазы, во взаимо действии с нуклеиновыми кислотами и/или в струк турной организации фермента до настоящего време ни не охарактеризовано. С целью изучения роли инсерционного HI(CC) домена в проявлении функциональных свойств Ес- Lon нами проведено сравнительное исследование энзиматических характеристик и способности к свя зыванию ДНК как интактного фермента (рис. 1А), так и его делеционной формы Lon-dHI(CC), утратив шей HI(CC)-домен (рис. 1Б). ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ Материалы В работе использовали коммерческие реактивы фирм Sigma, Bio-Rad, Thermo Scientific (США), Fluka (Швейцария), Boehringer Mannheim (Германия), Pharmacia (Швеция), Difco (Англия), Panreac (Испания) и «Реахим» (Россия). Получение Ec-Lon (Lon-H6) и ее делеционной формы Lon-dHI(CC) Рекомбинантную форму Ec-Lon, содержащую гек сагистидиновый фрагмент (в составе октапептида LEHHHHHH) на С-конце белка (Lon-H6), получали по ранее описанной методике [15]. Делеционную форму Lon-dHI(CC) получали на основе Lon-H6-протеазы. Методом мегапрай мера сконструировали праймеры Lon_d_124-304, Lon_HindIII и Lon_BamHI_rev (соответственно: 5'-TTTTTTGACCTTGCTGCGCGCATCAATGGTCGGCGACTCCAG- 3', 5'-CGCAGAAAGAAGCTTCAACGG- 3' и 5'-GTTCTGCTCTGGATCCAGCAC- 3'). Амплификацию фрагмента гена проводили в два этапа, используя в качестве ма трицы плазмидную ДНК pET28-lon-H6. На первом этапе с помощью праймеров Lon_d_124-304 и Lon_ HindIII получили ПЦР-фрагмент, который исполь зовали в качестве праймера на втором этапе вместе с праймером Lon_BamHI_rev. Полученный фраг мент ДНК длиной около 625 п.н. клонировали в век тор pET28_lon по уникальным сайтам рестрикции HindIII и BamHI. Секвенирование клонированных ДНК и синтез праймеров осуществлены компанией «ЗАО ЕВРОГЕН» (www.evrogen.ru). Процедуры рестрикции и лигирования проводили согласно протоколам производителей соответствующих ферментов. Выделение и очистку Lon-H6 и Lon-dHI(CC) прово дили в две стадии методами Ni2+-хелатной аффинной хроматографии с использованием колонок HisTrap FF (тандем 2 × 5 мл, GE Healthcare, США) и анио нообменной хроматографии на колонке HiTrapTM Q FF (5 мл, GE Healthcare) согласно ранее описанной методике [15]. Концентрации белков определяли по методу Брэдфорд [16]. Гомогенность белков в препаратах тестировали электрофоретически [17] с использованием коммерческого набора маркеров (М, кДа): β-галактозидаза (116.0), бычий сывороточный альбумин (66.2), оваль бумин (45.0), лактатдегидрогеназа (35.0), рестриктаза Bsp98I (25.0), β-лактальбумин (18.4) и лизоцим (14.4). Очистка ДНК ДНК очищали согласно протоколу, представленному в руководстве [18]. Определение ферментативных свойств Lon-H6 протеазы и делеционной формы Lon-dHI(CC) АТР-азную активность тестировали по накопле нию во времени неорганического фосфата в ре акции гидролиза АТР в 50 мМ Tрис-HCl-буфере, рН 8.1, содержащем 150 мМ NaCl, 5 мМ ATP, 20 мМ MgCl2 и 1 мкМ фермент, при 37оС [19]. В контроль ном опыте фермент заменяли буфером. Начальные скорости реакций определяли по величине опти ческого поглощения смеси из 200 мкл реакционной среды и 600 мкл реагента (100 мM Zn(AcO)2, 15 мM (NH4)6Mo7O24, 1% SDS, pH 4.5-5.0) при длине волны 350 нм (ε350 = 7 800 М-1 см-1). Тиоэстеразная активность. За гидролизом тиобензилового эфира N-замещенного трипептида Suc-Phe-Leu-Phe-SBzl (PepTBE) следили спек трофотометрически при длине волны 324 нм по ве личине оптического поглощения 4-тиопиридона (ε324 = 16 500 М-1 см-1), образующегося в результате взаимодействия продукта гидролиза (бензилтио лата, BzlS-) c 4,4´-дитиодипиридином (DTDP) [20]. Гидролиз РерТВЕ проводили при 37оС в 50 мM Tрис- HCl-буфере, рН 8.1, содержащем 150 мM NaCl, 10% DMSO, 0.2 мМ DTDP, 0.1 мМ PepTBE и 0.2 мкМ фер мент. При изучении влияния эффекторов в смесь до бавляли нуклеотид до 2.5 мМ и MgCl2 до 20 мМ. Протеолитическую активность ферментов тестировали электрофоретически [17]. Реакцию проводили при температуре 