Дипольные модификаторы - регуляторы латеральной гетерогенности липидных мембран

Полный текст

ВВЕДЕНИЕ Липидный бислой мембраны может иметь домен ную структуру в результате сосуществования не смешиваемых липидных фаз, находящихся в раз личных агрегатных состояниях. Однокомпонентные липидные бислои при температуре ниже температу ры плавления липида (Tm) пребывают в твердокри сталлическом состоянии. В зависимости от наклона липидных молекул и способа упаковки углеводород ных хвостов в твердом бислое выделяют несколько типов фаз: кристаллическую, гель-фазу и проме жуточную риппл-фазу, характерную для некоторых липидов, в частности, насыщенных фосфохолинов [1]. При температуре выше температуры основно го фазового перехода липиды в бислое находятся в жидкоподобном состоянии. Фазовое поведение смеси липидов с различной температурой плавления существенно усложняется и в определенном темпе ратурном диапазоне (между температурами плав ления индивидуальных липидов) в бислое может наблюдаться фазовое разделение: сосуществование твердой (so) и жидкой фаз (ld), обогащенных липи дом с высокой и низкой температурой плавления соответственно. Добавление к таким смесям некоторых стеринов, в частности холестерина, усиливает их фазовую сегрегацию: возникает промежуточ ная жидкая упорядоченная фаза (lo). Установлено, что коэффициент латеральной диффузии липи дов в lo-фазе в 2-3 раза меньше по сравнению с ld областями [2]. Считается, что биологическим мем бранам также свойственна латеральная сегрегация компонентов. Хотя гель-домены не относятся к уни кальным свойствам модельных мембран (они об наружены и в плазматических мембранах живых клеток [3]), принято думать, что фазовое разделение в биологических мембранах представлено в основ ном двумя жидкими фазами (ld + lo) [4]. Поскольку в этом случае латеральной сегрегации подвержены не только мембранные липиды, но и белки, значи тельное распространение приобрела модель, соглас но которой в биологических мембранах возникают белок-липидные нанодомены (рафты). Эти области обогащены тугоплавкими липидами и стеринами и находятся в lo-состоянии. Интерес к рафтам вы зван их предполагаемым участием в таких жизненно важных процессах, как сортировка и доставка бел ков, клеточная сигнализация, иммунный ответ и др. [5-16]. Однако даже само существование рафтов в клеточных мембранах до сих пор остается дискус сионным. Считается, что сложности с обнаружени ем рафтов в клеточных мембранах связаны с тем, что их размер может варьировать от единиц до сотен нанометров, и они чрезвычайно динамичны. В ли пидных же бислоях упорядоченные домены могут достигать значительно больших размеров, что де лает возможным их визуализацию методами флуо ресцентной микроскопии. Для этого используют ги гантские одноламеллярные липосомы [17]. Фазовое разделение в липосомах можно наблюдать, если вве сти в мембрану флуоресцентно меченные липиды. Большинство подобных меток предпочитают неупо рядоченную жидкокристаллическую фазу, поэтому упорядоченные домены остаются неокрашенными. Низкомолекулярные соединения амфифильной природы, называемые дипольными модификатора ми, в частности некоторые флавоноиды, способны влиять на баланс между фазами. Согласно работе [18], введение в суспензию липосом из бинарных сме сей (ДОФХ : СМ (80 : 20 мол. %), ДОФХ : ДМФХ (50 : 50 мол. %) или ДОФХ : ДПФХ (50 : 50 мол. %)) флаво ноидов, флоретина или биоханина А сопровождается уменьшением относительного числа липидных вези кул, имеющих гель-домены. Сходное действие в от ношении трехкомпонентных бислоев из ПОФХ, Хол и СМ оказывают флоретин, его