Глутамилэндопептидазы: загадка субстратной специфичности

Полный текст

ГЛУТАМИЛЭНДОПЕПТИДАЗЫ - ЧЛЕНЫ СТРУКТУРНОГО СЕМЕЙСТВА ХИМОТРИПСИНА Глутамилэндопептидазы (ГЭПазы) - фермен ты, предпочтительно гидролизующие связи α-карбоксильных групп глутаминовой кислоты [1, 2]. К настоящему времени охарактеризованы ГЭПазы целого ряда грамположительных бактерий [3-22], а также (+)РНК-вирусов [23-25]. Все ГЭПазы вхо дят в структурное семейство химотрипсина - одно из самых обширных и хорошо изученных. Молекулы химотрипсиноподобных протеаз (ХПП) имеют общий принцип пространственной организации, так назы ваемый химотрипсиновый (или трипсиновый) фолд (рис. 1). Ключевым для определения места гидроли за субстрата ХПП является остаток в положении P1 (по номенклатуре Шехтера и Бергера: расщепляемая связь субстрата находится после остатка P1, кото рому соответствует S1-связывающий сайт фермен та [26]). Традиционно, как и в случае панкреатиче ских сериновых протеаз, ХПП, исходя из первичной субстратной специфичности, делят на три основные группы: 1) гидролизующие связи, образованные α-карбоксильными группами крупных гидрофобных аминокислотных остатков (химотрипсиноподобная специфичность); 2) расщепляющие связи после поло жительно заряженных остатков (трипсиноподобная специфичность) и 3) предпочитающие малые гидро фобные остатки в положении P1 (эластазоподобная специфичность) [27]. Кроме того, обнаружены ХПП со специфичностью смешанного типа. Например, коллагенолитические ферменты крабов сочетают специфичность трипсина, химотрипсина и эластазы [28], а дуоденаза крупного рогатого скота [29] и катеп син G [30] способны эффективно гидролизовать суб страты как трипсина, так и химотрипсина. Известны ХПП, расщепляющие связи преимущественно после остатка Gln, например, многие 3С-подобные протеа зы вирусов [23], а также специфичные к отрицатель но заряженным аминокислотным остаткам - гран зим B, предпочтительно гидролизующий связи после остатков Asp [31], и ГЭПазы, которым посвящен дан ный обзор. Молекулы ХПП состоят из двух перпендику лярных β-цилиндрических доменов и C-концевой α-спирали (рис. 1). Каталитический и субстратсвя зывающий сайты находятся в щели между двумя β-цилиндрами. Функционально существенные остатки локализованы преимущественно в петлях, соединяющих β-тяжи. S1-карман, расположенный рядом с каталитическим остатком Ser(Cys)195 (здесь и далее нумерация по химотрипсину), сформирован участками 189-192, 214-216 и 224-228. В большин стве случаев ключевыми детерминантами субстрат ной специфичности являются остатки в позициях 189, 216 и 226 [32, 33]. Причем у ферментов, узнаю щих заряженные остатки в положении P1, в позиции 189 (Asp у трипсина [34]) или 226 (Arg у гранзима B [35], Glu у катепсина G [36], Asp у коллагеназы кра ба [37] и дуоденазы [38]) находятся остатки-компен саторы заряда субстрата. Это позволяет полагать, что первичная субстратная специфичность ХПП кон тролируется относительно небольшим числом струк турных элементов сайта S1. Однако простой пере нос этих структурных элементов из одной молекулы в другую не приводит к «переключению» субстрат ной специфичности. Как показано на примере конверсии трипсина в химотрипсин, на специфичность влияет также целый набор удаленных структурных элементов, не взаимодействующих с субстратом непосред ственно. Сайты S1 обоих ферментов сходны. Однако замена главной детерминанты связывания заряжен ных субстратов трипсина Asp189 на Ser, характер ный для химотрипсина, не приводит к возникнове нию соответствующей специфичности. Вместо этого формируется низкоэффективная неспецифичная протеаза [39]. Создание химотрипсиноподобной специфичности требует замены четырех остатков в S1 кармане вместе с модификацией удаленных от S1 сайта областей: двух поверхностных петель, которые не контактируют с субстратом непосредственно [40], и остатка Tyr172 [41]. Сравнение кристаллических структур и кинетических характеристик получен ных вариантов со структурами и каталитическими свойствами химотрипсина и трипсина показывает, что дополнительные модификации существенны не для связывания собственно остатка P1, а для точ ного позиционирования расщепляемой связи относи тельно каталитического центра белка: пары Ser195- His57 и оксианионной впадины [40-43]. Таким образом, основываясь на данных о струк турных детерминантах субстратной специфичности ХПП, можно ожидать, что предпочтительный выбор ГЭПазами отрицательно заряженных аминокислот ных остатков в положении P1 определяется теми же участками полипептидной цепи, что и у других фер ментов группы. Причем ключевой структурной детер минантой специфичности, как у всех распознающих заряженные P1-остатки ХПП, должен быть локализо ванный в S1-кармане компенсатор заряда субстрата. В качестве кандидата на эту роль по аналогии мож но предложить остаток Arg или Lys в положении 189 или 226. В то же время следует помнить, что для высо коэффективного взаимодействия с P1-остатком суще ственна структура регионов, удаленных от S1. ГЛУТАМИЛЭНДОПЕПТИДАЗА STREPTOMYCES GRISEUS Первой ГЭПазой, пространственная