37оС в 50 мМ Tрис- HCl-буфере, pH 8.1, содержащем 150 мМ NaCl, 20 мкМ β-казеин и 2-6 мкМ фермент, в отсутствие или в присутствии 5 мМ Nu и 20 мМ MgCl2. Аликвоту реакционной или контрольной смеси (20 мкл) смешивали с 7 мкл лизирующего буфера (0.2 M Tрис- HCl, pH 8.9, 4% SDS, 20% глицерин, 0.5 мM EDTA, 0.8% бромфеноловый синий, 3% β-меркаптоэтанол), кипятили в течение 10 мин, наносили на 12% полиа криламидный гель (ПААГ) для электрофореза. Автолитическую активность ферментов тестиро вали электрофоретически [17] в условиях, аналогич ных условиям определения протеолитической актив ности, но в отсутствие β-казеина. Тестирование комплексов Lon-H6-протеазы и Lon-dHI(CC) с плазмидной ДНК За образованием комплексов фермент-ДНК следили по торможению ДНК в агарозном геле (метод GMSA) [21]. 20-25 мкг Lon-H6 или Lon-dHI(CC) инкубиро вали в течение 30 мин при 25°С с 500 нг плазмидной ДНК (pET28a) в 25 мкл 20 мМ Трис-HCl-буфера, рН 7.5, содержащего 60 мМ NaCl. Комплексы белок-ДНК анализировали гель-электрофорезом в стандартном 1.0% агарозном геле. Полосы ДНК визуализировали окрашиванием бромистым этидием. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Использованная в работе рекомбинантная Ес-Lon протеаза, содержащая дополнительный С-концевой октапептид, включающий гексагистидиновый фраг мент (Lon-H6), была получена и охарактеризована ранее [15]. На основе Lon-H6 получена рекомбинант ная делеционная форма Lon-dHI(CC) без инсер ционного HI(CC)-домена (остатки Glu124-Asn304, рис. 1Б). В препаративных количествах Lon-H6 (М 88.5 кДа) и ее делеционную форму Lon-dHI(CC) (М 67.5 кДа) выделяли с использованием аффин ной хроматографии на Ni-сефарозе и анионооб менной хроматографии на Q-сефарозе. Проведено сравнительное изучение ферментативной актив ности интактной Lon-H6-протеазы и ее делецион ной формы. При этом охарактеризовано три типа активности - АТР-азная, протеолитическая (суб страт - β-казеин) и пептидазная (субстрат - Suc- Phe-Leu-Phe-SBzl, РерТВЕ), а также изучена воз можность автолиза препаратов ферментов. Кроме того, методом фенольной экстракции проверено присутствие нуклеиновой кислоты в различных препаратах белка. АТР-азная активность делеционной формы Ес-Lon-протеазы Для тестирования как АТР-азной, так и других видов активности Lon-H6-протеазы и ее делеционной фор мы в качестве стандартных условий были выбраны 37°С и 50 мМ Трис-HCl-буфер, рН 8.1, содержащий 150 мМ NaCl. Известно, что нативная wt-Ес-Lon проявляет мак симальный уровень АТР-азной активности при рав ных концентрациях ATP и Mg2+, а избыток ионов магния оказывает ингибирующее влияние на гидро лиз АТР, которое нивелируется связыванием белко вого субстрата [22]. Эти же тенденции характерны для интактной Lon- H6-протеазы (рис. 2А): эффективность гидролиза АТР ферментом в условиях, близких к физиологи ческим (соотношение концентраций Nu : Mg2+ = 1 : 4), существенно ниже, чем при эквимолярных концентрациях Nu и ионов Mg2+. Добавление белкового суб страта (β-казеин) в обоих случаях приводит к значи тельному возрастанию АТР-азной активности. С утратой HI(CC)-домена Lon-протеаза почти пол ностью теряет способность к гидролизу АТР: АТР азная активность Lon-dHI(CC) снижена по срав нению с активностью интактной Lon-H6-протеазы более чем в 10 раз и практически не зависит ни от со отношения концентраций нуклеотида и ионов Mg2+, ни от добавления белка-субстрата (рис. 2Б). Полученные результаты свидетельствуют о том, что инсерционный α-спирализованный HI(CC)-домен необходим для формирования АТР-азного центра Ес- Lon-протеазы и его корректного функционирования. Активность пептидазного центра делеционной формы Ес-Lon-протеазы Аналогично Lon-H6-протеазе Lon-dHI(CC) способ на к гидролизу модельного пептидного субстрата PepTBE, однако базовая пептидазная активность делеционной формы составляет около 30% от актив ности интактного фермента (таблица). Из приве денных в таблице данных следует, что только ионы