Болезнь Хантингтона: нарушения кальциевой сигнализации и модели для изучения развития патологии

Полный текст

ВВЕДЕНИЕ Наследственная природа болезни Хантингтона (БХ) была установлена и описана Джорджем Хантингтоном в его оригинальной рукописи поч ти полтора века назад [1]. БХ, наследуемая по ау тосомно-доминантному типу, обусловлена мута цией, которая приводит к увеличению количества CAG-повторов в гене белка хантингтина (Htt), ло кализованного на хромосоме 4p16.3. В результате данной мутации в N-концевой области белка Htt увеличивается количество остатков глутамина (Q), что различными путями приводит к наблюдаемым патологиям [2]. В норме полиглутаминовый тракт со держит не более 35 остатков глутамина [3]. Для бо лезни Хантингтона характерна избирательная ги бель GABAергических нейронов стриатума [3], в то время как при болезни Паркинсона поражаются в основном дофаминергические нейроны черной суб станции [4], а при болезни Альцгеймера наблюдается преимущественная гибель нейронов гиппокампа [5]. На сегодняшний день известно несколько механиз мов, вносящих вклад в патогенез БХ, включая новые токсические свойства мутантного Htt (mHtt), одно временно с нарушением функций нормального Htt [6]. Данные изменения приводят к нарушению регу ляции транскрипции гена, кодирующего Htt [7], си наптической дисфункции и эксайтотоксичности [8, 9], нарушению гомеостаза mHtt [10], дефектам вну триклеточного транспорта [11], митохондриальной дисфункции [12-14] и нарушениям кальциевой сиг нализации [15-17]. МАНИФЕСТАЦИЯ И ДИАГНОСТИКА БХ Распространенность БХ достаточно велика: частота заболевания составляет примерно 1 : 1000000 у лю дей с азиатским и африканским происхождением и 5-10 : 100000 у лиц европеоидной расы, не считая множества людей, входящих в группу риска. У мужчин БХ встречается чаще, чем у женщин, проявляет ся преимущественно после 30 лет и обычно приводит к летальному исходу через 15-20 лет после появле ния первых симптомов. В то же время наличие длин ных полиглутаминовых трактов может быть при чиной ювенильной или даже инфантильной формы БХ. Мутации, увеличивающие длину глутаминовых повторов до 36-40Q, обладают неполной пенетрант ностью; повторы длиной более 41Q полностью пене трантны [18]. Длина полиглутаминового тракта в mHtt пря мо коррелирует со степенью тяжести заболевания и в подавляющем большинстве случаев обратно кор релирует с возрастом появления первых симптомов [19]. Тем не менее, существует значительная вари абельность между ожидаемым и наблюдаемым воз растом манифестации [20]. Так, при одинаковой дли не полиглутаминового тракта, особенно в диапазоне 40-44Q, возраст манифестации может отличаться на 20 лет [21]. Подобное различие можно объяснить присутствием ряда генетических модификаторов, регулирующих экспрессию как Htt, так и других белков, и опосредующих таким образом повышенную чувствительность либо устойчивость к заболеванию. Например, полиморфизм S18Y в гене, кодирующем убиквитин-С-концевую гидролазу UCH-L1, связан с более поздней манифестацией БХ [22]. У пациен тов с мутацией M441T в гене белка, ассоциированного с Htt (Hap1), БХ проявлялась в более раннем возрас те за счет ослабления взаимодействия Hap1 с mHtt и, как следствие, повышения опосредованной Htt ток сичности [23]. Недавно показали, что однонуклеотид ный полиморфизм в промоторе гена Htt, расположен ный в сайте связывания с фактором NF-κB, снижает активность промотора и, как следствие, экспрессию Htt, что приводит к более поздней манифестации БХ [24]. Однако генетической мутации недостаточно как для прогнозирования индивидуального риска заболеваний, так и для оценки текущих физиологи ческих процессов в организме. Поэтому для разра ботки новых лекарственных средств, определения эффективности лечения и влияния факторов внеш ней среды важна идентификация биомаркеров про грессирования БХ, которые могут дать информацию о патологических процессах до проявления клини ческих симптомов. К недавним достижениям диагно стики можно отнести количественное определение уровня mHtt с помощью сверхчувствительного им мунологического анализа одиночных молекул в об разцах цереброспинальной жидкости лиц, несущих мутацию в этом гене [25]. Так как Htt экспрессируется практически во всех тканях организма, изменения, вызываемые mHtt, могут быть обнаружены даже в крови. Участие лей коцитов в иммунном ответе делает анализ крови иде альным способом выявления таких патологических процессов при БХ, как периферические воспаления. При БХ в крови увеличена экспрессия продукта гена Y гистонов семейства H2A [26]. В ходе клинических исследований показано, что экспрессия этого гена как в образцах крови, так и в тканях мозга при БХ в 1.6 раза выше, чем в контрольной группе. С помо щью технологий секвенирования нового поколения и Fluidigm выявлено