Индукция экспрессии ICAM-1 в эмбриональных фибробластах мыши при их культивировании на губчатых фиброин-желатиновых скаффолдах

Полный текст

ВВЕДЕНИЕ Ранее нами был создан фиброин-желатиновый губ чатый скаффолд, формирующий субстрат для ад гезии и пролиферации клеток различных типов [1]. Фрагменты этого скаффолда размером 200-400 мкм при подкожном введении в область, прилегающую к ране, способствовали регенерации полнослойной раны кожи мыши, по-видимому, из-за их иммуномо дулирующей активности [2]. Одним из возможных ме ханизмов, лежащих в основе регенеративной активно сти фиброин-желатиновых скаффолдов, может быть усиление экспрессии фибробластами после их кон такта с поверхностью скаффолдов молекул адгезии, вовлеченных в иммунные реакции. Одной из таких молекул является ICAM-1. В норме ICAM-1 представ лена на фибробластах в небольшом количестве, а ее экспрессия может быть индуцирована в результате изменения микроокружения. Например, при воспалении экспрессия ICAM-1 в тканеспецифичных фи бробластах значительно возрастает и способствует миграции иммунных клеток к очагу воспаления [3, 4]. ICAM-1 важна для функционирования лимфоид ных органов, где молекула обеспечивает контактные взаимодействия между клетками иммунной систе мы, стромальными и эндотелиальными клетками [5]. Воспроизведение этих и других взаимодействий, опосредованных трехмерным окружением, как in vitro, так и in vivo представляет важный этап в кон струировании искусственной лимфоидной ткани [6]. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ Первичную культуру МЭФ и губчатые фиброиновые скаффолды, содержащие 30% желатина (3D ФЖ), получали как описано ранее [1]. Для 2D культиви рования использовали скаффолды, выполненные в виде пленок из водного раствора того же состава, или культуральный пластик Nunc (Thermo Fisher Scientific, США). РНК из МЭФ выделяли по стандартному прото колу с использованием TRI Reagent (Sigma Aldrich, США), наборов для обратной транскрипции (Thermo Scientific, EN0521 и K1621) и ПЦР в реальном време ни («Синтол», М-440), руководствуясь при этом реко мендациями производителей. Качество реакций оце нивали по кривой плавления и электрофорезу в 1.8% агарозном геле продуктов амплификации. Снимки гелей проводили с помощью GelDoc™XR+System (BioRad, США). В качестве положительного контроля при анализе экспрессии гена Madcam1 использова ли суммарную РНК, выделенную из лимфатических узлов мыши. Работу проводили на приборе 7500 RTPCR System (Applied Biosystems, США). Иммунофлуоресцентный анализ проводили с при менением антител αICAM1-Cy5 (KAT1), ядерного красителя SYTOX orange, конъюгата фаллоидин- ФИТЦ для визуализации полимеризованного ак тина. Образцы заключали в Aqua-Poly/Mount (Polysciences, Inc., США). Полученные препараты исследовали с использованием электронного микро скопа Camscan Series II (Cambridge Instruments) в режиме SEI и на микроскопе Nikon Eclipse Ti-E с конфокальным модулем А1 (Nikon Corp., Япония) и объективом Apo TIRF 60×/1.49 Oil или CFI Plan Apo VC 20×/0.75. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 3D ФЖ скаффолд имеет трехмерную пористую структуру со сложной внутренней и внешней топо графией (рис. 1А-Г). Важно, что при культивирова нии МЭФ на скаффолдах взаимодействие клеточных структур с субстратом осуществляется в различных плоскостях (рис. 1Д,Е’). Распределение клеток на по верхности трехмерного скаффолда также представ лено на рис. 2А. Поскольку молекулы адгезии играют важнейшую роль во взаимодействии клеток друг с другом и с вне клеточным матриксом, для изучения влияния усло вий культивирования на свойства МЭФ была про анализирована экспрессия гена молекулы адгезии ICAM-1 в 3D и 2D культурах. Известно, что цито плазматический домен молекулы ICAM-1 взаимо действует с актиновым цитоскелетом [7], а класте ризация ICAM-1 индуцирует ассоциацию ICAM-1 с актинсвязывающими адаптерными белками и свя зывает ICAM-1 с F-актиновым цитоскелетом [8]. Мы предположили, что перестройки цитоскелета, вызванные культивированием МЭФ в трехмерных фиброиновых скаффолдах, могут приводить к изме нению экспрессии ICAM-1. Действительно, при дли тельном культивировании МЭФ на фиброиновых скаффолдах, но не на культуральном пластике, на блюдается значительное увеличение экспрессии гена Icam1 (рис. 2Б). В соответствии с данными по экс прессии гена интенсивное окрашивание МЭФ анти телами к ICAM-1 наблюдали только в условиях 3D культивирования (рис. 2В). При этом при 2D культи вировании фибробластов на ФЖ-пленках или на сте кле сигнал практически отсутствовал (рис. 2Г). Наличие очень слабого сигнала, по-видимому, обу словлено базовым уровнем экспрессии мРНК Icam1 в 2D культуре (рис. 2Б). Чтобы убедиться в специфичности наблюдаемого эффекта и отсутствии его связи с общим повышени ем уровней экспрессии различных генов в процес се культивирования на 3D субстратах, была про анализирована экспрессия гена другой молекулы адгезии - MAdCAM-1. MAdCAM-1, как и ICAM-1, экспрессируется на стромальных и эндотелиальных клетках и является одним из ключевых участников в миграции иммунных клеток в лимфоидные органы, а также в барьерные ткани, однако для нее характер на специфическая индукция при активации некото рых цитокиновых рецепторов [9]. Продукты экспрессии гена Madcam1 в культуре МЭФ на скаффолдах не были выявлены, что свиде тельствует об избирательности влияния трехмерных условий культивирования на экспрессию генов моле кул адгезии (рис. 2Д). Известно, что промоторная область гена Icam-1 содержит три сайта связывания транскрипционно го фактора АР-1, который участвует в его регуля ции [10]. Один из возможных механизмов индукции ICAM-1 в МЭФ может быть связан с изменением активности фактора AP-1. Анализ экспрессии ге нов, кодирующих субъединицы AP-1 (Fos, Jun, Jund, Junb) (рис. 3) показал значимое увеличение уровня экспрессии Fos и Junb в условиях 3D культивирова ния по сравнению с 2D. Экспрессия генов Jun и Jund не зависела от условий культивирования и не изме нялась статистически значимо. В дальнейшем предстоит понять, какие сигналь ные пути, начиная с механорецепции трехмерного скаффолда или межклеточных взаимодействий, при водят к экспрессии АР-1 и затем, по-видимому, к по явлению ICAM-1. Также нельзя исключать участия других транскрипционных факторов в индукции экс прессии ICAM-1. Так, например, известно, что в этот процесс вовлечено семейство транскрипционных факторов NF-κB [11]. ВЫВОДЫ Культивирование МЭФ в трехмерных фиброин-же латиновых скаффолдах приводит к существенному повышению экспрессии ICAM-1. Усиление экспрессии ICAM-1 связано с трехмер ной организацией скаффолда, а не с влиянием про дуктов деградации фиброина, так как культивирова ние на двумерном фиброиновом матриксе не влияло на экспрессию молекулы. Увеличение экспрессии ICAM-1 сопряжено с уси лением экспрессии генов AP-1 - Fos и Junb, но не Jun и Jund.

Об авторах

M. A. Носенко

Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова; Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН; Немецкий ревматологический исследовательский центр

Email: mmoisenovich@mail.ru
Россия

Н. В. Малюченко

Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова

Email: mmoisenovich@mail.ru
Россия

M. С. Друцкая

Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова; Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН

Email: mmoisenovich@mail.ru
Россия

A. Ю. Архипова

Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова

Email: mmoisenovich@mail.ru
Россия

И. И. Агапов

Федеральный научный центр трансплантологии и искусственных органов им. академика В.И. Шумакова Минздрава России

Email: mmoisenovich@mail.ru
Россия

С. A. Недоспасов

Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова; Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН; Немецкий ревматологический исследовательский центр

Email: mmoisenovich@mail.ru
Россия

M. M. Мойсенович

Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова

Автор, ответственный за переписку.
Email: mmoisenovich@mail.ru
Россия

Список литературы

Дополнительные файлы