Mg2+ активируют пептидазные центры и Lon-H6, и Lon-dHI(CC). Влияние нуклеотидных эффекто ров на интактный и модифицированный ферменты кардинально различается. Свободные нуклеотиды (кроме ADP) и комплексы Nu-Mg в разной степени (2-11 раз) активируют Lon-H6-протеазу, а ADP ин гибирует ее, тогда как ни один из нуклеотидов практически не влияет на гидролиз пептида Lon-dHI(CC) протеазой, а комплексы Nu-Mg оказывают близкое по величине, но относительно невысокое активиру ющее воздействие на пептидазный центр фермента, сопоставимое с влиянием ионов Mg2+. Из этих данных следует, что форма Lon-dHI(CC) не способна связы вать свободные нуклеотиды и слабо взаимодействует с их комплексами с ионами магния. Наиболее дей ственным эффектором, влияющим на активность пептидазного центра, следует считать ионы магния. Таким образом, удаление HI(CC)-домена приво дит к снижению активности пептидазного центра Ec- Lon-протеазы и к утрате регулирующего влияния АТР-азного центра на пептидазный, которое в ин тактном ферменте обусловлено природой связанного нуклеотида. Протеолитическая и автолитическая активности делеционной формы Ес-Lon-протеазы Протеолитическую активность Lon-H6 и ее делеци онной формы Lon-dHI(CC) тестировали по гидроли зу модельного белкового субстрата - β-казеина - в отсутствие и при наличии ионов Mg2+, свободных нуклеотидов и их комплексов. Эффективность ги дролиза белка-мишени и процесс накопления про дуктов деградации детектировали с помощью гель электрофореза. Интактная Lon-H6-протеаза способна гидроли зовать β-казеин в двух случаях: по процессивному механизму (без образования крупных промежуточ ных фрагментов) в условиях сопряжения протеолиза с гидролизом АТР или по непроцессивному механиз му в присутствии комплекса негидролизуемого ана лога АТР с магнием (рис. 3). Удаление HI(CC)-домена приводит к полной утра те делеционной формой протеолитической активно сти по β-казеину, что свидетельствует о важности этого домена для связывания и гидролиза белкового субстрата (рис. 3). При этом на электрофореграмме инкубированной реакционной смеси обнаруживают ся полосы, соответствующие полипептидам с моле кулярными массами от 40 до 60 кДа, что указывает на возможность самодеградации Lon-dHI(CC) в ус ловиях, используемых при определении гидролиза белка-мишени. Выявление у Lon-dHI(CC) автолитической актив ности, сопровождающей потенциальный гидролиз белкового субстрата, потребовало изучения самого процесса автолиза. Показано, что интактная Lon- H6-протеаза устойчива к самодеградации в присут ствии любых нуклеотидных эффекторов (рис. 4). При этом в процессе длительной инкубации (24 ч и более) обнаруживается слабый автолиз Lon-H6 в отсутствие эффекторов или при наличии ионов магния (рис. 4), что согласуется с ранее полученны ми результатами [23]. В отличие от Lon-H6, делеционная форма LondHI( CC) нестабильна, она подвергается автолизу как в отсутствие, так и в присутствии нуклеотидных эффекторов, причем, процесс автолиза Lon-dHI(CC) наиболее выражен при наличии ионов Mg (рис. 4). Таким образом, утрата HI(CC)-домена приводит к полной потере способности Lon-H6-протеазы к ги дролизу белкового субстрата и к дестабилизации структуры фермента. Связывание нуклеиновой кислоты Lon-H6 протеазой и делеционной формой Lon-dHI(CC) Важная характеристика Ес-Lon - способность к свя зыванию ДНК [8-10], однако сайт взаимодействия фермента с нуклеиновой кислотой до настоящего времени не локализован. Поскольку другие АТР зависимые протеазы системы контроля качества клеточных белков не обладают ДНК-связывающими свойствами и не содержат характерного для LonA протеаз инсерционного HI(CC)-домена, можно ожи дать, что именно HI(CC)-домен вовлечен в связыва ние нуклеиновой кислоты. В связи с этим проверили содержание нуклеиновой кислоты в препаратах Lon- H6-протеазы и ее делеционной формы, полученных в настоящей работе. Содержание ДНК в препаратах обоих ферментов, определенное по соотношению