пять генов, кодирующих потен циальные биомаркеры БХ, детектируемые в крови пациентов [27]. Установлена корреляция между ког нитивными нарушениями при БХ и уровнями пеп тидного гормона прокинетицина 2 (PROK2), участву ющего в регуляции циркадных ритмов [28]. Таким образом, PROK2 рассматривается как один из много обещающих маркеров прогрессирования БХ. В крови пациентов с БХ обнаружено также повышение уров ня мРНК аквапорина 9 [29]. Изменчивость клинического фенотипа БХ и по тенциальное влияние совокупности экологических и фармакологических факторов приводят к не обходимости комбинирования различных мар керов прогрессирования БХ. Снижение уровня N-ацетиласпартата (NAA) в тканях мозга считается достоверным индикатором дисфункции и гибели ней ронов и, что важно для клинической диагностики, мо жет быть измерено неинвазивно с помощью МРТ [30]. Оказалось, что у пациентов с ранней манифестацией БХ уровень NAA ниже, чем в контрольной группе. В то же время у них существенно повышен уровень миоинозита - маркера глиоза [31]. Связь между уровнем NAA и степенью тяжести заболевания от крывает возможность использования данного мета болита в качестве идентификатора нейрохимических реакций при оценке эффективности потенциальных терапевтических агентов. В сыворотке крови при БХ увеличивается кон центрация вазопрессина, играющего важную роль в гомеостазе жидкостей организма [32], а также 8-гидрокси-2-дезоксигуанозина (индикатора окис лительного повреждения ДНК); продуктов пере кисного окисления липидов (молочной кислоты, 4-гидроксиноненала и малондиальдегида), что позво ляет рассматривать эти вещества как потенциальные биомаркеры [33]. В эритроцитах пациентов c БХ на блюдалось снижение уровня глутатионпероксидазы и Cu,Zn-супероксиддисмутазы [34], а в посмертных срезах мозга и образцах плазмы повышен уровень цитокинов, включая интерлейкины-4, -6, -8, -10, -23, TNF-α, а также кластерина [35]. Использование всех этих биомаркеров будет спо собствовать точной оценке эффективности новых методов лечения, повысит безопасность и эффектив ность доклинических и клинических испытаний. БЕЛОК ХАНТИНГТИН Развитие БХ обусловлено мутацией в гене белка хантингтина. Хантингтин - белок с молекулярной массой около 350 кДа и полиглутаминовым трак том в N-концевой области. В той же области на ходится обогащенный остатками пролина домен, участвующий в белок-белковых взаимодействиях и предохраняющий хантингтин от агрегации [36]. Схема расположения доменов хантингтина человека представлена на рис. 1. В клетке хантингтин выполняет функции скаф фолд-белка, т.е. обеспечивает колокализацию взаи модействующих с ним белков, помогая им выполнять свои функции. С хантингтином взаимодействует мно жество белков (особенно с его N-концевой областью), осуществляющих самые разнообразные функции - от везикулярного транспорта и эндоцитоза до регу ляции транскрипции и апоптоза [37]. Молекула хантингтина выглядит как соленоид с гидрофобным кором, сформированным из состыко ванных HEAT-повторов. Эти повторы вместе с обо гащенным пролином участком принимают участие в белок-белковых взаимодействиях. Свое название НЕАТ-повторы получили по первым буквам в обо значениях четырех белков, в которых они были впервые обнаружены (Huntingtin, Elongation factor 3, PR65/A -субъединица фосфатазы 2А и липид киназа TOR) [38]. Структура коротких N-концевых фрагментов хантингтина изучена с помощью рент геноструктурного анализа [39] и методом ядерно го магнитного резонанса [40]. Недавно показали, что вторичная структура хантингтина меняется в за висимости от длины полиглутаминового тракта [41]. С помощью электронной микроскопии получены изо бражения нормального и мутантного хантингтинов, имеющих сферическую структуру с полостью [41]. Изображения Htt23Q и Htt78Q очень близки, одна ко влияние полиглутаминового тракта на структуру хантингтина предполагает, что при взаимодействии со своими белками-партнерами хантингтин может подвергаться значительным конформационным пе рестройкам [41]. Несмотря на сказанное, на сегод няшний день не до конца понятно, как связана струк тура хантингтина с его функциями, и как изменения его структуры в результате мутации приводят к на блюдаемым патологиям. Считается, что БХ ассоциирована с отщеплением от мутантного хантингтина N-концевого фрагмента, который кодируется первым экзоном и содержит polyQ-тракт. Отщепленный фрагмент накаплива ется в ядре, в то время как хантингтин дикого типа локализован в основном в цитозоле [42, 43]. Выбор и изменение места, где будет находиться хантингтин, определяются посттрансляционными модификаци ями [44]. Накопление агрегированных N-концевых фрагментов mHtt в ядре и ассоциированных с ними белков, таких, как различные транскрипционные факторы, белки теплового шока и компоненты проте асом, затрудняет