структура ко торой была установлена, стала Glu-специфичная протеаза S. griseus (Glu-SGP) (PDB ID - 1hpg) [44]. Структура этого фермента в целом типична для ХПП (рис. 2A) и имеет наибольшее сходство с бакте риальными ХПП (протеазами А и В из Str. griseus и α-литической протеазой). Общая геометрия об ласти S1 также очень близка к геометрии этой об ласти у перечисленных бактериальных ферментов. Вопреки ожиданиям, в структуре S1-сайта не уда лось обнаружить явного компенсатора отрица тельного заряда субстрата - остатка Lys или Arg. Карбоксильная группа Glu в положении P1 субстрата формирует водородные связи с Ser190 (192 в нумера ции [44]), Ser216 и His213. Таким образом, эти остатки, вероятно, играют ключевую роль в узнавании субстрата. Боковая цепь гистидина способна нести положительный заряд. Однако, если считать, что pKa бокового радикала His213 в отсутствие субстрата равна 6.4, то при pH 8.5, оптимальном для функци онирования Glu-SGP, имидазольное кольцо будет протонировано менее чем на 1%, и, следовательно, гистидин должен быть нейтральным [44]. В то же время значение pKa аминокислотных остатков в бел ке может существенно варьировать в зависимости от окружения [45]. Анализ структуры Glu-SGP выявил в ней так на зываемую гистидиновую триаду, в состав которой, кроме His213, входят His199 и His228. Три остатка His пронизывают С-концевой β-цилиндрический до мен, формируя цепь водородных связей, соединя ющую карбоксильную группу Glu-P1 субстрата и, через связанные с ферментом две молекулы воды, N-концевой обвод С-концевой α-спирали молекулы (рис. 2Б). Постулировалось, что именно эта струк тура обеспечивает перенос положительного заряда, компенсирующего заряд субстрата, с микродиполя α-спирали на His213 субстратсвязывающей области [44]. Отметим, что у глутамилэндопептидаз остатки гистидиновой триады не консервативны [46] и, кроме Glu-SGP, обнаружены лишь у высокогомологичного фермента из Str. fradiae [13]. Роль остатков, формирующих S1-карман и ги стидиновую триаду Glu-SGP, была изучена с по мощью сайт-направленного мутагенеза. Любые модификации Ser190(192) (Ala/Gly/Asn/Thr/Val) и His213 (Ala/Gly/Lys/Asn/Arg/Ser/Val) приводят к прекращению автокаталитического процессинга (по связи Glu(-1)-Val1) предшественника ГЭПазы, что доказывает принципиальную роль этих остат ков в формировании S1-сайта. В то же время Ser216, по-видимому, менее важен, так как его замена на Ala или Gly не приводит к потере ферментом соответ ствующей активности. Похожий результат наблюда ется и при некоторых модификациях остатков гисти диновой триады: мутации His199→Val и His228→Ala/ Asp/Asn/Ser/Val не препятствуют процессингу фер мента. Все мутантные белки (His199→Val, Ser216→Ala, Ser216→Gly и His228→Ala), специфичность которых была исследована, сохраняли предпочтение к суб стратам с Glu-P1 [47]. Итак, гипотеза о важности ги стидиновой триады для компенсации заряда не была подтверждена экспериментально, и на ключевые роли в распознавании субстрата вышли остатки Ser190(192) и His213. Таким образом, с одной стороны, известна струк тура S1-сайта. С другой стороны, неясно, каким об разом формирующие этот сайт элементы могут обеспечивать наблюдаемую субстратную специфичность. Это противоречие становится еще более явным при рассмотрении данных о структуре и специфич ности вирусных 3C-подобных сериновых протеаз. ВИРУСНЫЕ 3С-ПОДОБНЫЕ СЕРИНОВЫЕ ПРОТЕАЗЫ Процессинг полибелков-предшественников являет ся важной частью жизненного цикла большинства (+)РНК-вирусов [48-50] и обычно осуществляется при участии вирусных папаиноподобных или химо трипсиноподобных протеаз, которые входят в состав полибелка [51]. Большинство XПП (+)РНК-вирусов это цистеиновые протеазы, например, 3С протеазы (3Cpro) пикорнавирусов или 3C-подобные проте азы (3CLpro) корона-, поти- или комовирусов [49]. В то же время обнаружены ферменты, активные центры которых содержат каталитический остаток серина. Такие белки обозначаются как 3C-подобные сериновые протеазы (3CLSP) [23]. XПП (+)РНК вирусов проявляют узкую субстратную специфич ность. Сайты гидролиза 3С и 3С-подобных проте аз в целом похожи и обычно содержат остаток Gln или Glu в позиции P1 в сочетании с расположенным за ним небольшим аминокислотным остатком (Gly, Ala или Ser) [23, 52]. При этом одни протеазы ги дролизуют связи, образованные как Gln, так и Glu [53-57]. Другие ферменты предпочитают Gln-P1 (на пример, 3Сpro и 3CLpro пикорна- и коронавирусов [23, 48]) или являются истинными ГЭПазами, расще пляющими полипептидную цепь после Glu. Такую специфичность проявляют ХПП артери- [23], собемо- [25] и астровирусов [24]. ГЭПазы артеривирусов, обозначаемые как Nsp4 (неструктурный белок 4) [23], являются сериновыми протеазами [58, 59]. К настоящему времени изучены свойства и установлены пространственные структу ры Nsp4 вируса артериита лошадей (EAV) и вируса репродуктивного и респираторного синдрома свиней (PRRSV). Пространственная структура EAV-Nsp4 в целом типична для ХПП (PDB ID - 1mbm). В то же время каталитический домен фермента, сформиро ванный двумя перпендикулярными