гликозид флорицин, кверцетин и мирицетин, а также стирилпиридино вые красители серии RH [19]. Способность указан ных дипольных модификаторов влиять на доменную структуру ПОФХ-мембран, включающих различные стерины и сфинголипиды, была проанализирована в [18], в то время как зависимость наблюдаемых эф фектов от вида фосфолипида, образующего неупо рядоченную жидкую фазу, не изучена. Цель данной работы состояла в изучении влияния легкоплавкой компоненты на сценарий фазового разделения в ли посомах, содержащих Хол и СМ, до и после введения флавоноидов или стирилпиридиновых красителей. Использование различных фосфолипидов, ПОФХ, ДОФХ и ДПОФХ, позволило последовательно изме нять толщину обогащенных ими неупорядоченных липидных областей мембраны, находящихся в жид ком состоянии. Для варьирования толщины упоря доченных липидных доменов помимо везикул, вклю чающих СМ, были протестированы липидные смеси, содержащие ТМКЛ. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ Материалы В работе использовали следующие реактивы: сор битол, флоретин, флорицин, кверцетин, мири цетин и RH 421 (Sigma, США); RH 237 (Molecular Probes, США); 1-пальмитоил-2-олеоил-sn глицеро-3-фосфохолин (ПОФХ), 1,2-диолеоил-sn глицеро-3-фосфохолин (ДОФХ), 1,2-дипальмитолеоил sn-глицеро-3-фосфохолин (ДПОФХ), 1,1’,2,2’-тетрамиристоилкардиолипин (ТМКЛ), сфингомиелин из мозга свиней (СМ), холесте рин (Хол) и 1,2-дипальмитоил-sn-глицеро-3 фосфоэтаноламин-N-(лиззамин родамин) (ЛР- ДПФЭ) (Avanti Polar Lipids, США). В таблице представлены некоторые характеристики липидов. Конфокальная микроскопия гигантских моноламеллярных липосом Гигантские моноламеллярные липосомы изготавли вали методом электроформации c помощью Nanion vesicle prep pro (Германия) на покрытых смесью оксидов индия и титана стеклах (90% оксида ин дия и 10% оксида титана, размер 29 × 68 × 0.9 мм) с поверхностным удельным сопротивлением 20- 30 Ом/см2 (стандартный протокол, напряжение 3 В, частота 10 Гц, 1 ч, 25°C). Латеральное фазовое раз деление визуализировали путем введения флуо ресцентного зонда ЛР-ДПФЭ в исходный липидный раствор тройных смесей из 40 мол. % фосфолипида с низкой температурой плавления (ДОФХ, ПОФХ или ДПОФХ), 40 мол. % липида с высокой темпера турой плавления (СМ или ТМКЛ) и 20 мол. % Хол в хлороформе (2 мМ). Концентрация ЛР-ДПФЭ в об разце составляла 1 мол. %. Суспензию липосом разде ляли на аликвоты. В качестве контроля использовали аликвоту без модификатора. Экспериментальные образцы содержали 400 мкМ флавоноида (флорети на, флорицина, кверцетина или мирицетина) или 10 мкМ стирилпиридинового красителя (RH 421 или RH 237). Липосомы наблюдали через иммерсионный объ ектив 100.0 × /1.4 HCX PL в Leica TCS SP5 конфо кальной лазерной системы Apo (Leica Microsystems, Германия). Наблюдение препаратов проводили при температуре 25°C. Свечение ЛР-ДПФЭ возбуж дали светом с длиной волны 543 нм (гелий-неоновый лазер). Известно, что ЛР-ДПФЭ в бислое с фазо вым разделением встраивается преимущественно в жидкую неупорядоченную фазу (ld) [20]. В то время как жидкая упорядоченная (lo) и твердая упорядо ченная (гель, so) фазы остаются неокрашенными [21]. Упорядоченные домены дискриминировали по их морфологии: неокрашенные домены круглой формы считали пребывающими в lo-состоянии, а неокрашен ные области нерегулярной конфигурации относили к so-фазе. Образец характеризовали частотой встре чаемости (pi, %) гомогенных и гетерогенных везикул: p = ⋅ N N 100 % i i , (1) где i - тип фазового разделения липосом (гомогенные ld-везикулы или липосомы, включающие lo или so домены); Ni - число везикул в образце с определен ным фазовым сценарием (от 0 до 50), N - общее число липосом в образце (50 в каждой системе). Значения pi для каждой из систем получали путем усреднения величин, определенных в четырех независимых экс периментах. Результаты для каждой из тестируе мых липидных систем представляли в виде круговой диаграммы. Погрешности определения доли липосом с определенным типом фазового разделения приве дены на диаграммах. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ На рис. 1A (верхняя панель) представлены круговые диаграммы, показывающие возможные паттерны фазовой сегрегации мембран липосом, сформиро ванных с участием сфингомиелина (СМ; 40 мол. %), холестерина (Хол; 20 мол. %) и различных легкоплав ких фосфолипидов (ПОФХ, ДОФХ или ДПОФХ; 40 мол. %). (Соответствующие температуры плавления фосфолипидов указаны в таблице.) Примеры ми крофотографий липидных везикул с тем или иным видом фазового разделения мембран (ld, lо, sо) пред ставлены на рис. 1Б ( верхняя панель). Сценарий фазового разделения в смеси СМ : Хол : ПОФХ из учен нами ранее [19]. Установлено, что 45 ± 13% СМ : Хол : ПОФХ-липосом содержат твердокристал лические домены нерегулярной формы (sо). Жидкие упорядоченные домены круглой формы (lо) включа ют 30 ± 11% ПОФХ : СМ : Хол-везикул. Оставшаяся часть - это гомогенно окрашенные флуоресцентным маркером липосомы (ld), не показывающие микро скопического фазового разделения. Из рис. 1А (верх няя панель) можно заметить, что замена в мембра нообразующей смеси ПОФХ на ДОФХ приводит к падению доли везикул, включающих sо-домены (19 ± 4%), и росту числа липосом, содержащих lо области (63 ± 10%). В случае ДПОФХ 82 ± 8% везикул гомогенно окрашены, отсутствует видимое фазовое разделение, а оставшаяся часть включает твер дые домены. Таким образом, в ряду ПОФХ, ДОФХ, ДПОФХ видимая фазовая сегрегация уменьшается. В указанном ряду толщина углеводородного осто ва неупорядоченных областей (dLd), включающих различные легкоплавкие фосфолипиды, снижает ся, а разница между толщиной гидрофобного реги она мембраны в упорядоченном и неупорядоченном состоянии (Δd) растет (рис. 2, левая часть) [22, 23]. В результате формирование границ между упоря доченными и неупорядоченными доменами, пред полагающее экспонирование части гидрофобного региона водному раствору, становится чрезвычайно невыгодным, и число липосом, характеризующихся выраженной фазовой сегрегацией, падает. Сходный вывод можно сделать, анализируя результаты, представленные на нижней панели рис. 1, которая показывает результаты исследования фазового раз деления в мембранах, включающих тетрамиристо илкардиолипин (ТМКЛ; 40 мол. %), Хол (20 мол. %) и различные легкоплавкие фосфолипиды (40 мол. %). Можно заметить, что все ТМКЛ-содержащие липо сомы независимо от вида легкоплавкого липида ха рактеризуются фазовым разделением (отсутствуют гомогенно окрашенные маркером липосомы, вклю чающие ТМКЛ). Различия между представленными липидными системами заключаются в процентном соотношении везикул, включающих lо- и sо-домены. Как отмечено выше, среди протестированных фос фолипидов ld-фазу с наименьшей толщиной образу ет ДПОФХ, что соответствует наибольшей величине Δd, а следовательно, наибольшей энергии формиро вания упорядоченных доменов. Поэтому липосомы, включающие этот фосфолипид, характеризуются менее выраженной фазовой сегрегацией (82 ± 7% имеют lо-домены) по сравнению с везикулами, со держащими ПОФХ и ДОФХ, которые формируют ld-фазы с большей толщиной и меньшим значением Δd, в результате чего наблюдается фазовое разде ление большинства липосом (85 ± 9% и 87 ± 8% соот