выполнение ими своих нормальных функций и, как следствие, приводит к различным па тологиям в клетке [45]. К нейропатологическим маркерам БХ относят ся внутриклеточные включения, образованные N-концевыми фрагментами mHtt, обнаруженные при посмертном исследовании мозга пациентов с БХ, а также в животных и клеточных моделях БХ [42, 46, 47]. Образование нерастворимых агрегатов при БХ не вызывает сомнения, однако многие исследования показывают, что этот процесс не связан непосред ственно с дегенерацией нейронов. Так, экспрессия mHtt в культуре нейронов стриатума показала нако пление нерастворимых белковых агрегатов, не кор релирующее с гибелью нейронов. Более того, умень шение внутриядерных включений mHtt совпадало с усилением нейродегенеративных процессов [48]. Изучение нейронов, экспрессирующих первый эк зон mHtt, также показало, что гибель нейронов кор релирует с увеличением длины полиглутаминового тракта и с количеством диффузного mHtt в клетке, в то время как накопление агрегатов лишь снижает количество растворенного mHtt и увеличивает та ким образом выживаемость нейронов [49]. Считается, что за амилоидную токсичность ответственны неста бильные, гетерогенные префибриллярные агрегаты, тогда как зрелые фибриллы представляют собой ста бильные и безвредные хранилища токсичных эле ментов [50]. Приведенные факты приводят к мысли, что об разование агрегатов при БХ не может быть един ственной причиной развития патологии, и выясне ние молекулярных причин БХ остается актуальной задачей. МОДЕЛИРОВАНИЕ БХ Для изучения молекулярных механизмов нейродеге нерации, равно как и для проведения исследований, связанных с поиском новых лекарств, исключитель но важным представляется создание адекватных мо делей заболевания. Так как БХ - это наследственное заболевание, обусловленное мутацией в единствен ном гене, существует возможность с помощью гене тических манипуляций создавать различные модели, достаточно точно воспроизводящие патологию забо левания (рис. 2). Мыши R6/2 обладают устойчивым фенотипом, включающим нарушение координации и походки, ги поактивность и когнитивную дисфункцию. Возраст манифестации заболевания в данной модели - по рядка 4 недель [51]. У мышей R6/2 формируются агрегаты, содержащие внутриклеточные включения, аналогичные обнаруженным в биопсийных образцах тканей мозга пациентов с БХ [52]. Однако, несмотря на устойчивость фенотипа, R6/2 не могут служить точной моделью БХ, так как экспрессируют только N-концевой фрагмент мутантного белка. Тем не ме нее, мышей R6/2 широко используют для моделиро вания общих черт полиглутаминовых заболеваний, включая аномальную конформацию белка, обуслов ленную расширенным polyQ-трактом. Трансгенные мыши YAC128 и BACHD, содержа щие 128Q и 97Q в полноразмерном мутантном бел ке соответственно, имеют более мягкий фенотип БХ по сравнению с фенотипом, наблюдаемым в модели R6/2 [53]. Самый слабый фенотип БХ имеют мышиные мо дели knock-in. Даже при экспрессии 150Q у мышей HdhQ150/Q150 выявлено меньше нарушений, чем у R6/2. У мышей HdhQ150/Q150 первые симптомы заболевания, включающие моторную дисфункцию и нарушение походки, появляются в более позднем возрасте [54]. Несмотря на то что мышиные модели основаны на мутации, вызывающей заболевание, в большин стве из них отсутствует стабильная потеря нейро нов, наблюдаемая у пациентов. Для преодоления этой проблемы требуются другие модельные организмы. Токсичность N-концевого фрагмента mHtt проявля ется ярче при использовании крупных млекопитаю щих, таких, как свиньи и обезьяны, тогда как у овец, экспрессирующих полноразмерный mHtt, отсутству ют выраженные фенотипические признаки заболе вания [55]. Однако, несмотря на ряд преимуществ, к существенным недостаткам этих моделей относят ся высокая стоимость и необходимость специального лабораторного оборудования для содержания. Drosophila melanogaster и Caenorhabditis elegans также используются для моделирования БХ. Преимуществом этих организмов является короткая продолжительность жизни и быстрое воспроизведе ние. Обнаружение у Drosophila ортолога Htt человека предполагает наличие у этих насекомых путей, не обходимых для нормального функционирования Htt, что делает Drosophila хорошей моделью для изучения БХ [56]. Еще одна интересная особенность Drosophila как модели БХ - возможность легко оценивать ней родегенерацию визуально. Сверхэкспрессия mHtt у Drosophila приводит к формированию агрегатов, ги бели нейронов и снижению выживаемости [57]. Кроме того, моделирование БХ на Drosophila позволяет вос произвести такие симптомы, как моторная дисфунк ция, ухудшение когнитивных способностей и памяти [58]. У C. elegans, экспрессирующих в мышечных клет ках polyQ-тракт, слитый с желтым флуоресцентным белком (YFP), наблюдали формирование агрегатов, клеточную токсичность и