β-цилиндрами, дополнен С-концевым расширением (рис. 3A) [60]. Структура PRRSV-Nsp4 (PDB ID - 3fan) сходна со структурой EAV-Nsp4, заметно отличаясь, од нако, взаимным расположением каталитического и С-концевого доменов (рис. 3Б) [59]. Организация S1-участков EAV-Nsp4 и Glu-SGP очень близка (рис. 4A). Карман S1 содержит те же три основных структурных элемента: His213 (134 в EAVNsp4, 1198 в полибелке), Thr190 (115, 1179), соответ ствующий Ser190 у Glu-SGP, и Ser216 (137, 1201) [60]. Все три остатка сохранены и в первичной структуре PRRSV-Nsp4 [58, 59]. Однако, судя по результатам рентгеноструктурного анализа, S1-сайт последнего фермента имеет иную, чем у EAV-Nsp4 и Glu-SGP, структуру (рис. 4Б). Положение участка полипептид ной цепи 190-194 (113-117 в PRRSV-Nsp4) изменено по сравнению с большинством ХПП, что приводит к нетипичной конфигурации оксианионной впадины и существенному удалению Thr190 (113) от карбок сильной группы Glu-P1. Кроме того, методом рентге ноструктурного анализа не удается определить поло жение содержащей Ser216 петли 216-220 (136-140), что свидетельствует о высокой подвижности этого участка. Расположение наиболее консервативного остатка S1-участка - His213 (133) в трех упомянутых белках не отличается [59]. Возможно, наблюдаемая картина не отражает состояние PRRSV-Nsp4 в рас творе, а представляет артефакт кристаллизации сво бодного фермента. Важность остатков His213 и Thr190 для функцио нирования EAV-Nsp4 подтверждена эксперимента ми по сайт-направленному мутагенезу. Путем моди фикации остатков каталитической триады показано, что процессинг полибелка с расщеплением связей после остатков Glu зависит от активности EAV-Nsp4. К полному прекращению процессинга приводили и модификации His213(1198)→Lys/Arg/Tyr. Тот же эффект вызывала замена Thr190(1179)→Asp, однако мутации Thr190(1179)→Ser/Gly лишь несколько сни жали эффективность процессинга [58]. В совокупно сти с данными, полученными на модели Glu-SGP, эти результаты показывают принципиальное значение His213 и существенно меньшую важность остатков в позициях 190 и 216 для гидролиза специфических субстратов ГЭПазами. В то же время остается неяс ным, является ли His213 ключевым элементом в рас познавании заряженного субстрата, а также какой вклад в формирование субстратной специфичности вносят Thr/Ser190 и Ser216. Помочь разобраться с некоторыми из этих вопросов может анализ струк тур других вирусных ГЭПаз. Протеаза вируса мозаики сесбании (SeMV-pro) имеет типичную для ХПП пространственную струк туру (PDB ID - 1zyo), которая ближе к структурам клеточных (в частности, Glu-SGP), а не вирусных представителей семейства (рис. 3B) [61]. Протеаза имеет классическую каталитическую триаду, мо дификация остатков которой приводит к прекра щению процессинга полибелка [62]. В структуре S1 участка фермента сохранены, как и у всех ГЭПаз, консервативные остатки His213(298) и Thr190(279). Однако позицию 216(301) занимает крупный гидро фобный остаток Phe (рис. 4B). Наложение простран ственных структур SeMV-pro и Glu-SGP в ком плексе с тетрапептидным продуктом протеолиза трет-бутилоксикарбонил-Ala-Ala-Pro-Glu (Boc- AAPE) показывает, что боковой радикал остатка Glu-P1 хорошо вписывается в S1-карман вирусной протеазы. Сохранение объема S1-кармана при на личии остатка с крупным боковым радикалом тре бует существенного смещения основной цепи белка на участке 214(299)-223(308) и заполнения образо вавшегося в результате этого смещения простран ства боковой цепью остатка Asn223(308), который участвует в формировании дна S1-кармана, но, по видимому, с Glu-P1 непосредственно не взаимодей ствует (рис. 4B). Эта ситуация показывает, что Ser в положении 216 и водородная связь остатка 216 с γ-карбоксильной группой Glu-P1 не принципи альны для обеспечения глутаматной специфично сти. К сожалению, экспериментов по модификации Phe216(301) в составе SeMV-pro не проводилось. В то же время замены His213(298) и Thr190(279) на Ala, но не мутация Asn223(308)→Ala, полностью по давляют процессинг in cis слитого белка SeMV-pro/ VPg (VPg - вирусный белок, который находится в по либелке за SeMV-pro) в модельной системе [61]. Субстратная специфичность протеазы астровиру са человека (HAstV-pro) мало изучена. Данные о сай тах процессинга вирусного полибелка, осуществля емого этим ферментом, противоречивы [63]. Вместе с тем, с использованием рекомбинантного фермента и набора синтетических субстратов in vitro показа но, что HAstV-pro гидролизует только связи, образо ванные α-карбоксильными группами Glu и Asp [24]. Пространственная структура HAstV-pro (PDB ID - 2w5e) в целом близка к структуре SeMV-pro (рис. 3Г), но имеет ряд специфических особенностей. Так, оста ток Asp102 (489 в полибелке) каталитической триады, в которую входят также Ser195(551) и His57(461), име ет неканоническую конформацию [24]. Структура участка S1 также заметно отличается от рассмотренных выше. Несмотря на то что оста ток His213 и его положение инвариантны, в пози ции 216 вместо Ser находится Asn216(569), амидная группа которого, как показывает наложение