На стыке трех нуклеиновых кислот: роль РНК-связывающих белков и поли(АDP-рибозы) в репарации ДНК

Полный текст

ВВЕДЕНИЕ ДНК, РНК и поли(АDP-рибоза) (PAR) - три важней ших нуклеиновых кислоты клетки, функциониро вание которых тесно сопряжено и осуществляется при участии специализированных белков-посредни ков. Некоторые из ДНК-, РНК- и PAR-связывающих белков способны взаимодействовать сразу с несколь кими типами полимеров. Как правило, такие белки содержат функционально неупорядоченные элемен ты, позволяющие им подстраиваться под структуру определенного лиганда. В настоящем обзоре мы по старались обобщить современные представления о взаимосвязях трех нуклеиновых кислот, реали зуемых с участием мультифункциональных белков клетки. В качестве одного из примеров таких белков рассмотрен Y-бокс-связывающий белок 1 (YB-1). ИНТЕРФЕРЕНЦИЯ ТРАНСКРИПЦИИ И РЕПАРАЦИИ ДНК Сопряженность систем репарации ДНК и метаболиз ма РНК в клетке наглядно показывает процесс эксци зионной репарации оснований ДНК (BER), поскольку многие участники этого пути исправления повреж дений ДНК, включая белки APE1, SMUG1 и PARP1, вовлечены также в метаболизм РНК [1]. Очевидно, что транскрипционные факторы могут принимать опосредованное участие в репарации ДНК, контро лируя экспрессию генов ферментов репарации [2]. Однако возможно и обратное: некоторые факторы ре парации ДНК способны действовать как коактивато ры транскрипции [3]. Например, вовлеченная в BER тимин-ДНК-гликозилаза (TDG) может стимулировать транскрипцию некоторых генов, привлекая коактива торы [4]. Этот фермент осуществляет динамическое деметилирование ДНК в промоторах молчащих генов и генов, включающихся на конкретном этапе разви тия, а также в энхансерах активных генов для быстро го транскрипционного ответа [5, 6]. Как правило, репарация и транскрипция ДНК не происходят одновременно, по крайней мере, это справедливо для постоянно экспрессируемых ге нов домашнего хозяйства. Некоторые объемные по вреждения, блокируя движение РНК-полимеразы II, индуцируют систему эксцизионной репарации ну клеотидов (NER) (этот путь репарации называется репарацией, сопряженной с транскрипцией, или TCNER) [7]. Мутагенный потенциал других поврежде ний ДНК минимизируется за счет ингибирования транскрипции вблизи повреждения - например, по давление экспрессии генов наблюдается в процессе репарации окислительных повреждений ДНК систе мой BER [8]. Для активации экспрессии генов, связанных с развитием, и генов, экспрессия которых индуци руется внешним воздействием, напротив, требуется временное повреждение ДНК в промоторе, которое необходимо репарировать [3]. Важным механиз мом регуляции экспрессии таких генов служат па узы транскрипции, вызванные остановкой РНК полимеразы II в проксимальной области промотора [9]. При этом происходит инициация транскрипции, но элонгация останавливается на ранних этапах [10]. Для снятия «паузирования» РНК-полимеразы и элонгации транскрипции служат белки репара ции ДНК и факторы ремоделирования хроматина. Например, эстрогеновый рецептор активизирует лизин-специфичную деметилазу 1 (LSD1), демети лирующую гистон H3. В ходе этого окислительного процесса образуется пероксид водорода, превра щающий близко расположенные гуанины в ДНК в 8-оксогуанин (8-oxoG) [11]. При репарации 8-oxoG ДНК-гликозилазами формируются одноцепочеч ные разрывы ДНК, на которых начинают действо вать ДНК-эндонуклеазы, в том числе топоизомера за TopoIIβ [12]. При экспрессии протяженных генов TopoII вносит разрывы в молекулу ДНК не толь ко в промоторах, но и в кодирующих участках ге нов, поддерживая элонгацию транскрипции [13]. Показано, что ингибирование топоизомераз снижа ет экспрессию протяженных генов у дрожжей [14, 15]. Считается, что образующиеся двухцепочечные разрывы релаксируют ДНК и способствуют при влечению сенсоров повреждений и факторов репа рации (таких, как PARP1 и ДНК-протеинкиназы), что приводит к формированию оптимальной для ак тивации транскрипции архитектуры хроматина [12]. Так, у человека разрывы ДНК и соответствующая им передача сигнала о повреждении ДНК необходимы для снятия паузы для РНК-полимеразы II с после дующей элонгацией транскрипции генов, экспрессия которых индуцируется внешним воздействием [16]. Среди факторов ремоделирования хроматина, регу лирующих паузы РНК-полимеразы II, идентифици рован фермент поли(АDP-рибозо) (PAR) полимераза 1 (PARP1). Считается, что PARP1 способствует элон гации транскрипции за счет PAR-опосредованной разборки нуклеосом [17]. Однако индуцируемый раз рывами ДНК процесс