паралич, прямо коррелиру ющие с возрастом и количеством повторов Q [59]. Обе упомянутые модели активно используются для те стирования потенциальных лекарственных средств против БХ. Однако столь далекие от человека моде ли не способны в полной мере воспроизводить карти ну, наблюдаемую у пациентов с БХ. Так, например, экспрессия фрагментов Htt с полиглутаминовыми трактами с 88 или 128Q в C. elegans приводила к зна чительной нейрональной дисфункции и утрате чув ствительности к прикосновению, не вызывая при этом гибели нейронов [60]. Достаточно часто используют дрожжевую модель БХ. Так, например, на дрожжах показаны различные патологические эффекты агрегации mHtt - наруше ние эндоцитоза, метаболизма триптофана, клеточно го цикла и деградации белков [61-63]. Существуют и негенетические животные модели БХ, основанные на использовании химических ве ществ (рис. 2). Так, например, 3-нитропропионовую и хинолиновую кислоты используют в качестве эксайтотоксических агентов в животных моделях БХ. Первое соединение является токсином, который дей ствует на митохондрии и индуцирует нейротоксич ность путем необратимого ингибирования сукцинат дегидрогеназы - ключевого фермента дыхательной цепи, ответственного за окисление сукцината в фу марат. Хинолиновая кислота является агонистом ре цептора N-метил-D-аспартата. Эксайтотоксичность, вызванную этими соединениями, изучали на срезах стриатума, сагиттальных срезах гиппокампа [64], а также на срезах гиппокампа трансгенных мышей R6/2 [65]. Необходимо отметить, что многие патологические проявления, наблюдаемые при БХ, могут быть изучены на клеточном уровне (рис. 3). Клетки могут быть трансфицированы как полноразмерным mHtt, так и его фрагментами с различной длиной рolyQ тракта. Например, трансфекция клеток PC-12 пер вым экзоном mHtt приводила к локализации mHtt в ядре, изменению морфологии и экспрессии генов, а также к снижению выживаемости [66]. Получено большое количество иммортализован ных клеточных линий, моделирующих БХ, однако они позволяют выявлять далеко не все патологи ческие проявления БХ. Поэтому довольно часто используют первичные культуры нейронов, полу ченные из трансгенных мышей, моделирующих БХ [67-69], или нейроны, выделенные из животных ди кого типа с последующим введением вектора для экс прессии mHtt или его фрагмента [16]. Интересной и перспективной моделью БХ являют ся кортикостриатальные срезы мозга крысы, транс фицированные конструкциями, экспрессирующими mHtt человека. Эта модель имеет преимущество пе ред простыми клеточными моделями, поскольку она поддерживает постоянное взаимодействие между клетками, что важно при изучении патогенеза БХ [70]. Эта модель может быть использована для из учения действия потенциальных терапевтических агентов, эффективных при БХ. Один из наиболее современных и многообещаю щих подходов к моделированию БХ и других ней родегенеративных заболеваний - использование пациент-специфичных индуцированных плюрипо тентных стволовых клеток (HDiPSC), в которых му тантные формы хантингтина экспрессируются эн догенно. Разработаны протоколы дифференцировки iPSC в фенотип, сходный с фенотипом срединных шипиковых нейронов стриатума (MSN) [71-73] - клеток, наиболее уязвимых при БХ. Одним из пре имуществ HDiPSC является возможность изучения патологических процессов, связанных с экспрессией mHtt с небольшой длиной polyQ-тракта [73], которая, как правило, не вызывает патологических изменений в других моделях. Экспрессия генов и белков в HDiPSC отличалась от экспрессии в контроле, наблюдались изменения в протеостазе, развитии нейронов, внутриклеточном транспорте, метаболизме РНК и клеточном метабо лизме [74]. Кроме того, степень нарушения экспрес сии прямо коррелировала с длиной рolyQ-тракта. Дифференцированные из HDiPSC нейроны имели ас социированный с заболеванием фенотип, в том числе электрофизиологические изменения, изменения ме таболизма, клеточной адгезии и клеточной токсич ности. Клетки, содержащие самый длинный рolyQ тракт, были наиболее чувствительными к стрессу, например, к отсутствию в клеточной среде BDNF (Brain-derived neurotrophic factor). Изучение ней ронов, дифференцированных из HDiPSC, выявило изменения в активности лизосом [73, 75], фрагмен тации митохондрий [76] и работе репрессоров транс крипции [77]. Еще одна сфера использования HDiPSC - транс плантация клеток для «замещения» больных клеток. Предшественники нейронов, дифференцированные из iPSC, имплантировали крысам, моделирующим БХ. При этом наблюдали восстановление нормаль ного поведения [78]. Оказалось, что предшественники нейронов из HDiPSC в той же мере восстанавливали популяцию GABAергических нейронов стриатума и приводили к нормализации поведения крыс, однако в данном случае на длительных сроках наблюдений пересаженные клетки начинали проявлять пато