струк тур HAstV-pro и Glu-SGP в комплексе с лиган дом, практически занимает место γ-карбоксильной группы субстрата Glu-P1 (рис. 4Г). Это приводит к существенному уменьшению кармана S1 [24], объ ем которого не соответствует боковому радикалу Glu. Кроме того, конформация участка 189-193 (545-549) основной цепи иная, чем у большинства ХПП. Как следствие, консервативный остаток Thr190 удален от S1-сайта и развернут в сторону. (Положение участка 189-193 напоминает конфи гурацию этого региона в PRRSV-Nsp4.) Учитывая описанные отличия от структур других ГЭПаз и ХПП, сложно сделать какие-либо определенные выводы о взаимодействиях HAstV-pro с остатком P1 субстрата. Обобщая данные о вирусных ГЭПазах и Glu-SGP, можно заключить, что His213 является общим эле ментом S1-кармана, а его модификация во всех случаях приводит к инактивации ферментов. Этот остаток способен нести положительный заряд и по этому представляется кандидатом на роль ключевого структурного элемента, определяющего субстратные предпочтения Glu-специфичных протеаз. Остаток Thr/Ser190 также консервативен у всех ГЭПаз, од нако его модификация не приводит к потере фер ментами специфической активности, и, вероятно, он не играет принципиальной роли в распознавании остатка Glu-P1 субстрата. Наконец, природа остат ка 216 несущественна для обеспечения субстрат ной специфичности. Как следствие, в этой позиции у ГЭПаз обнаружены остатки, сильно отличающи еся по свойствам: Ser, Asn и Phe. Дополнительную информацию о структурных детерминантах суб стратной специфичности ГЭПаз может дать анализ вирусных 3С и 3С-подобных протеаз, проявляющих специфичность к Gln в положении P1. Сравнение первичных и пространственных струк тур ГЭПаз и 3С/3СLpro выявляет сходство их S1 участков (рис. 4Д,Е). Во-первых, все 3С/3СLpro, так же как и ГЭПазы, содержат консервативный остаток His213 [64-76], модификации которого при водят к инактивации ферментов [77-79]. Это по зволяет заключить, что данный остаток не явля ется ключевым элементом распознавания заряда субстрата, но принципиален для обеспечения кор ректной геометрии S1-сайта. Во-вторых, большин ство 3С/3СLpro сохраняют характерный для ГЭПаз остаток Thr/Ser190 [58], что подтверждает вывод о его важности для формирования правильной гео метрии S1-кармана, а не для распознавания заряда. На месте третьего элемента S1-участка ГЭПаз, в по ложении 216, у 3С/3СLpro, как правило, находятся остатки Gly (рис. 4Е) и иногда Ala (рис. 4Д), которые не встречаются у известных ГЭПаз. Последнее ста ло основанием для рассуждений об участии Ser216 в компенсации заряда субстрата у ГЭПаз [60]. Однако мутагенез на модели Glu-SGP показывает, что за мены Ser216→Ala/Gly не делают субстраты с Gln-P1 предпочтительными, хотя и увеличивают эффек тивность их гидролиза [47]. Кроме того, обсуждав шиеся данные о ГЭПазах с остатками Phe/Asn216 также не свидетельствуют в пользу подобных пред положений. Следует упомянуть еще об одной ги потезе, которая до сих пор остается непроверен ной. Поскольку все ГЭПазы являются сериновыми, а Gln-специфичные ферменты - цистеиновыми про теазами, можно предположить, что различие в их субстратной специфичности определяется катали тическими остатками. Итак, ни один из обнаруженных консервативных структурных элементов S1 участка Glu-SGP и ви русных 3CLSP, по-видимому, не определяет предпо чтения этих ферментов к остатку Glu в положении P1 субстрата. Следовательно, такая специфичность ГЭПаз вирусов и стрептомицетов обеспечивается структурными детерминантами, не находящимися непосредственно в субстратсвязывающей области. Однако традиционный путь исследований, сочета ющий анализ пространственных структур, сайт направленный мутагенез и изучение каталитических свойств ферментов, до настоящего времени не позво лил выявить эти детерминанты. Более успешными кажутся исследования ГЭПаз бактерий. ЭПИДЕРМОЛИТИЧЕСКИЕ ТОКСИНЫ СТАФИЛОКОККОВ Стафилококки продуцируют два типа ГЭПаз: фер менты, сходные с протеазой V8 Staphylococcus aureus (Glu-V8), о которых пойдет речь в следующем разделе, и эпидермолитические токсины (ET). ЕТ являются основными факторами вирулентности, от вечающими за развитие буллезного импетиго и его генерализованной формы - стафилококкового син дрома ошпаренной кожи, а также сходных заболе ваний животных [80, 81]. Биологическая активность ET связана с их способностью с высокой специфич ностью гидролизовать связь Glu381-Gly в десмогле ине 1 - десмосомальном белке кадгенинового типа, обеспечивающем межклеточные взаимодействия (более подробно см. обзор [80]). Кроме того, in vitro ET расщепляют эфирные связи, образованные кар боксильными группами остатков Glu [82]. Пространственные структуры эпидермолитиче ских токсинов A [83, 84] и B [85] из S. aureus указы вают на принадлежность ET к ХПП (рис. 5). В то же время эти белки обладают уникальными особен ностями. Первая из них - N-концевая α-спираль. Вторая - необычное положение остатков, формиру ющих оксианионную впадину: пептидная связь Pro/ Val192-Gly193 (нумерация по химотрипсину) раз вернута на 180° по сравнению с