поли(АDP-рибоз)илирования вблизи промоторов генов необходим, вероятно, также для привлечения РНК-связывающих белков, важ ных для посадки РНК-полимеразы II. Интересно, что для активации репарации может использоваться образование РНК-транскрипта в сайте повреждения ДНК. Показано, что спонтанно возникающие двухцепочечные разрывы ДНК инду цируют эктопическую транскрипцию, в результате которой синтезируются короткие некодирующие РНК (DSB-induced small RNAs, diRNAs) размером ~21 нуклеотид [18]. Предполагается, что diRNAs привлекают ферменты репарации двухцепочечных разрывов ДНК к сайтам повреждений, тем самым способствуя репарации [18]. Более того, недавно по явились данные, указывающие на возможность поли(АDP-рибоз)илирования ферментами PARP1 и PARP2 концов разрывов ДНК [19]. Не исключено, что этот процесс может вносить вклад как в ремоде лирование хроматина, так и в репарацию ДНК [19]. Наконец, некоторые факторы транскрипции спо собны напрямую участвовать в репарации ДНК [20]. Предполагается, что в основе этого феномена лежит способность факторов транскрипции индуцировать локальную перестройку хроматина, стимулируя репарацию вблизи распознаваемых ими последова тельностей в ДНК [21]. Таким образом, факторы транскрипции способны обеспечивать дополнительный уровень стабильно сти генома. В разных тканях организма преобладают разные источники повреждений ДНК: высокий уро вень метаболизма кислорода в нейронах приводит к образованию большого количества окислительных повреждений в ДНК, в то время как в клетках кожи повышен уровень повреждений ДНК, индуцирован ных УФ-светом [20]. Поскольку факторы транскрип ции регулируются внеклеточными воздействиями и стресс-зависимыми сигнальными системами, они могут способствовать дополнительной защите ДНК клеток определенного типа [20]. В клетках, ввиду ге терогенности репарации в геноме (существует гра диент эффективности репарации транскрибируемой цепи ДНК, при этом репарация вблизи 5’-конца идет быстрее, а к 3’-концу замедляется), факторы транс крипции способны обеспечивать дополнительный уровень защиты целостности ДНК ключевых про моторных и энхансерных элементов регулируемых ими генов [22]. «РНК-ОПЕРОНЫ» ЭУКАРИОТ В 1961 г. Ф. Жакоб и Ж. Моно предложили модель оперона, согласно которой в геноме бактерий гены функционально взаимосвязанных структурных бел ков расположены последовательно в одном участке ДНК. Согласованная экспрессия этих генов приводит к синтезу полицистронной мРНК, при трансляции которой все компоненты мультибелкового ансамбля образуются одновременно и в непосредственной бли зости друг от друга, что способствует быстрой сборке функциональных структур. Позже анализ рибосом ного профиля экспрессии генов в геноме Escherichia coli подтвердил эту гипотезу, показав, что компо ненты функциональных ансамблей синтезируются в точном соотношении согласно стехиометрии фи нального комплекса [23]. В геномах эукариот ДНК-опероны встречаются редко, и мРНК по большей части моноцистронны. Отказ от ДНК-оперонов у высших организмов мо жет быть связан как с полярным эффектом нонсенс мутаций, так и со сложностью регуляции синтеза мультифункциональных белков, содержание кото рых в протеомах эукариот значительно выше, чем у прокариот [24]. Поэтому координация экспрессии генов у эукариот частично осуществляется на пост транскрипционном уровне, когда мРНК, кодирующие функционально сопряженные белки, объединяют ся в РНК-опероны (рис. 1), тем самым приобретая схожую организацию и направленность [25]. Главной структурно-функциональной единицей этого про цесса являются многочисленные РНК-связывающие белки (RBP), которые распознают мотивы РНК и формируют рибонуклеопротеиновые (RNP) ком плексы [26]. RNP-комплексы являются структур ным выражением РНК-оперонов, позволяя функци онально сопряженным белкам, кодируемым разными мРНК, транслироваться синхронно в пределах одного цитоплазматического локуса [27]. Функционирование RNP-комплексов как независимых от окружения ди намических компартментов клетки обеспечивается по механизму так называемого «разделения жидко стей» (liquid demixing) [28-37], ключевую роль в ко торых играют неупорядоченные последовательности РНК-связывающих белков. НОВЫЕ ФУНКЦИИ РНК-СВЯЗЫВАЮЩИХ БЕЛКОВ В ОТВЕТЕ КЛЕТКИ НА ПОВРЕЖДЕНИЕ ДНК В современных работах РНК-связывающие белки рассматриваются как важнейшие участники поддер жания стабильности генома [38]. Наличие в ДНК повреждений приводит к по давлению экспрессии генов на разных уровнях. На самом первом уровне происходят ингибирова ние транскрипции и репрессия