логические свойства [78], что подчеркивает необхо димость предварительной генетической коррекции при проведении аутологической трансплантации. НАРУШЕНИЕ ГОМЕОСТАЗА КАЛЬЦИЯ ПРИ БХ Нарушения кальциевой сигнализации характерны для различных нейродегенеративных заболеваний, таких, как БХ, болезни Альцгеймера и Паркинсона, боковой амиотрофический склероз [16, 79-81]. На животных моделях БХ, созданных с использо ванием генетически доставляемого mHtt или инду цированных 3-нитропропионовой кислотой (3-NPA), показано, что нарушение кальциевой сигнализации является отличительной чертой БХ. Влияние mHtt на кальциевую сигнализацию в клетке происходит сразу по многим направлениям, включая взаимодействие с кальцийсвязывающими белками, мембранами митохондрий, регуляцию при тока кальция из внеклеточной среды и высвобожде ния кальция из внутриклеточных депо (рис. 4). Среди главных участников нейрональной кальцие вой сигнализации можно выделить кальцийсвязывающие белки, активирующиеся при связывании с Ca2+ и регулирующие уровень свободного Ca2+; белки, экс портирующие Ca2+ из цитозоля во внеклеточную сре ду (АТР-азы плазматической мембраны, Na+/Ca2+ обменники) или в полость органелл (SERCA), а также кальциевые каналы, отвечающие за доставку Ca2+ в цитоплазму [82, 83]. mHtt взаимодействует непосредственно с каль цийсвязывающими белками [84], что может приво дить к повышению внутриклеточной концентрации Ca2+ и нарушению нормального функционирования этих белков [85]. В частности, взаимодействие mHtt с кальмодулином обнаружено в белковых комплек сах с большой молекулярной массой [84], а наруше ние этого взаимодействия оказывало нейропротек торный эффект [85, 86]. Одна из причин опасности длительного повышения уровня Ca2+ в цитозоле - активация кальпаина, Ca2+-активируемой цистеи новой протеазы, действие которой практически не обратимо. Кальпаин разрушает белки цитоскелета и другие примембранные белки. На Drosophila, моде лирующей БХ, показано, что подавление кальпаина предотвращает агрегацию и токсичность mHtt, сти мулируя аутофагию. Сверхэкспрессия кальпастати на - ингибитора кальпаина, увеличивает количество аутофагосом и благоприятно влияет на мышей, моде лирующих БХ, что делает этот процесс подходящим для разработки подходов к терапии БХ [87]. Важно отметить, что нарушение кальциевой сиг нализации при БХ происходит еще на уровне транс крипции, так как фрагменты mHtt влияют на из менение экспрессии некоторых генов кальциевого гомеостаза как в мышиных моделях, так и у пациен тов с БХ [6, 88]. Геномные исследования, проведенные на различных моделях БХ, выявили существенные различия в уровнях мРНК генов, кодирующих белки, участвующие во внутриклеточной Ca2+-регуляции, в том числе таких кальцийсвязывающих белков, как парвальбумин, кальмодулин, кальбиндин, гипо кальцин; а также рианодиновый рецептор типа 1, ре цептор инозитолтрисфосфата (InsP3R1) и различные субъединицы потенциал-управляемых кальциевых каналов (VGCC) [88-91]. В частности, в мононуклеар ных клетках периферической крови при БХ снижен уровень мРНК кальциевого насоса саркоплазматиче ского ретикулума SERCA2 [92]. Недавно с использованием анализа категорий генной онтологии выявили ряд генов, кодирующих белки кальциевой сигнализации, экспрессия кото рых нарушена в нейронах, дифференцированных из HDiPSС [73]. Нарушения транскрипции могут дополнительно усиливаться благодаря кальций-зависимым меха низмам контроля. Это может проявляться в резуль тате нарушений в кальций-зависимой регуляции активности и стабильности факторов транскрипции, а также изменения функций некоторых кальцийсвязывающих белков, например репрессора транс крипции DREAM (downstream responsive element antagonist modulator), который перемещается в ядро в ответ на увеличение [Ca2+] в цитозоле [93, 94]; и ко фактора LMO4, активность которого индуцируется притоком Ca2+ через VGCC [95]. Также при БХ увеличивается активность глута матных рецепторов, что приводит к значительному притоку кальция через плазматическую мембрану (ПМ) в цитозоль, нейрональным нарушениям и кле точной гибели. Обнаружена связь между полиглута миновой экспансией и чувствительностью нейронов к опосредованной глутаматом эксайтотоксичности [96]. Увеличение входа кальция в цитозоль через рецепторы NMDA (NMDAR) обусловлено потенци рующим влиянием mHtt на транспорт и встраива ние NMDAR в ПМ [97]. При этом различия в уров нях экспрессии и субъединичном составе NMDAR в разных клетках могут быть одной из причин, объ ясняющих селективную гибель MSN при БХ [98]. Фармакологическое ингибирование NMDAR ока зывало нейропротекторное действие на первичную культуру мышиных MSN, моделирующих БХ [99, 100]. Необходимо также отметить, что мыши YAC128 отличались повышенной экспрессией внесинаптиче ского NMDAR, что приводило к нарушению