другими ХПП. Это приводит к формированию водородной связи между карбонильным кислородом остатка 192 и гидрокси лом каталитического Ser195, что, по-видимому, пре пятствует проявлению активности. На основе анализа структур высказано предположение, что связывание ET с субстратом (или рецептором), в которое вовле чена N-концевая α-спираль, приводит к перестройке активного центра и активации ферментов [83]. Как у всех обсуждавшихся выше ГЭПаз, S1 карманы ET содержат три ключевых элемента, два из которых - консервативные остатки His213 и Thr190 (рис. 6). Третьим, как предсказано ранее на основе моделирования пространственных струк тур [46], является идеально подходящий на роль ком пенсатора отрицательного заряда Glu-P1 остаток Lys в позиции 216, где у других ГЭПаз обычно находит ся Ser. Остаток Lys консервативен у большинства ET S. aureus и S. hyicus, а у ExhA (ET из S. hyicus) в положении 216 обнаружен Arg [86, 87]. Важность Lys216 для гидролиза субстратов с остатком Glu под тверждена экспериментами по сайт-направленному мутагенезу, выполненными на модели ETA [88]. Любая из замен Lys216→Ala/Glu/Thr аналогично мутациям по остаткам каталитической триады при водила к потере белком способности гидролизовать α-фениловый эфир N-Boc-L-глутаминовой кислоты и утрате эпидермолитической активности. Итак, в случае ET положительно заряженный остаток, вероятный компенсатор заряда субстрата, удается обнаружить непосредственно в S1-участке, причем в положении 216, важном для распознавания субстрата всеми ХПП. Этот компенсатор принципиа лен для проявления ET ферментативной активности. В то же время прямые доказательства того, что Lys/ Arg216 у ET отвечает за глутаматную специфич ность, в настоящее время отсутствуют. При этом S1-сайты ET, за исключением Lys216, очень похожи на соответствующие области ГЭПаз вирусов и стреп томицетов (рис. 6). Однако приведенные выше дан ные указывают на то, что остаток в положении 216 не существен для обеспечения субстратной специ фичности этих ферментов. Тогда следует заключить, что разные группы ГЭПаз имеют разные механизмы распознавания субстрата. У ET ключевым являет ся стандартный компенсатор заряда в S1-кармане, у ферментов вирусов и стрептомицетов - какой-то другой удаленный структурный элемент. Такой вы вод подкрепляется данными, полученными для дру гих бактериальных ГЭПаз. ДРУГИЕ БАКТЕРИАЛЬНЫЕ ГЛУТАМИЛЭНДОПЕПТИДАЗЫ Кроме ГЭПаз стрептомицетов и ET охарактеризо ван целый ряд протеаз, секретируемых грамполо жительными бактериями и обладающих общими структурными особенностями. Проведенное на ран них этапах изучения ГЭПаз моделирование про странственных структур относящихся к этой груп пе Glu-V8, ГЭПаз Bacillus licheniformis и B. subtilis привело к предположению, что компенсацию за ряда субстрата у всех трех белков обеспечивает α-аминогруппа остатка в положении 1 зрелого фермента [46]. Сегодня локализация N-концевого остатка в S1-участке ГЭПаз этой группы подтверждена экс периментальными данными о третичных структу рах ГЭПазы B. intermedius (BIGEP) [89], Glu-V8 [90] и внеклеточной сериновой протеазы S. epidermidis (Esp) [91]. Обсуждаемые белки обладают высоким струк турным сходством между собой, а также с ET ста филококков, и имеют типичное для ХПП строение. Их молекулы состоят из двух β-доменов, разде ленных глубокой щелью, в которой расположен ак тивный центр (рис. 7). Участки S1 у Glu-V8, BIGEP и Esp в целом организованы сходно с аналогичными регионами других ГЭПаз и содержат обязательные элементы: His213 и Ser/Thr190 (рис. 8А,Б). В то же время в третьей ключевой позиции S1-кармана на ходится остаток Gly, что, как обсуждалось выше, является особенностью вирусных Gln-специфичных 3С- и 3CLpro. Однако отсутствие бокового радикала, способного формировать водородную связь с кисло родом карбоксильной группы субстрата, у остатка в позиции 216 компенсируется, как и было предска зано, α-аминогруппой Val1, которая занимает место, соответствующее положению ε-аминогруппы остат ка Lys216 у ET (рис. 8В). Таким образом, в случае Glu-V8, BIGEP и Esp, по-видимому, наблюдается уникальная ситуация, когда специфичность проте азы определяется N-концом полипептидной цепи. Своеобразие такого «конструктивного решения» состоит в том, что Glu-V8, BIGEP и Esp синтезиру ются клеткой в виде предшественников, включаю щих, кроме каталитической части, сигнальный пеп тид и пропептид. Следовательно, N-конец зрелого белка, а значит, и S1-карман формируются только после процессинга. Эта ситуация напоминает меха низм активации ХПП млекопитающих: после уда ления пропептида N-концевая NH2-группа зрелого белка образует солевой мостик с остатком Asp194, что индуцирует структурные перестройки молекулы фермента, приводящие к его активации благодаря формированию корректной структуры S1-участка и оксианионной впадины [92-96]. Направленная модификация остатков S1-участков BIGEP и Glu-V8 дала очень интересные результа ты. Прежде всего, был впервые исследован вариант ГЭПазы с модификацией остатка His213. (Подобные мутации вводили и ранее [47, 58], но получить белки не