оптического поглоще ния (А260/А280) в растворах Lon-H6 и Lon-dHI(CC) (1.09 и 1.06 соответственно), не превышало 5%. Связанную с ферментами нуклеиновую кислоту выделяли из препаратов методом фенол-хлороформной экс тракции. Обработка экстрактов бензоназой (неспецифическая нуклеаза, Sigma) привела к исчерпыва ющему гидролизу мишеней, что подтверждает их принадлежность к нуклеиновым кислотам. В то же время оба экстракта оказались устойчивыми к обра ботке РНКазой А. Эти результаты свидетельствуют о том, что и полноразмерная, и делеционная формы Ес-Lon выделяются из клеток E. coli в виде комплек сов с ДНК. Фенол-хлороформные экстракты анализирова ли с помощью электрофореза в 1% агарозном геле с последующим окрашиванием бромистым этидием (рис. 5). Установлено, что препараты и интактной Lon-H6-протеазы, и ее делеционной формы LondHI( CC) содержат значительное количество связан ной ДНК в виде фрагментов размером около 150 п.н. Кроме того, оказалось, что обе формы Lon протеазы способны к связыванию дополнитель ного количества нуклеиновой кислоты. Показано, что инкубация плазмидной ДНК с Lon-H6 или с LondHI( CC) приводит к образованию комплексов ДНК- фермент и к изменению подвижности нуклеиновой кислоты при электрофорезе в агарозном геле (рис. 6). Из представленных данных следует, что HI(CC) домен Ec-Lon-протеазы либо не участвует во взаимо действии с нуклеиновой кислотой, либо не является определяющим в этом взаимодействии. ЗАКЛЮЧЕНИЕ Согласно полученным данным характеристический инсерционный HI(CC)-домен Ес-Lon-протеазы не обходим для формирования и корректного функци онирования АТР-азного центра фермента. В то же время НI(СС)-домен не влияет на формирование пептидазного центра Ес-Lon, однако имеет исклю чительное значение для взаимовлияния активных центров. Следует подчеркнуть, что, несмотря на со хранение активности пептидазного центра, делеция HI(CC)-домена приводит к полной утрате ферментом протеолитической активности, что свидетельствует о важности этого домена для связывания и гидролиза белкового субстрата Ес-Lon-протеазой. Интересно, что делеционные формы Lon-протеазы из Brevibacillus thermoruber (Bt-Lon) [24], утратив шие фрагменты (246-259) или (248-256) в coiledcoil( CC)-области, теряют все три вида активности. Противоречие в оценке возможности функциониро вания пептидазного центра в делеционных формах LonA-протеаз, выявленное при сопоставлении ре зультатов настоящей работы и данных [24], может быть обусловлено использованием разных субстра тов при тестировании пептидазного центра - тиобензилового эфира N-защищенного трипептида (Suc-Phe-Leu-Phe-SBzl) в нашей работе и 4-метокси- β-нафтиламида менее специфичного трипептида (Glt-Ala-Ala-Phe-MNA) - в [24]. Обнаруженный нами интенсивный автолиз Lon-dHI(CC) вызван, как мы полагаем, утратой способности к эффективному связыванию ну клеотидов - свойства, которое является стабилизи рующим фактором для полноразмерного фермента. Предположение о возможной роли HI(CC)-домена как сайта связывания нуклеиновой кислоты Ec-Lon протеазой не получило экспериментального под тверждения. Таким образом, можно считать, что инсерционный HI(CC)-домен Ec-Lon-протеазы необходим для фор мирования функционально активной структуры фермента и реализации белок-белковых взаимодей ствий.

Об авторах

A. M. Куджаев

Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН

Email: tatyana.rotanova@ibch.ru
Россия

A. Г. Андрианова

Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН

Email: tatyana.rotanova@ibch.ru
Россия

E. С. Дубовцева

Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН

Email: tatyana.rotanova@ibch.ru
Россия

O. В. Серова

Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН

Email: tatyana.rotanova@ibch.ru
Россия

T. В. Ротанова

Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН

Автор, ответственный за переписку.
Email: tatyana.rotanova@ibch.ru
Россия

Список литературы

Дополнительные файлы