сигналь ных путей p38 MAPK и CREB, дисфункции и атро фии стриатума [101]. Показано также, что mHtt влияет на VGCC, свя зываясь непосредственно с вспомогательной α2/δ субъединицей VGCC [102]. Ассоциация N-концевого домена хантингтина (как мутантного, так и нормаль ного) с каналообразующей CaV2.2-субъединицей VGCC N-типа приводит к замещению синтаксина 1А, осуществляющего негативную регуляцию кана ла, и, как следствие, к увеличению активности VGCC N-типа [103]. Этот пример указывает на возможные физиологические функции отщепления N-концевого фрагмента от нормального хантингтина, тогда как для понимания роли VGCC N-типа в патологии необходимы дальнейшие исследования. В то же вре мя возможную гиперфункцию VGCC при БХ под тверждают полученные на Drosophila результаты, показывающие, что удаление Dmca1D (белка, обра зующего у дрозофил пору VGCC L-типа) приводит к снижению нейродегенерации фоторецептора [104]. Сверхэкспрессия фрагментов mHtt в клетках предшественниках нейронов стриатума (Q7/7) при водит к значительному снижению [Ca2+] в эндоплаз матическом ретикулуме (ЭР), в то время как [Ca2+] в цитозоле оставалась такой же, как в контроле [105]. Аппликация циклопиазоновой кислоты индуцирова ла повышение выброса Ca2+ из ЭР в цитозоль в линии клеток стриатума, полученной из knock-in мыши ных эмбрионов, экспрессирующих mHtt с 111Q [106]. В то же время экспрессия mHtt в клетках PC-12 не приводила к статистически значимым изменениям в содержании кальция в ЭР [91]. Показано, что mHtt (но не Htt дикого типа) не посредственно взаимодействует с С-концевой ча стью InsP3R1, увеличивая его чувствительность к InsP3 [107], тем самым способствуя оттоку Ca2+ из ЭР. Важная роль InsP3R1 в нейротоксичности, вызванной полиглутаминовой экспансией, под тверждена экспериментально на первичной культу ре MSN мышей, моделирующих БХ [99, 102], а так же на D. melanogaster [108]. Установлено также, что пептид, дестабилизирующий взаимодействие между mHtt и InsP3R1, оказывает нейропротектор ное действие на клетки MSN, моделирующие БХ [109]. Кроме того, подавление экспрессии гена InsP3R уменьшает агрегацию mHtt [110], что подчеркивает важность взаимодействия двух белков в патогенезе БХ. mHtt, взаимодействуя с InsP3R1 и влияя тем са мым на содержание Ca2+ в ЭР, может нарушать функции SOC (Store-Operated Calcium) каналов. Активация этих каналов происходит в ответ на по нижение концентрации кальция во внутриклеточ ных кальциевых депо, наиболее общим из которых является ЭР. Таким образом, результатом акти вации InsP3R1 будет не только опустошение депо, но и последующий депо-управляемый вход кальция через ПМ. При этом важно отметить, что наруше ние SOCE (SOC Entry) обнаружено при многих ней родегенеративных заболеваниях, включая болезнь Альцгеймера, спиноцеребеллярную атаксию и БХ [80, 111-113]. Нарушение SOCE может быть обусловлено изме нением уровня белков STIM1/2, содержащих доме ны типа EF-hand и выполняющих функции сенсоров кальция в просвете ЭР. Такие изменения могут быть вызваны нарушениями протеасомной деградации, которые наблюдаются при нейродегенерации [114]. Значительное увеличение SOCE обнаружено в клетках нейробластомы SK-N-SH, экспрессирую щих mHtt138Q [113]. Предположили, что значитель ное повышение SOCE в клетках, моделирующих БХ, опосредовано не изменением свойств каналов SOC, а увеличением их количества, однако, следует отме тить, что прямые экспериментальные доказательства этой гипотезы в дальнейшем не были представлены. В клетках SK-N-SH, экспрессирующих не полно размерный mHtt, но его N-концевой фрагмент, так же наблюдалось значительное повышение SOCE. Дополнительно было показано, что для активации SOCE необходим белок STIM1. В условиях супрес сии STIM1 происходило снижение SOCE, причем регистрируемые токи можно было разделить на два типа: с высоким и низким потенциалом реверсии, что предполагает конкуренцию за взаимодействие со STIM1 SOC-каналов минимум двух типов [115]. Данные о том, что не менее двух различных белков опосредуют вход кальция по депо-управляемому механизму, также получены на моделях БХ - клет ках нейробластомы мыши Neuro-2a и на первичной культуре нейронов стриатума мыши [16]. Используя методы локальной фиксации потенциала и РНК интерференции, установили, что каналообразую щие белки Orai1 и TRPC1 совместно поддержива ют SOCE в клетках, экспрессирующих N-концевой фрагмент mHtt со 138Q, что может объясняться су ществованием гетеромерного канала, содержащего субъединицы Orai1 и TRPC1 [16]. Предположения о существовании такого гетеромерного канала вы сказывались еще в 2007 [116], однако в дальнейшем экспериментальных данных, подтверждающих этот тезис, опубликовано не было. В то же время пока зано, что вход кальция через каналы, образованные Orai1, необходим для встраивания белков TRPC1 