удалось.) Показано, что BIGEP с заменой His213 (186 в BIGEP) на Thr не изменяет субстратных пред почтений и гидролизует белковый субстрат только после остатков Glu. В то же время модификация су щественно влияет на эффективность катализа (kcat снижается более чем в 600 раз), но при этом относи тельно мало сказывается на связывании субстрата (KM возрастает примерно в 5 раз) [97]. Интересно, что подобный эффект наблюдается в случае гидро лиза нативными ГЭПазами субстратов, содержащих остаток Asp в положении P1: KM растет примерно в 6 раз, а падение kcat имеет тот же порядок (~150 раз) [98]. Полученные результаты позволяют заключить, что консервативный остаток His213 не является ключевым элементом, определяющим распознава ние отрицательного заряда субстрата ГЭПазами, но, по-видимому, существен для точного позициониро вания расщепляемой связи относительно нуклеофи ла - кислорода гидроксильной группы Ser195. Этот вывод хорошо согласуется с тем, что His213 являет ся общим структурным элементом для Glu- и Gln специфичных протеаз. Данные о роли N-концевого остатка в функци онировании ГЭПаз получены на модели Glu-V8. Показано, что замена N-концевого Val на Leu/Ala/ Phe/Gly/Ser приводит к снижению эффективности гидролиза субстратов c остатком Glu в примерно 3, 20, 50, 100 и 200 раз соответственно [9, 99], и чем ближе остаток по своим свойствам к Val, тем мень ше снижение активности. Этот результат свидетель ствует о важности остатка 1 для функционирования фермента и может быть объяснен различным от клонением положения α-аминогруппы этого остат ка у мутантов от оптимального. Кроме того, удалось получить варианты Glu-V8 с дополнительными ами нокислотными остатками, фрагментами пропепти да, на N-конце. Введение дополнительных остатков (от 1 до 39) во всех случаях приводило к значитель ному падению активности фермента при гидролизе субстратов с Glu-P1 [9, 100], но в меньшей степени влияло на эффективность гидролиза аналогичных субстратов с Gln-P1. При этом мутанты сохраняли предпочтение к субстратам с Glu-P1, которые они гидролизовали примерно в 10-20 раз эффектив нее [100]. Таким образом, вероятно, α-аминогруппа N-концевого остатка Val вносит очень существенный вклад в узнавание заряженного субстрата обсужда емыми бактериальными ГЭПазами, но не определяет специфичность ферментов полностью. Обобщая всю имеющуюся информацию о ГЭПазах, можно сделать вывод о различиях в механизмах распознавания заряженного субстрата ферментами разных групп. Вероятно, это свидетельствует о том, что на эволюционном древе ХПП ветви ГЭПаз воз никали несколько раз, возможно, на основе базовой структуры S1-кармана, одинаково хорошо подхо дящей для реализации как глутаматной, так и глу таминовой специфичности, и наиболее близкой, по-видимому, к структуре S1-областей вирусных ферментов. Необходимость реализации нескольких структурных вариантов оптимизации специфично сти очевидно должна быть обусловлена отличиями в функционировании протеаз, относящихся к разным группам. Анализ опубликованных данных о ГЭПазах позволяет обнаружить, что вариации в структуре S1 участков этих ферментов коррелируют с различия ми в механизмах созревания их предшественников. Такое наблюдение позволяет выдвинуть гипотезу о том, что способ компенсации заряда диктуется пу тем созревания белка-предшественника. СТРУКТУРНЫЕ ДЕТЕРМИНАНТЫ СУБСТРАТНОЙ СПЕЦИФИЧНОСТИ И СОЗРЕВАНИЕ ПРЕДШЕСТВЕННИКОВ ГЛУТАМИЛЭНДОПЕПТИДАЗ Все ГЭПазы синтезируются в виде предшествен ников. Однако механизмы процессинга фермен тов существенно различаются и могут быть раз делены на три группы. ГЭПазы стрептомицетов и вирусов процессируются автокаталитически [47, 51]. Предшественники ET содержат только секре торный лидер [3] и, следовательно, процессируются сигнальной пептидазой. В случае же бактериальных ГЭПаз, подобных Glu-V8 и BIGEP, удаление про пептида, за единственным исключением [21], осу ществляется различными протеазами гетероката литически [22, 100-104]. Сопоставление структур S1-участков ГЭПаз и механизмов процессинга пока зывает, что у автоактивирующихся ферментов в S1 кармане не удается обнаружить явного компенсатора заряда субстрата, для S1-участка ET характерно на личие остатка Lys216, а для ГЭПаз, сходных с Glu-V8 и процессирующихся гетерокаталитически, - α-аминогруппы N-концевого остатка. Рассмотрим эти соответствия с точки зрения биологических функций протеаз каждой группы. Вирусные ГЭПазы синтезируются как часть протяженного полибелка, селективный гидро лиз которого является основной функцией данных ферментов [25, 51, 105, 106]. Таким образом, вирус ные ГЭПазы функционируют внутри клетки, на чиная действовать сразу после синтеза полибелка. Следовательно, активный центр фермента, вклю чая определяющие специфичность участки, должен быть сформирован и способен осуществлять высо коспецифический гидролиз уже в составе полибел ка-предшественника, сохраняя структуру после процессинга. Функционирование ГЭПаз стрептоми цетов кажется существенно иным. Эти внеклеточные ферменты синтезируются как классические пред шественники протеаз, содержащие