ветственно) по типу ld/sо. Сравнение сценариев фазового поведения систем, включающих различные тугоплавкие липиды, также указывает на ключевую роль величины Δd в регу ляции латеральной гетерогенности трехкомпонент ных мембран. На рис. 1Б (нижняя панель) приведе ны микрофотографии ТМКЛ-содержащих липосом, включающих различные легкоплавкие фосфолипи ды. На рис. 1А видно, что замена в мембранообра зующей смеси СМ на ТМКЛ приводит к усилению фазовой сегрегации мембран. В случае ПОФХ- (ле вый столбец) и ДОФХ-содержащих бислоев (цен тральный столбец) увеличивается доля липосом с sо-доменами, а в случае мембран, включающих ДПОФХ, статистически значимо растет число вези кул с lо-областями (правый столбец). Это обуслов лено уменьшением толщины упорядоченной фазы при замене СМ на ТМКЛ, снижением разницы Δd (рис. 2, правая часть) и соответствующим падением энергии образования границ упорядоченных доменов. Таким образом, представленные на рис. 1 результа ты позволяют связывать сценарий латеральной гете рогенности трехкомпонентных мембран с величиной несоответствия толщины мембраны в упорядоченном и неупорядоченном состоянии: чем меньше Δd, тем сильнее фазовое разделение в бислое. Учитывая данные о влиянии дипольных моди фикаторов мембран не только на дипольный по тенциал, но и на упаковку мембранообразующих липидов [24-27], мы предположили, что эти агенты способны изменять сценарий фазовой сегрегации. Ранее нами было изучено действие дипольных мо дификаторов: флоретина, флорицина, кверцетина, мирицетина, RH 421 и RH 237, на сценарий фазо вого разделения в СМ/Хол/ПОФХ-везикулах [19]. Результаты представлены на рис. 3А (верхняя па нель). Видно, что все использованные модификаторы вызывают ослабление фазовой сегрегации мембран, выражающееся в уменьшении доли липосом с гель доменами. При этом при введении флоретина, квер цетина или мирицетина уменьшение числа везикул с sо-доменами сопровождается соответствующим ро стом процентного содержания гомогенно окрашен ных липосом на 40-45%, а в присутствии флорицина, RH 421 и RH 237 - как увеличением доли везикул с lо-доменами приблизительно на 30-35%, так и не значительным ростом содержания гомогенных ли посом (на 5-10%). Наблюдаемый рост относительного числа гомогенно окрашенных ДОФХ-содержащих липосом в присутствии флоретина, флорицина, RH 421 и RH 237 (на 10-30%) и полное исчезновение ве зикул с sо-доменами в случае флоретина можно ин терпретировать как ослабление фазовой сегрегации мембран после введения дипольных модификаторов, так же как и в случае ПОФХ (рис. 3А, средняя па нель). Примеры микрофотографий липидных вези кул, включающих ДОФХ, Хол и СМ и показывающих тот или иной сценарий фазовой сегрегации бислоя (ld, lо, sо) в присутствии флоретина и RH 421, представ лены на рис. 3Б. Статистически значимых различий в изменении сценария фазовой сегрегации ДОФХ содержащих мембран в присутствии кверцетина и мирицетина не выявлено. Трансформация сценария фазового разделения СМ-содержащих мембран в присутствии модифика торов может быть обусловлена увеличением величи ны Δd под действием тестируемых агентов. Наиболее вероятным вариантом развития событий является увеличение площади, занимаемой полярными голов ками мембранообразующих липидов, вызванное по гружением модифицирующих агентов в липидный бислой и диполь-дипольным взаимодействием их молекул. Это приведет к относительному росту под вижности углеводородных цепей и вызовет падение температуры плавления липидов, показанное мето дами дифференциальной сканирующей микрокало риметрии [18, 25, 28]. Подобному «более текучему» состоянию