в ПМ [117]. Таким образом, можно предположить, что основной вклад в амплитуду депо-управляемых токов в клетках Neuro-2a, моделирующих БХ, вносят белки TRPC1, что подтверждается драматическим падением тока в условиях супрессии TRPC1. Однако в условиях супрессии Orai1 также наблюдалось зна чительное снижение амплитуды SOCE, что теперь можно объяснить не только уменьшением тока через Orai1, но и снижением TRPC1-опосредованной ком поненты тока вследствие нарушения трафика TRPC1 на плазматическую мембрану [16]. Важность TRPC1 в патогенезе БХ подтверждают результаты, согласно которым супрессия TRPC1 с помощью короткой ин терферирующей РНК оказывает значительный про текторный эффект на MSN мышей YAC128 в модели апоптоза, индуцированного глутаматом. При этом су прессия TRPC1 в нейронах мышей дикого типа прак тически не влияла на гибель клеток, опосредованную глутаматом [111]. Экспрессия N-концевого фрагмента mHtt в пер вичной культуре MSN также приводит к аномально большому депо-управляемому входу кальция в ци тозоль [16]. Эти результаты подтверждаются изме рениями внутриклеточной концентрации кальция с помощью кальциевого зонда FURA-2 в клетках MSN, выделенных из мышей YAC128 [111]. Более того, изучено действие на данные клетки соединения EVP4593 - блокатора сигнального пути NF-κB [111]. Известна тесная связь между активацией NF-κB и депо-управляемым входом кальция [118, 119]. NF- κB способен связываться с геном Htt и усиливать ак тивность его промотора в нейронах стриатума мыши [24]. mHtt также может связываться с одним из клю чевых ферментов сигнального пути NF-κB, IKK, уве личивая тем самым его активность [120]. Показано, что соединение EVP4593 обратимо снижает аномально большой SOCE до контроль ных значений как в SK-N-SH, экспрессирующих mHtt с 138Q, так и в MSN мышей YAC128 [111]. Аналогичный эффект EVP4593 оказывал на клетки MSN, экспрессирующие N-концевой фрагмент mHtt [16]. В настоящее время можно считать доказанным, что соединение EVP4593 действует как блокатор SOCE, необходимого для начальных этапов актива ции сигнальных путей NF-κB, однако поиски молеку лярной мишени EVP4593 продолжаются до сих пор. Следует отметить, что EVP4593 обладает высоким терапевтическим потенциалом, поскольку оказыва ет нейропротекторный эффект при индуцированном глутаматом апоптозе MSN из мышей YAC128 и вы зывает положительный эффект в тестах на моторику на D. melanogaster, моделях БХ [111]. Как показали цитофлуориметрические измерения, инкубация кле ток Neuro-2а, моделирующих БХ, с EVP4593 приво дила к повышению выживаемости этих клеток [16]. На основе опубликованных данных можно пред положить, что нейропротекторный эффект EVP4593 обусловлен существованием отрицательной обрат ной связи в цепочке воздействия mHtt на клетку. Поскольку NF-κB способен связываться непосред ственно с Htt и усиливать активность его промотора [24], а EVP4593 блокирует проведение сигнала NF-κB, возможным результатом аппликации EVP4593 может стать снижение экспрессии mHtt и, как следствие, уменьшение его токсических функций. Тем не менее, для подтверждения подобного предположения требу ются дополнительные исследования. Особый интерес представляет изучение влия ния экспрессии mHtt на SOCE, выполненное на БХ специфичных нейронах человека, дифференциро ванных из iPSC и экспрессирующих mHtt с низким количеством Q в тракте. Несмотря на то что поли глутаминовый тракт mHtt в этой модели заболева ния содержал всего 40-47Q, что находится на грани це с нормой, изменения в SOCE оказались столь же существенными, как и в других моделях, где длина тракта превышала 100Q [73]. При этом соединение EVP4593 снижало амплитуду SOCE как при патоло гии, так и в контроле, а также оказывало нейропро текторный эффект при воздействии ингибитора про теасом MG132 [73]. В целом, проведенные исследования показывают, что нарушения SOCE носят систематический ха рактер и наблюдаются в различных клеточных мо делях БХ (рис. 5) [16, 73, 111]. Данный факт может говорить о том, что нарушения SOCE предшеству ют, по-видимому, иным патологическим процессам, происходящим при БХ и, возможно, являются одним из центральных механизмов, лежащих в основе ней родегенерации. Таким образом, SOCE можно считать перспективной мишенью для разработки подходов к терапии БХ, а полученные на различных клеточ ных моделях данные позволяют надеяться на созда ние лекарственного средства на основе соединения EVP4593. Предполагается, что увеличение SOCE влияет непосредственно на способность митохондрий за пасать Ca2+, так как митохондрии находятся в не посредственной близости от области выброса Ca2+ из ЭР [121]. Митохондрия является одним из глав ных регуляторов внутриклеточного уровня Ca2+. При значительном увеличении [Ca2+] в цитозоле в не посредственной близости от митохондрии происхо