процессинга 3’-кон цов пре-мРНК [39, 40]. Далее снижение экспрессии функциональных продуктов многих генов осущест вляется в результате переключения альтернатив ного сплайсинга пре-мРНК этих генов на варианты, содержащие преждевременные стоп-кодоны, и сле довательно, подверженные нонсенс-опосредованной деградации мРНК [41, 42]. Наконец, повреждение ДНК приводит к уменьшению стабильности многих мРНК [43] и ингибированию трансляции [44, 45]. Однако, несмотря на общее снижение уровня экспрессии, существуют специальные механиз мы, обеспечивающие достаточную экспрессию ге нов, продукты которых вовлечены в ответ клетки на повреждение ДНК. Так, репрессия трансляции при повреждении ДНК может не распространять ся на мРНК, кодирующие белки-участники ответа на повреждение [46]. В соответствии с моделью РНК оперонов мРНК, которые кодируют функционально связанные белки, регулируются сопряженно на пост транскрипционном уровне. Таким образом, отдельно взятый RBP может контролировать экспрессию це лого ряда генов ответа на повреждение ДНК, как это происходит с белком HuR [47-49]. РНК-связывающие белки могут регулировать транскрипцию и ремоделирование хроматина и спо собны напрямую участвовать в репарации ДНК [50, 51]. При этом RBP локализуются вблизи сайтов по вреждений ДНК [52-54], что может быть опосредо вано их связыванием с короткими некодирующими РНК (ncРНК), которые синтезируются на поврежде ниях [18, 50, 55], или осуществляться по механизму, независимому от РНК. Транскрипция генов с высоким уровнем экспрес сии или очень протяженных иногда продолжается в S-фазе клеточного цикла [56], при этом могут фор мироваться РНК-ДНК-гибриды (R-петли), которые служат причиной большого количества повреждений ДНК эндогенной природы [57]. Образование R-петель предотвращается, в первую очередь, благодаря упаковке РНК-связывающими белками пре-мРНК в процессе ее синтеза [58, 59]. Важнейшую роль в ответе клетки на повреж дение ДНК играет передача сигнала посредством посттрансляционных модификаций (PTM) белков. RBP представляют основную категорию белков, фосфорилирование [60, 61] и поли(АDP-рибоз)или рование [62] которых регулируются повреждением ДНК. Генотоксический стресс приводит также к по вышению уровня ацетилирования некоторых РНК связывающих белков [63]. Наконец, повреждение ДНК индуцирует вну триклеточную релокализацию РНК-связывающих белков из цитоплазмы в ядро и наоборот [64, 65], что может быть важным для координации регуля ции метаболизма РНК и репарации ДНК мульти функциональными RBP. РНК-СВЯЗЫВАЮЩИЕ БЕЛКИ: МОДУЛЬНОЕ СТРОЕНИЕ Большая часть РНК-клетки ассоциирована с РНК связывающими белками в форме RNP-комплексов, нарушения в формировании которых приводят к различным заболеваниям [66, 67]. Взаимодействие с RBP необходимо для регуляции метаболизма РНК на всех этапах - от биогенеза до деградации, и РНК связывающие белки выполняют ключевые функции в таких процессах, как сплайсинг пре-мРНК [68], полиаденилирование [69], экспорт в цитоплазму и трансляция. Также RBP участвуют в процессинге некодирующих РНК - микроРНК (miРНК), цикли ческих РНК (circРНК), длинных некодирующих РНК (lncРНК) [70-72]. Таким образом, РНК-связывающие белки являются важнейшими посттранскрипцион ными регуляторами генов. На настоящий момент идентифицировано порядка 1500 RBP [73, 74]. Большинство из них имеют модуль ное строение, при котором разнообразие распознава емых последовательностей РНК достигается за счет различных комбинаций всего нескольких основных РНК-связывающих доменов (RBD) [75]. Отдельные RBD связывают, как правило, короткие последова тельности и обладают слабым сродством к РНК, однако, организация поверхности взаимодействия из множе ственных модулей позволяет достичь высокой аффин ности и специфичности к РНК-мишени. Использование суперпозиции из слабых взаимодействий делает бо лее простой регуляцию сборки и разборки RNP комплексов, которая может осуществляться посред ством РНК-подобного полимера поли(АDP-рибозы) [76, 77]. Причем, благодаря модульной структуре РНК связывающих белков, становится возможным рас познавание последовательностей, принадлежащих разным молекулам РНК [75]. Замечательный пример достижения специфичного связывания с мишенью за счет тандемных RBD представляют белки семей ства Pumilio (Puf), у которых боковые радикалы трех аминокислотных остатков каждого из восьми доме нов образуют контакты с отдельным основанием РНК [78]. Этот «код» распознавания РНК может быть ис пользован для конструирования белков, обладающих нужной специфичностью [79]. RBD, например, РНК распознающий мотив (RRM), в некоторых случаях мо гут служить для взаимодействия РНК-связывающего белка с другими белками [80]. Недавно было обнаружено, что, помимо классиче ских RBD, важнейшую роль в распознавании РНК белками играют неупорядоченные последователь ности (IDPR), которых в РНК-связывающих белках существенно больше, чем в среднем по протеому [81]. Так, около 20% белков млекопитающих, идентифици рованных как RBP, неупорядочены более чем на 80% [82]. Как и классические RBD, участки с неупоря доченной структурой в РНК-связывающих белках организованы в виде модулей, повторяющихся не случайным образом в пределах аминокислотной по следовательности, и в некоторых случаях могут ком бинироваться с глобулярными доменами [82]. Следует отметить, что возникновение неупорядоченных по следовательностей в RBP коррелирует с повышением сложности транскриптома в эволюции [83]. «ТАНЦУЮЩИЕ» БЕЛКИ, ХАМЕЛЕОНЫ, 4D И «БЕЛКОВЫЕ ОБЛАКА» Эти термины [84-87], появившиеся, чтобы охарак теризовать биологически активные белки, не имею щие определенной 3D-структуры, отражают основ ные особенности функционально неупорядоченных белков (intrinsically disordered proteins, IDP) и ча стей белков (intrinsically disordered protein regions, IDPR) - их высокую пластичность и динамику [88]. Поскольку 3D-структура белка формируется за счет различных нековалентных взаимодействий - водо родных связей, гидрофобных взаимодействий, сил Ван-дер-Ваальса и др., функциональная неупоря доченность IDP, как и уникальная структура глобу лярных белков, закодирована в их аминокислотной последовательности. Наличие большого числа не скомпенсированных заряженных групп в совокуп ности с пониженным содержанием гидрофобных аминокислотных остатков, как правило, приводит к отсутствию стабильной структуры белка в физио логических условиях [89]. В частности, в первичной структуре IDP и IDPR преобладают остатки Pro, Arg, Gly, Gln, Ser, Glu, Lys и Ala и уменьшено коли чество Cys, Trp, Tyr, Phe, Ile, Leu, Val и Asn [90]. Функционально неупорядоченные белки частично приобретают определенную 3D-структуру при из менении условий среды или при связывании с ли гандом [91]. Так, их фолдингу способствуют: повы шение температуры, усиливающее гидрофобные взаимодействия [92]; изменение pH, уменьшающее суммарный заряд белка [92]; а также наличие ионов, нейтрализующих электростатическое отталкивание между кластерами одноименно заряженных амино кислотных остатков [93, 94]. Внутри клетки функцио нально неупорядоченные белки приобретают опреде ленную структуру при связывании со специфичными мишенями и лигандами - небольшими молекулами, кофакторами, другими белками, нуклеиновыми кис лотами, мембранами и т.д. [91, 95]. Функции многих белков, особенно IDP, модули руются посредством посттрансляционных модифи каций (PTM), разнообразие которых в физиологиче ских условиях достигает 300 [96]. При том, что ДНК кодирует всего 20 аминокислот, разнообразие ами нокислотных остатков в белках, благодаря PTM, пре вышает 140 [97]. Модификация белков посредством PTM осуществляется преимущественно в неупоря доченных участках последовательности [98, 99]. IDP и белки, содержащие IDPR, по-видимому, играют центральную роль в интерактомах [100]. Так, у высших эукариот около 30-40% белков содержат протяженные IDPR [101], причем неупорядоченные белки выполняют ключевые функции в транскрип ции и клеточных сигнальных каскадах [102]. В 2005 г. впервые предположили, что хабы (узловые белки интерактомов) могут быть обогащены IDPR [103]. Многочисленные исследования позволили разде лить хабы на две основные категории - стабильные и временные [104, 105], первые из которых формиру ют модули - функциональные комплексы с высокой степенью взаимосвязанности белковых компонентов (например, система инициации транскрипции), а вто рые обеспечивают взаимодействия модулей между собой [106]. Оказалось, что IDPR широко представ лены только во второй категории хабов [107], сле довательно, роль функционально неупорядоченных белков в интерактоме заключается именно в коорди нации различных клеточных процессов [100]. В клетке существует множество способов функ ционирования неупорядоченных белков. IDPR во влечены в автоингибирование ферментов, при этом переход между упорядоченным и неупорядоченным состоянием отдельных доменов белка действует как переключатель, активируя или ингибируя фер мент [108]. Такой механизм, в частности, исполь зуется в репарации ДНК для активации фермента PARP1 и передачи сигнала о повреждении в ДНК [109]. Другим интересным примером использования IDPR служит вовлечение IDPR-содержащих бел ков в системы контроля качества белков, при этом переход белковых шаперонов от упорядоченного к неупорядоченному состоянию является стресс индуцируемым [110]. Считается, что IDP способны действовать как «молекулярные щиты», стериче ски ингибируя образование агрегатов других не упорядоченных белков в условиях стресса [111]. Функционально неупорядоченные элементы в бел ках (IDPR) также используются для регуляции тканеспецифичных сетей взаимодействий белков на уровне транскрипции. В работах Buljan и со авт. [112] и Ellis и соавт. [113] показано, что высокое содержание IDPR в белках обусловлено тка неспецифичными экзонами, остающимися после альтернативного сплайсинга [112]. Аналогично, тка неспецифичные экзоны кодируют существенную часть белковых сегментов, содержащих сайты PTM, и мотивы, служащие для связывания белков-пар тнеров [112]. Интересно, что белки, транслируемые с мРНК, обогащенных тканеспецифичными экзо нами, занимают центральные позиции в интерак томах, взаимодействуя с различными партнерами в соответствующих тканях [112]. Наличие неконсервативных IDPR в структуре ранних ферментов эксцизионной репарации ДНК млекопитающих является уникальной особенностью, отсутствующей у их гомологов из низших организ мов [114]. IDPR ферментов репарации вовлечены в распознавание повреждений ДНК, взаимодействие с белковыми партнерами; они действуют как преиму щественные акцепторы PTM, регулирующими ста бильность, ферментативную и ДНК-связывающую активности, внутриклеточную локализацию бел ков репарации, а также дают высшим организмам преимущество в размерах белков, освобождая про странство для динамики биомолекул внутри клетки [115-119]. Наконец, важнейшую роль IDP и IDPR играют в формировании динамических макромолекулярных структур клетки, в том числе RNP-гранул и ком плексов репарации ДНК. ФАЗОВЫЕ ПЕРЕХОДЫ БИОМОЛЕКУЛ Согласно современным представлениям, подробно из ложенным в работах [29, 30, 33-35, 37], разобщение биохимических процессов в клетке осуществляет ся посредством так называемых фазовых переходов (phase transitions) биомолекул (рис. 2). В соответствии с этой парадигмой образование немембранных ком партментов клетки имеет сходные черты с форми рованием капель дисперсной фазы при расслоении эмульсии двух жидкостей, обладающих различными свойствами [28-30, 120-122]. Ключевая роль в фазо вых переходах принадлежит функционально неупо рядоченным белкам [31], структурная пластичность которых позволяет им, приобретая различные кон формации, вступать во множественные гомо- и гете рогенные взаимодействия [32]. Многие IDP содержат домены низкой сложности (LCD), имеющие тенден цию к энергетически выгодной агрегации с образо ванием мультимеров белков [33]. В результате «рас слоения» внутриклеточной плазмы (liquid demixing) и отделения «дисперсной фазы» белки и взаимодей ствующие с ними лиганды оказываются в окруже нии, отличном от среды за пределами компартмента, что способствует локальному повышению концентра ций реагирующих молекул и эффективному протека нию специфических биохимических реакций [34]. Образование RNP-комплексов является одним из важнейших примеров немембранной компартмен тализации посредством фазовых переходов мРНК и соответствующих им IDPR-содержащих РНК связывающих белков [27]. Присутствие РНК в этих комплексах необходимо для сохранения их «раство римости» [35, 36], что, по-видимому, важно для по следующей трансляции [27]. Однако фазовые пере ходы могут осуществляться и независимо от РНК, только с участием белков - как, например, при фор мировании центросом (точек нуклеации сборки ми кротрубочек) [123]. Согласно Altmeyer и соавт., сбор ка мультибелковых комплексов репарации вблизи повреждений ДНК может происходить по механиз му фазового разделения, при котором формирование «репаросомного» компартмента способствует также удержанию в непосредственной близости концов разрыва ДНК, одновременно защищая их от гидро лиза нуклеазами [124, 125]. Фазовый переход белков и нуклеиновых кислот с образованием динамических ансамблей может ини циироваться локальным повышением концентрации компонентов с последующей самоассоциацией [126] и происходить в ответ на изменения физических па раметров микроокружения, таких, как pH, ионная сила или температура [127]. Кроме того, некоторые биомолекулы способны выступать в качестве «ядер» нуклеации сборки мультибелковых комплексов с по следующим локальным расслоением внутриклеточ ной плазмы на две жидкие фазы с различными свой ствами [37]. Предпочтительными субстратами для нуклеации фазовых переходов являются одноцепочечные ну клеиновые кислоты - РНК [27, 128] и одноцепочеч ная ДНК (оцДНК) [129]. Оба полимера обладают боль шей структурной гибкостью, чем двухцепочечная ДНК, и их общие свойства - отрицательный заряд и относительно низкая сложность в силу строения из ограниченного набора уникальных блоков [33] - напоминают характерные черты функционально не упорядоченных белков. У высших организмов эво люция самоорганизации внутриклеточной плазмы достигает своего пика с появлением «третьей ну клеиновой кислоты», не несущей информационной нагрузки, имеющей предельно простую структуру из повторяющихся мономеров и очень короткое вре мя существования в клетке, - это поли(АDP-рибоза) (PAR). Роль этой нуклеиновой кислоты может быть определяющей в регуляции фазовых переходов био молекул в клетке. ПОЛИ(АDP-РИБОЗА) И ПОЛИ(АDP-РИБОЗ)ИЛИРОВАНИЕ Поли(АDP-рибоза) представляет собой линейную или разветвленную полимерную цепь, состоящую из идентичных молекулярных блоков - единиц АDP рибозы, источником которых в процессе катализи руемого PARP1 синтеза PAR служит NAD+ (рис. 3) [130]. В физиологических условиях PAR формирует динамичную мультиглобулярную структуру, зави сящую от размера полимера, что может способство вать его «подстройке» при связывании различных лигандов [131]. Адениновые основания в поли(АDP рибозе), как в нуклеиновых кислотах, располагают ся в анти-конформации, открытой для образования водородных связей и стекинг-взаимодействий [132]. Вторичная структура PAR в виде спирали, под твержденная in vitro методом спектрального анали за [133], может формироваться при высокой ионной силе раствора (4 М NaCl) либо, в физиологических условиях, при связывании с белками [132]. Полимер PAR обладает отрицательным зарядом за счет двух отрицательно заряженных фосфатных групп в каж дом из мономеров (остатков ADP-рибозы), в то вре мя как РНК и оцДНК содержат лишь один отри цательный заряд на мономер (остаток нуклеотида) [134]. В отсутствие воздействий, индуцирующих повреждение ДНК, уровень PAR в клетках очень низкий, и (АDP-рибоза) присутствует в форме до статочно стабильных (время полураспада t1/2 ~7.7 ч) моно- или олигомеров. Массированный локальный синтез высокодинамичного полимера PAR (t1/2 менее 1 мин) индуцируется возникновением повреждения в ДНК [135-137]. Главная отличительная особенность поли(АDP-рибозы) - участие в посттрансляционной модификации белков. По аналогии с ДНК и РНК ферменты, ответствен ные за синтез PAR в клетках, были названы PAR полимеразами (PARP). PARP1 является важней шим представителем семейства белков со сходными каталитическими доменами, у человека это семей ство насчитывает 17 членов [138]. Только четыре представителя этого класса обладают способностью к синтезу поли(АDP-рибозы) - PARP1, PARP2 и две танкиразы [138, 139]. Белки PARP1 и PARP2 играют важную роль в сохранении стабильности генома [140]. Танкиразы, способные синтезировать линейный PAR длиной до 20 мономеров АDP-рибозы [141], функци онируют при формировании веретена деления [142] и контролируют функции центросомы [143]. PARP1 активируется при связывании с экс понированными основаниями на концах разрыва ДНК [144]. Распознавание повреждения приводит к локальной перестройке аутоингибиторного доме на PARP1, который, приобретая неупорядоченную структуру, перестает препятствовать связыванию NAD+ в активном центре для последующего синте за поли(АDP-рибозы) [109]. В результате интердо менных взаимодействий, привлекающих катали тический домен к месту повреждения ДНК, домен аутомодификации PARP1 располагается вблизи активного центра, тем самым оказываясь наиболее доступным акцептором полимера PAR [145]. Это объ ясняет тот факт, что преимущественной мишенью поли(АDP-рибоз)илирования является сам PARP1 [134]. В PARP1, как и в модифицируемых им белках, установлено большое разнообразие (АDP-рибоза) акцепторных сайтов: Lys, Arg, Glu, Asp, Cys, Ser, Thr, Sep (по фосфату), Asn, хотя чаще акцептора ми служат заряженные аминокислотные остатки [146-149]. Принимая во внимание, что скорость син теза PAR лимитируется расщеплением NAD+, мож но предположить, что присоединение АDP-рибозы к белку-мишени в присутствии активированного PARP1 происходит по любому подходящему амино кислотному остатку на экспонированной поверхно сти белка [125]. Специфичность PAR-опосредованной модуляции клеточных процессов при этом может достигаться за счет разного локального окружения PARP1 и его мишени, а не за счет специфичных сай тов