Необъемные повреждения ДНК у человека: пути образования, репарации и репликации

Полный текст

ВВЕДЕНИЕ В ДНК живых организмов ежедневно появляет ся множество повреждений, которые образуются спонтанно и в результате воздействия разнообраз ных химических и физических факторов: свободных радикалов, ультрафиолетового и ионизирующего излучения, клеточных метаболитов и химических канцерогенов. Кроме того, повреждения могут обра зоваться в ходе физиологических клеточных реак ций (интермедиаты при репарации ДНК, гипермута генезе генов иммуноглобулинов и др.). В результате воздействия химических канцероге нов (таких, как акролеин, цисплатин, бензо[α]пирен, ароматические амины и нитрозамины) и ультрафи олетового излучения в ДНК образуются преимуще ственно объемные аддукты, внутринитевые и меж нитевые сшивки, которые существенно нарушают геометрию сахарофосфатного остова ДНК [1]. Эти повреждения удаляются из геномной ДНК главным образом путем эксцизионной репарации нуклео тидов (ЭРН, Nucleotide Excision Repair, NER) [2, 3]. Нерепарированные объемные повреждения в значи тельной степени ингибируют работу высокоточных ДНК-полимераз (ДНКП), которые специализируют ся на копировании геномной ДНК и руководствуются строгим геометрическим соответствием при вклю чении нуклеотидов [4-6]. Накопление подобных по вреждений в делящихся клетках ведет к остановке репликации, аберрациям хромосом и гибели клеток. Спонтанные повреждения и повреждения, об разованные в ходе обменных клеточных процессов или в результате атаки свободных радикалов, пред ставляют собой, главным образом, «необъемные» повреждения. К основным группам «необъемных» повреждений ДНК относятся: апуриновые-апири мидиновые сайты (АП-сайты), окисленные и неко торые алкилированные производные нуклеотидов, а также повреждения, вызванные дезаминированием азотистых оснований. Главным механизмом удале ния таких повреждений является эксцизионная ре парация оснований (ЭРО, Base Excision Repair, BER). Подробно механизмы ЭРО рассмотрены в нескольких последних обзорах [7-9]. «Необъемные» поврежде ния в меньшей степени влияют на структуру ДНК, но они тоже нарушают работу ферментов синтеза ДНК, вызывая ошибки копирования генетической информации и блоки репликации. В настоящем обзоре мы систематизируем основ ные пути образования, репарации и репликации «не объемных» повреждений ДНК и рассматриваем роль специализированных ДНКП человека (спецДНКП), обеспечивающих эффективный, но часто высоко ошибочный синтез поврежденной ДНК. ПУТИ ОБРАЗОВАНИЯ И ТИПЫ ПОВРЕЖДЕНИЙ ДНК Апуриновые и апиримидиновые сайты Важнейшую роль в механизмах мутагенеза, вызван ных повреждениями геномной ДНК, играют апурино вые и апиримидиновые сайты (АП-сайты), которые являются самыми частыми повреждениями ДНК. За день в клетке млекопитающих в среднем появ ляется 9000-14000 АП-сайтов [10, 11]. Большинство АП-сайтов образуется в результате спонтанного ги дролиза N-гликозидной связи дезоксирибонуклео тидов, который идет с достаточно высокой скоростью при физиологических условиях [12]. При этом ско рость отщепления пуриновых азотистых оснований (апуринизация) превышает темпы гидролиза пири мидиновых более чем в 10 раз [11]. Разрыв гликозид ной связи происходит и в процессе ЭРО в результате работы ДНК-гликозилаз [13]. Наконец, образование АП-сайтов является важным этапом гипермутаге неза генов иммуноглобулинов у млекопитающих [14, 15]. АП-сайты обладают одновременно высокими му тагенными и цитотоксическими свойствами. Из-за невозможности образования канонических водород ных связей с АП-сайтами многие ДНКП останавли ваются или включают dAMP напротив повреждения (таблица) [16-19]. Включение dAMP напротив АП сайта энергетически наиболее выгодно [20]. В отста ющей цепи АП-сайты подавляют активность ДНКП Pol δ по замещению цепи (strand displacement synthesis) в репликативном синтезе, нарушая созрева ние фрагментов Оказаки [21]. Нерепарированные АП-сайты