препропептид. Функции пропоследовательностей ГЭПаз стрепто мицетов не установлены, однако по аналогии с близ кородственной протеазой B из Str. griseus [107, 108] можно полагать, что пропептиды обеспечивают кине тическую стабильность зрелых молекул и участвуют в их секреции. В то же время автокаталитический процессинг и отсутствие видимой регуляции актив ности на посттрансляционном уровне делают ситуа цию сходной с описанной для вирусных ферментов: активный центр должен быть полностью сформиро ван в составе предшественника и сохраняться неиз менным после образования зрелой молекулы. Эта задача в обоих случаях, по-видимому, имеет одно структурное решение (рис. 4). В S1-кармане нет пря мого компенсатора заряда. N-Конец удален от актив ного центра в зрелом белке и, следовательно, не уча ствует в формировании S1-участка, так как вовлечен в процессинг. Не установленные до настоящего вре мени структурные элементы, отвечающие за глу таматную специфичность, локализованы вне S1 области и, вероятно, формируются до процессинга предшественника. Таким образом, изменяющиеся в ходе созревания элементы структуры не участву ют в образовании значимых для катализа регионов молекулы. Противоположная ситуация наблюдается в случае синтезируемых в виде препробелков ГЭПаз, подоб ных Glu-V8. Эти протеазы не только подвергаются гетероактивации [101-103, 109], но и, как показано на примере Glu-V8, вовлечены в регуляторные ак тивационные каскады [110-112]. Это предполагает строгий контроль активности, который реализует ся достаточно сложным и в чем-то противоречи вым способом. На первый взгляд, предшественни ки Glu-V8, BIGEP и Esp должны быть неактивны, поскольку S1-участок у этих белков формируется только в зрелой молекуле (рис. 7 и 8). В то же вре мя опубликованы данные, которые показывают, что предшественники Glu-V8 [113], BIGEP [109], Esp [7], а также ГЭПаз B. licheniformis [114], B. subtilis [102] и Thermoactinomyces sp. [21] способны к ав топроцессингу, причем в большинстве случаев ги дролизу подвергаются связи, соответствующие специфичности зрелых ферментов [7, 21, 109, 114]. Кроме того, обнаружена глутаматная активность in trans аналогов предшественников [100]. Эти факты ставят под сомнение саму возможность управления активностью обсуждаемых протеаз, однако внима тельный анализ пути активации предшественников показывает, что ситуация более сложная. Автопроцессинг, возможно внутримолекуляр ный, нативных ферментов, проходящий спонтан но как in vitro, так и in vivo, приводит не к полному удалению пропоследовательности, а к формирова нию форм белков с «обрезками» пропептидов (обыч но протяженностью 3-15 аминокислотных остат ков) [7, 100, 109, 113, 114], т.е. соответствующих по размеру пропептидам ХПП млекопитающих. Эти формы не проявляют активности по отноше нию к белковым субстратам (а также малоактив ны по отношению к пептидам) in trans и могут быть активированы только гетерокаталитически [7, 100, 109, 113, 114]. (Для полноты картины следует отме тить, что недавно опубликованы данные о ферменте Thermoactinomyces sp. с остатком Glu в положении -1, который способен к автоактивации в гетерологич ной экспрессионной системе in vitro [21], как и полу ченные ранее искусственно мутанты других ГЭПаз [109, 114].) Таким образом, созревание ферментов, сходных с Glu-V8, происходит ступенчато. По видимому, эти белки содержат как бы два пропеп тида. Первый, протяженный фолдинг-ассистент [99, 109], обеспечивающий кинетическую стабильность зрелого белка, как это часто бывает у бактериальных протеаз [115]. Второй - короткий, формирующийся после первого акта процессинга, - активационный модуль [109, 113, 114], поддерживающий фермент в неактивном состоянии. Нельзя исключить также, что структура активного центра протеаз меняется после удаления первой части пропептида. Можно сказать, что пропептиды ГЭПаз описываемой груп пы одновременно сочетают в себе свойства, типичные для пропептидов бактериальных ХПП и ферментов млекопитающих. Таким образом, необходимость строгого контроля активности ферментов, подобных Glu-V8, обеспечивается за счет формирования пол ноценного S1-кармана только после удаления про пептида. Для этого используется механизм, сходный с механизмом активации ХПП млекопитающих, - участие N-концевой аминогруппы в структуре суще ственных для катализа элементов молекулы. Но уда ление фолдинг-ассистента при этом происходит автокаталитически за счет базовой специфичности ферментов. ET стафилококков представляют собой промежу точный вариант. С одной стороны, их предшествен ники процессируются гетерокаталитически. С другой стороны, процессинг не связан с регуляцией актив ности, поскольку заключается лишь в удалении сиг нального пептида. Таким образом, формирование функционально активного фермента до процессинга, как и строгий контроль активности, очевидно, не яв ляются необходимыми. Здесь, по-видимому, подо шел бы вариант, реализованный у ГЭПаз вирусов и стрептомицетов. Однако филогенетический ана лиз показывает, что ET с наибольшей вероятностью представляют собой паралоги Glu-V8 (рис. 9, см. об суждение ниже), т.