модификации в белке [125]. Многие белки взаимодействуют с PAR некова лентно. Среди белков, ассоциированных с PAR и/ или подвергающихся этой PTM, идентифицирова ны некоторые факторы репарации ДНК, белки ре моделирования хроматина, РНК-связывающие бел ки и транскрипционные факторы [62, 150]. Многие функции, выполняемые PAR в клетках, реализу ются посредством динамического взаимодействия поли(АDP-рибозы) и PAR-связывающих белков. Перераспределение белков в клетке в результате локального синтеза PAR может влиять на пути пе редачи сигнала, ответ клетки на повреждение ДНК, регуляцию транскрипции, стабильность белков, определение судьбы клетки [151]. На настоящий мо мент описано несколько PAR-связывающих модулей в белках, структура которых варьирует от полностью упорядоченных доменов до IDPR, способных всту пать в мультивалентные взаимодействия с полиме ром PAR [125]. PAR также может распознаваться РНК- и ДНК связывающими мотивами белков [125]. Поскольку для организации макромолекулярных ансамблей в клетке важны не только специфичные взаимо действия, но и динамические изменения локальных концентраций взаимодействующих молекул, пики PARилирования вблизи повреждений ДНК могут конкурировать с РНК за связывание RBP, привлекая их к сайтам повреждений [152]. ДНК-связывающие домены ферментов репарации ДНК и факторов транскрипции также могут способствовать PAR зависимому привлечению этих белков к месту лока лизации повреждения в ДНК [153, 154]. Недавно было показано, что PAR может высту пать в качестве ядра нуклеации фазовых пере ходов РНК-связывающих белков FUS (TLS), EWS (EWSR1) и TAF15 в сайтах геномных повреждений [124]. Компартментализация клетки, инициируемая PAR-зависимым разделом фаз, может лежать в ос нове ключевых функций этого полимера в различ ных процессах, связанных с ДНК и РНК, например, в формировании стресс-гранул [155], ядрышек [156], сплайсосом [157] и транскриптосом [158]. Так, в слу чае регуляции транскрипции фазовый переход FUS (TLS), EWS (EWSR1) и TAF15 на промоторах генов может обеспечивать платформу для посадки неупо рядоченного С-концевого домена РНК-полимеразы II [159]. По-видимому, формирование PAR вблизи промоторов может способствовать транскрипции, особенно если принять во внимание, что в некоторых случаях повреждения специально вносятся в промо торы и кодирующие части генов [5, 13, 17]. Длительное существование PAR в клетке сопря жено с определенными рисками, среди которых сня тие РНК- и ДНК-связывающих белков с их мишеней, возможность фазового перехода динамических «ка пель» к нерастворимым агрегатам белков, которые наблюдаются при некоторых патологических состоя ниях организма [33], а также энергетический кризис, вызванный истощением запасов NAD+ [160]. Поэтому важную роль в системе поли(АDP-рибоз)илирова ния играют ферменты, способные расщеплять PAR и удалять АDP-рибозу с модифицированных белков [161]. Ключевым ферментом, деградирующим PAR в клетках, является поли(АDP-рибозо)гликогидро лаза (PARG), которой присущи эндо- и экзоглико гидролазная активности с преобладанием последней [162]. Поскольку для расщепления PAR требуется доступность полимера, PAR-связывающие белки по тенциально могут препятствовать активности PARG в клетках. Так, PARG не может отщеплять прокси мальный мономер АDP-рибозы, что, предположи тельно, обусловлено стерическими затруднениями [163]. Для удаления АDP-рибозы с моно(АDP-рибоз)илированных белков существуют специализирован ные ферменты [164]. Динамическая регуляция уров ня PAR в клетках может обеспечивать необходимый баланс РНК- и ДНК-белковых взаимодействий в раз личных системах. Y-БОКС-СВЯЗЫВАЮЩИЙ БЕЛОК 1 В качестве примера мультиспецифичного белка, функционирующего «на стыке трех нуклеиновых кислот», можно привести Y-бокс-связывающий бе лок 1 (YB-1). При взаимодействии с ДНК [165, 166] реализуется роль YB-1 в транскрипции [167] и пред полагаемое участие в репарации ДНК [166, 168]. Под контролем YB-1, действующего как фактор транскрипции, находятся гены, экспрессия которых индуцируется внешним воздействием, и некоторые гены, продукты которых участвуют в репарации ДНК [167, 169, 170]. В качестве РНК-связывающего белка YB-1 участвует в сплайсинге пре-мРНК [167, 171], является основным белком RNP в цитоплаз ме [172] и регулирует трансляцию мРНК [167, 173]. Установлено, что YB-1 взаимодействует с большим числом некодирующих РНК [174, 175], обладает по вышенным сродством к поврежденным ДНК и РНК [166, 168, 176], а также обнаружен среди PAR связывающих белков [150]. Для YB-1 характерна