липидов в мембране соответствует мень шая толщина бислоя. В таком случае выраженность эффекта модификатора будет зависеть от формы и гидрофобности его молекул, определяющих глу бину погружения агента в бислой. По этой причине наиболее сильное воздействие на латеральную гетерогенность мембран оказывает относительно гидро фобный флоретин, в то время как эффекты его более гидрофильных аналогов, гликозида флорицина и вы сокогидроксилированных флавонолов, кверцетина и мирицетина, менее выражены. Длины молекул стирилпиридиновых красителей, RH 421 и RH 237, достаточно для почти полного пронизывания липид ного монослоя, а увеличение площади, приходящейся на одну молекулу липида в мембране, обусловлено, главным образом, электростатическим отталкивани ем сульфогрупп молекул красителей, локализован ных в полярной области бислоя [27]. Помимо типа модификатора, регуляторную роль играют также геометрические характеристики мо лекул липидов, образующих фазу, куда встраивают ся модифицирующие соединения. В случае липидов, имеющих близкую к цилиндрической форму, ДОФХ, ПОФХ и СМ [29-31] можно ожидать более выражен ного «разжижения» ld-областей по сравнению с упо рядоченными доменами, поскольку встраивание модификаторов в последние области должно быть затруднено ввиду более плотной упаковки липидов. Такой сценарий соответствует случаю, схематически изображенному на левой части рис. 2. Как видно на нижней панели рис. 3А, в случае ДПОФХ-содержащих мембран не выявлено стати стически значимых различий паттернов фазового разделения до и после введения тестируемых мо дификаторов. Учитывая, что преобладающее число везикул, включающих ДПОФХ, не характеризует ся фазовой сегрегацией даже в отсутствие диполь модифицирующих агентов вследствие наибольшей среди изучаемых липидных систем величины не соответствия толщины мембраны в упорядоченном и неупорядоченном состоянии, дальнейший рост Δd не приводит к значимым изменениям особенностей фазового разделения в бислоях. В отличие от СМ, ТМКЛ имеет форму инвертиро ванного конуса, что обуславливает отрицательную спонтанную кривизну образуемых им монослоев [32]. По всей вероятности, это облегчает встраивание модификаторов, молекулы которых имеют кониче скую форму, в упорядоченную фазу, обогащенную ТМКЛ. Одновременное «разжижение» как неупоря доченных ld-областей, так и упорядоченных доме нов не приведет к существенному изменению скачка толщины на границе раздела липидных фаз, а сле довательно, изменения сценария фазовой сегре гации под действием модификаторов наблюдаться не будут. На рис. 4А можно видеть, что независимо от вида легкоплавкого фосфолипида, входящего в со став модельных мембран, в присутствии дипольных модификаторов не происходит достоверного увели чения относительного числа ТМКЛ-содержащих ли посом с lо-доменами или появления везикул, не де монстрирующих видимого фазового разделения. Микрофотографии липидных везикул, включающих ДОФХ, Хол и ТМКЛ и модифицированных флорети ном или RH 421, представлены на рис. 4Б. Таким образом, полученные нами результаты ука зывают на ключевую роль величины несоответствия толщины мембраны в упорядоченном и неупорядо ченном состоянии в регуляции фазового разделения в трехкомпонентных модельных мембранах, а также открывают новые перспективы использования ди польных модификаторов для направленного видоиз менения сценария латеральной гетерогенности ли пидных бислоев.

Об авторах

С. С. Ефимова

Email: osostroumova@mail.ru
Россия

O. С. Остроумова

Автор, ответственный за переписку.
Email: osostroumova@mail.ru
Россия

Список литературы

Дополнительные файлы