дит активация низкоаффинного митохондриального Ca2+-унипортера (MCU), опосредуя приток Ca2+ в ма трикс. Митохондрии высвобождают Ca2+ с помощью Na+/Ca2+-обменника [122] или, в случае перегрузки кальцием, через мегапоры (PTP), активация которых приводит к скачку мембранного потенциала, разрыву наружной мембраны и высвобождению цитохрома c и каспаз, следствием чего является апоптотическая гибель клетки [123, 124]. Вовлеченность митохондри альной дисфункции в патогенез БХ подтверждается, в частности, тем, что 3-нитропропионовая кислота, используемая в качестве ингибитора комплекса II дыхательной цепи митохондрий, вызывает нару шения, характерные для БХ [125]. Еще одно дока зательство важной роли митохондрий в патогенезе БХ - нейропротекторный эффект ингибиторов про ницаемости митохондриальной мембраны, показан ный как на клеточных, так и на животных моделях [99, 126]. При экспрессии mHtt обнаружены также дефек ты митохондриальной морфологии. В клеточной ли нии, полученной из knock-in мышиных эмбрионов, экспрессирующих mHtt с 111Q, митохондрии более склонны к фрагментации по причине того, что на рушение [Ca2+] в цитозоле способствует усилению активности кальций-зависимой фосфатазы - каль цинейрина, дефосфорилирующей (и таким образом активирующей) белок Drp1, ответственный за деле ние митохондрий. В конечном счете, усиленная фраг ментация митохондрий увеличивает склонность кле ток к апоптозу [106]. Нарушения забуферивания Ca2+ и кальцие вого обмена в митохондриях зарегистрированы как на ранних, так и на поздних стадиях БХ, что указывает на ключевую роль этих нарушений в пато генезе заболевания. Митохондрии, выделенные из клеток мозга пациентов с БХ и из клеток мышей, моделирующих БХ, более чувствительны к нагруз ке Ca2+ и склонны к образованию мегапор [127, 128]. Аналогичные результаты получены позднее на им мортализованной линии клеток-предшественников нейронов стриатума, полученной из knock-in мышей KI-HdhQ111 [129]. Тем не менее, восприимчивость ми тохондрий к кальциевой нагрузке воспроизводилась не во всех экспериментальных моделях. Например, стриатальные митохондрии, полученные из knock-in мышей, экспрессирующих различные вариан ты mHtt (80, 92 или 111Q), из мышей R6/2, а также из мышей YAC128 были одинаково, а в некоторых случаях даже менее восприимчивы к Ca2+-нагрузке, чем контрольные образцы дикого типа [130, 131]. Кроме того, чувствительность митохондрий к Ca2+ нагрузке в некоторых моделях БХ снижалась про порционально возрасту и длине polyQ-тракта [130], что предполагает наличие защитных компенсатор ных механизмов. Недавно проведенное изучение изо лированных митохондрий и стриатальных нейронов мышей R6/2 также выявило отсутствие дисфункции дыхательной цепи и повышенной чувствительности митохондрий к кальциевой нагрузке [132]. Таким об разом, роль митохондрий в патогенезе БХ остается дискуссионной, и необходимы дальнейшие исследо вания, направленные на выяснение молекулярных механизмов заболевания. ЗАКЛЮЧЕНИЕ Несмотря на длительную историю изучения БХ, проблемы манифестации, моделирования и изуче ния молекулярных основ заболевания остаются ак туальными. В данном обзоре рассмотрены клеточ ные и животные модели, широко используемые при изучении патологических процессов при БХ, а также для скрининга потенциальных лекарствен ных средств. Особый интерес представляют модели, основанные на эндогенной экспрессии мутантно го хантингтина в нейронах, дифференцированных из пациент-специфичных iPSC. Анализ современ ных публикаций позволяет сделать вывод о том, что нарушения кальциевой сигнализации являются одним из центральных звеньев, опосредующих раз витие патологии и приводящих к гибели нейронов. Один из важнейших сегментов кальциевой сигнали зации, нарушенный при БХ, - депо-управляемый вход кальция, патологическое увеличение которого показано на многих упомянутых в обзоре моделях. Вероятно, нарушение содержания кальция в ЭР вку пе с сопряженным избыточным депо-управляемым входом кальция через ПМ может оказывать влияние на митохондрии, которые начинают активировать процессы клеточной гибели, будучи не в силах депо нировать излишки кальция. Подводя итог, необходимо отметить, что изуче ние нейродегенерации является интенсивно раз вивающейся научной областью, что дает надежду на составление полной фундаментальной картины процессов нейродегенерации и разработку новых ле карственных средств, эффективных при таких за болеваниях, как БХ, болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона и другие патологии.

Об авторах

Ю. A. Колобкова

Email: evkazn@incras.ru
Россия

В. A. Вигонт

Email: evkazn@incras.ru
Россия

A. В. Шалыгин

Email: evkazn@incras.ru
Россия

E. В. Казначеева

Автор, ответственный за переписку.
Email: evkazn@incras.ru
Россия

Список литературы

Дополнительные файлы