стресс-зависимая релокализация из цитоплазмы в ядро [177-180], в некоторых случаях обусловленная специфической посттрансляционной модификацией YB-1 - его частичным протеолизом 20S протеасомой [181]. Большая часть молекулы YB-1 имеет функ ционально неупорядоченную структуру [167], наделяющую этот белок высокой мультива лентностью и способностью к самоассоциации с об разованием мультимеров в присутствии РНК и ДНК [182] или амилоидных фибрилл при высокой ион ной силе раствора [183]. YB-1 физически взаимо действует с ферментами разных систем репарации ДНК - эксцизионной репарации оснований (NEIL2 [177], APE1 [184], ДНК-полимеразы β [177], ДНК полимеразы δ [185], PCNA [186], ДНК-лигазы IIIα [177], NEIL1, PARP1 и PARP2 [187]), мисматч-ре парации (MSH2 [185]), репарации двухцепочечных разрывов ДНК (Ku80 [185]).YB-1 может способство вать распознаванию объемных повреждений ДНК фактором NER XPC-HR23b [188] и модулировать ак тивность ключевых и регуляторных ферментов BER [177, 187, 189-191]. YB-1 обнаруживается в стрессовых гранулах [192], необходим для формирования центросомы [193] и может участвовать в разборке ядрышек [194]. Архитектором формирования этих немембранных структур, как и комплексов репарации на повреж дениях ДНК, служит поли(АDP-рибоза) [155, 156, 195]. Недавно было показано, что YB-1 способен мо дулировать синтез PAR в зависимости от интенсив ности повреждения ДНК [187], выступать в каче стве мишени поли(АDP-рибоз)илирования [187, 196] и защищать PAR от гидролиза PARG, существен но продлевая время существования полимера [187]. Схематическое изображение участия YB-1 в метабо лизме PAR и РНК представлено на рис. 4. Таким образом, транскрипционный фактор и один из ключевых РНК-связывающих белков цитоплазмы YB-1 обладает широким спектром дополнительных функций, которые могут «включаться» в условиях ДНК-повреждающего стресса. Помимо транскрип ционной и посттранскрипционной регуляции генов, в их число входят непосредственное участие в репа рации ДНК и регуляция сборки комплексов репара ции путем PAR-индуцируемых фазовых переходов функционально неупорядоченных белков и факто ров репарации ДНК, содержащих IDPR. YB-1 слу жит примером возможного функционирования RBP в качестве дополнительного стресс-индуцируемого уровня защиты целостности генома. ЗАКЛЮЧЕНИЕ Увеличение сложности организма в эволюции коррелирует с развитием регуляторных систем. В то же время ограничение размера клетки приво дит к росту мультифункциональности биополимеров. Мультифункциональность, т.е. способность принимать участие в нескольких биохимических процессах, тесно связана со способностью взаимодействовать с различ ными партнерами, структура большинства из кото рых строго детерминирована их функцией в клетке. Использование модульной структуры из блоков, об ладающих разной специфичностью, не позволяет пол ностью решить эту проблему, поскольку сохраняется ограничение на количество возможных взаимодей ствий. Изящным решением этой задачи стало умень шение информационного объема первичных струк тур нуклеиновых кислот и белков. В своих работах Уверский В. [88, 197] убедительно показал, как упро щение аминокислотной последовательности белка приводит к достижению максимальной структурной сложности. Появление функционально неупорядочен ных белков позволило значительно расширить спектр внутриклеточных взаимодействий за счет уникаль ных биофизических особенностей этих представите лей белкового царства [197]. Обладая мультивалент ностью в сочетании с малым объемом, функционально неупорядоченные белки способны вовлекаться в са мые разные клеточные процессы и образовывать уз ловые точки интерактомов, выступая в качестве клю чевых регуляторных белков клетки. Параллельно с преобразованием протеома в ходе эволюции у высших эукариот появляется боль шое разнообразие некодирующих нуклеиновых кислот, служащих для регуляции базовых систем РНК- и ДНК-белковых взаимодействий. В поддер жании стабильности генома особое место занимает «третья нуклеиновая кислота» - поли(АDP-рибоза) (PAR), синтез которой из NAD+ стимулируется в присутствии поврежденной ДНК. Образование PAR, модулирующей взаимодействия РНК- и ДНК связывающих белков с их мишенями, приводит к сборке специфических функциональных комплек сов, необходимых для регуляции ключевых процес сов клеточного метаболизма в условиях стрессового воздействия.

Об авторах

E. E. Алемасова

Email: lavrik@niboch.nsc.ru
Россия

O. И. Лаврик

Автор, ответственный за переписку.
Email: lavrik@niboch.nsc.ru
Россия

Список литературы

Дополнительные файлы