е. эти белки «созданы» на одной базе с Glu-V8 и, по существу, используют ту же схему строения S1-участка (рис. 8). В то же время, в отличие от Glu-V8, ET не содержат пропептидов, что указывает на иной путь сворачивания [115], и имеют значительно более узкую специфичность. Они неактивны по отношению к большинству бел ков и пептидов, что достигается, возможно, за счет введения остатка Lys216 и уменьшения объема S1 кармана, а также за счет необычной конформации оксианионной впадины [83]. В контексте нашего обсуждения интерес но было бы проследить филогению ГЭПаз. Единственную опубликованную попытку филогене тического анализа ферментов этой группы мы об наружили в работе, вышедшей в свет 20 лет назад [46]. Поэтому в рамках данного обзора на основе сравнения последовательностей охарактеризован ных ГЭПаз и некоторых ХПП с другой специфич ностью мы построили филогенетическое дерево, которое представлено на рис. 9. Первое, что хочется отметить вслед за авторами работы [46], - складыва ется впечатление, что ГЭПазы возникали на эволю ционном древе ХПП по меньшей мере 2 раза. На это указывает наличие двух удаленных ветвей бакте риальных ГЭПаз, одна из которых включает белки, сходные с Glu-V8 и ET, а другая соответствует фер ментам стрептомицетов. (Судить об эволюционном положении вирусных протеаз сложно, поскольку топология полученного дерева в части, касающейся этих белков, недостоверна.) Особенно показательно, что ГЭПазы стрептомицетов представляют собой лишь небольшой побег на ветви бактериальных про теаз с широкой специфичностью. Это наблюдение по зволяет предположить, что вероятность реализации глутаматной специфичности (как, впрочем, и любой другой) на базе химотрипсинового фолда достаточно велика. По-видимому, для этого достаточно модифи кации ключевых остатков S1-кармана (His213, Thr/ Ser190), обеспечивающих необходимую геометрию и минимальные взаимодействия для связывания остатков Glu/Gln. Однако такая базовая специфич ность, вероятно, требует «усиления», которое может быть достигнуто разными путями, в частности, вве дением компенсатора в S1-сайт, но эта возможность, как показывает анализ ферментов вирусов и стреп томицетов, не единственная. Ветвь, объединяющую все бактериальные ГЭПазы, кроме ферментов стреп томицетов, следует рассмотреть отдельно. Топология этой ветви ожидаемо соответствует таксономии бак терий-продуцентов. При этом ET и ферменты стафи лококков, подобные Glu-V8, локализуются на одной общей ветви, т.е. они структурно ближе друг к другу, чем к остальным бактериальным ГЭПазам. ЗАКЛЮЧЕНИЕ Проведенный нами анализ показывает, что все из вестные ГЭПазы относятся к структурному семей ству химотрипсина и имеют в целом сходное стро ение S1-субстратсвязывающего участка. При этом у ферментов этой группы существует несколько раз ных систем компенсации заряда субстрата. Отличия в механизмах распознавания отрицательного заря да коррелируют с различиями в архитектуре и пу тях процессинга предшественников, что, вероятно, определяется биологическими функциями соответ ствующих протеаз. Все это позволяет предположить, что ГЭПазы возникли на эволюционном древе ХПП, по крайней мере, дважды. В то же время мы вынуж дены констатировать, что имеющаяся в настоящее время информация о структуре и механизмах дей ствия ГЭПаз не позволяет до конца справиться с за гадкой их строгой субстратной специфичности. Следует подчеркнуть, однако, что сегодня центр тяжести исследований ГЭПаз смещается от из учения собственно ферментов к анализу их био логических функций, как правило, в связи с пато генезом. Так, например, активно изучают участие ГЭПаз стафилококков в регуляции роста биопленок, что определяется, в первую очередь, надеждами на обнаружение новых средств борьбы со стафи лококковой инфекцией [116]. Интенсивно ведутся работы по изучению вирусных ГЭПаз, что связано с попытками создания эффективных противовирус ных препаратов. При этом ГЭПазы обычно не выде ляют из всего пула 3С-подобных протеаз в поисках универсальных ингибиторов процессинга вирусных полибелков. Инженерия ингибиторов требует экс тенсивного изучения белок-лигандных взаимодей ствий, что влечет за собой получение большого объ ема структурных данных (см., например, [76, 117]). Не прекращается изучение роли ГЭПаз в жизненном цикле вирусов [24, 118]. Отдельно следует отметить появление работ, посвященных изучению вирус ных 3С и 3С-подобных протеаз, в том числе и ГЭПаз, в качестве индукторов программируемой клеточной гибели [119-122]. Несомненно, исследования ГЭПаз в медицинском контексте будут активно продол жаться. При этом важно подчеркнуть, что, посколь ку строгая субстратная специфичность является ос новой биологического действия ГЭПаз, в ходе таких исследований неизбежно будут получены новые дан ные, касающиеся ее структурных детерминант.

Об авторах

И. В. Демидюк

Автор, ответственный за переписку.
Email: duk@img.ras.ru
Россия

K. Н. Чухонцева

Email: duk@img.ras.ru
Россия

С. В. Костров

Email: duk@img.ras.ru
Россия

Список литературы

Дополнительные файлы