приводят к остановке транскрипции, являясь причиной высокой частоты мутагенеза у Saccharomyces cerevisiae [22]. У человека АП-сайты в ДНК преимущественно распознаются и расщепля ются ферментом АП-эндонуклеазой APE1 с обра зованием одноцепочечных разрывов [23, 24]. Важно отметить, что недавно выявили роль многих других белков в альтернативных путях APE1-независимой репарации АП-сайтов: субъединиц белка Ku, вхо дящего в состав ДНК-зависимой протеинкиназы (DNA-PK) [25-27], тирозил-ДНК-фосфодиэстеразы I (TDP1) [28, 29] и поли(АDP-рибозо)полимеразы PARP1 [30]. Альтернативные пути удаления АП сайтов могут служить резервными механизмами ре парации повреждения. Подробно функции белков Ku и TDP1 в репарации АП-сайтов рассмотрены в обзо рах [31, 32]. Окисленные производные азотистых оснований В результате воздействия активных форм кислорода (АФК), которые образуются под влиянием ионизиру ющего излучения или в результате физиологических обменных процессов, в клетках происходит окисле ние азотистых оснований. Митохондриальная ДНК подвергается атаке АФК в гораздо большей степе ни, чем ядерная [33]. Разные АФК отличаются ре акционной способностью. Супероксидный радикал (O2 •) и пероксид водорода (H2O2) обладают слабой реакционной способностью, тогда как гидроксиль ный радикал (OH•) очень активен и повреждает все четыре основания ДНК; cинглетный кислород (1O2) атакует преимущественно остатки гуанина [34-36]. Под влиянием окислительного стресса образуется не менее ста разных типов повреждений [34]. К наи более распространенным и биологически значимым окисленным производным азотистых оснований от носятся: 7,8-дигидро-8-оксогуанин (8-oxo-G), ти мидингликоль (TG), 5-гидроксицитозин (5-oh-C), 2,6-диамино-4-гидрокси-5-формамидопиримидин (FapyG) и 4,6-диамино-5-формамидопиримидин (FapyA) (рис. 1). К появлению формамидопирими диновых повреждений приводит раскрытие имида зольного кольца в результате атаки АФК [35, 37-39]. 8-oxo-G и TG относятся к одним из самых частых повреждений ДНК, вызываемых АФК. За сутки в клетке человека образуется в среднем 1000-2000 8-oxo-G и до 2000 ТG [35]. 8-oxo-G относится к высо комутагенным повреждениям. Большинство ДНКП напротив 8-oxo-G включают dАMP за счет образо вания хугстиновских водородных связей, что приво дит к образованию трансверсий GC-TA (таблица) [40-42]. TG является не мутагенным, но высокоток сичным повреждением, блокирующим работу фер ментов репликации (таблица) [43, 44]. Механизмы снижения мутагенного потенциала окисленных про изводных нуклеотидов в клетке сложны и включают альтернативные варианты удаления и коррекции по врежденных нуклеотидов. Повреждения, вызванные дезаминированием азотистых оснований Потеря аминогруппы азотистыми основаниями происходит в клетке спонтанно [45, 46] и при окис лительном дезаминировании под действием актив ных форм азота (например, образующихся при вос палении) [47-49], а также ферментативным путем. Дезаминирование остатков цитозина цитидиндеза миназами и последующее удаление урацила с обра зованием АП-сайтов играют ключевую роль в мута генезе при созревании вариабельных областей генов иммуноглобулинов в В-лимфоцитах млекопитающих [14, 15]. Одноцепочечная ДНК (например, реплицируе мая или активно транскрибируемая) подвергает ся дезаминированию значительно чаще (более чем в 100 раз) по сравнению с двухцепочечной ДНК [50, 51]. Пиримидиновые основания более подвержены спонтанному дезаминированию, чем пуриновые [51, 52], однако пуриновые основания чаще подвергаются окислительному дезаминированию [53]. Наиболее ча сто в клетке происходит дезаминирование цитозина с образованием урацила (рис. 1). В среднем в клет ке млекопитающих в день происходит дезаминиро вание 100-500 остатков цитозина с образованием урацила [45, 51, 54]. При дезаминировании цитозина и одновременном воздействии свободных радикалов или ионизирующей радиации могут образовываться производные урацила - 5-гидроксиурацил (5-oh-U) и 5,6-дигидроурацил (5,6-DHU) (рис. 1) [55, 56]. В геномной ДНК встречаются также продукты дезаминирования аденина (гипоксантин) и гуанина (ксантин и оксанин) (рис. 1). Частота появления ги поксантина и ксантина составляет 1-7 на каждые 106 нуклеотидов [57-59]. Дезаминированные азотистые основания в составе ДНК не приводят к остановке работы эукариотических ДНКП, но обладают вы соким мутагенным потенциалом, генерируя точко вые мутации. ДНКП эукариот включают напротив урацила dAMP, что приводит к транзициям GC-AT при последующих раундах репликации (таблица) [60]. Напротив гипоксантина ДНКП преимуществен но включают dCMP, что приводит к транзиции AT- GC [61-63]. Ксантин и оксанин могут образовывать связи с тимином, вызывая транзиции GC-AT при ре пликации [64]. Большой вклад в мутагенез ДНК вносит и дезами нирование 5-метилцитозина (5-me-C), в результате которого образуется тимин, что вызывает прямые транзиции GC-AT [45]. Несмотря на то, что только 3% цитозинов геномной ДНК человека метилирова ны, «CpG-островки», которые выполняют функцию подавления экспрессии генов, в 70-80% случаев со держат 5-me-C и являются горячими точками мута генеза в делящихся клетках млекопитающих [65, 66]. Повреждения, вызванные дезаминированием азо тистых оснований, преимущественно репарируются по пути ЭРО. Алкилированные производные азотистых оснований В индукции образования «необъемных» алкилиро ванных азотистых оснований большую роль игра ют экзогенные химические алкилирующие аген ты, которые представляют собой электрофильные соединения со сродством к нуклеофильным цен трам органических молекул и включают широкий спектр веществ. Например, экзогенные алкилиру ющие агенты присутствуют в пищевых продук тах в виде нитрозаминов (N-нитрозодиметиламин и N-нитрозодиэтиламин, которые образуются при взаимодействии аминов и нитритов во время копчения и интенсивной термической обработки) [67, 68] и в окружающей среде в виде галогеналка нов (винилхлорид, используемый в качестве сырья в производстве пластмасс, сельскохозяйственный фумигант бромметан, хладагент хлорметан) [69-71]. Некоторые алкилирующие соединения широко ис пользуются в химиотерапии (циклофосфамид, мел фалан, бусульфан, темозоломид) [72, 73]. По меха низму нуклеофильного замещения алкилирующие агенты можно разделить на соединения SN1-типа (мономолекулярное замещение с образованием интермедиата: азотистый иприт, N-нитрозо-N метилмочевина) и SN2-типа (одностадийное бимоле кулярное замещение: метилметансульфонат, диме тилсульфат, бусульфан) [74, 75]. Во всех четырех азотистых основаниях обнару жено множество потенциальных сайтов для реакций алкилирования (N1, N3, N6, N7 в аденине, N1, N2, N3, N7, O6 в гуанине, N3, N4, O2 в цитозине, N3, O2 и O4 в тимине), но все они имеют разную реакционную способность. Распространенными и биологически значимыми являются такие алкилированные произ водные азотистых оснований, как: N3-метиладенин (N3-mе-A), O6-метилгуанин (O6-mе-G), 1-метила денин (N1-mе-A), N7-метилгуанин (N7-me-G), N2 этилгуанин (N2-et-G) (рис. 1) [74-77]. Наиболее рас пространены такие продукты N-метилирования, как N7-mе-G и N3-mе-А. N7-me-G может составлять до 70-80% метилированных повреждений в ДНК. Алкилирование азотистых оснований происхо дит также под влиянием эндогенных генотоксиче ских агентов. S-аденозилметионин (SAM) является слабым алкилирующим агентом и выступает в качестве донора метильной группы в реакциях транс метилирования в клетках. За сутки под влиянием SAM в клетке млекопитающих образуется, предпо ложительно, около 4000 7-me-G, 600 3-me-A и 10-30 остатков O6-me-G [78, 79]. Накопление N3-mе-А является цитотоксичным, поскольку N3-me-A блокирует работу ДНКП, нару шая контакты между активным центром ДНКП и ато мом N3 аденина в малой бороздке ДНК (таблица) [80-82]. Изучение влияния N7-me-G на работу ДНКП затруднено из-за высокой нестабильности повреж денного основания. Метилированные остатки гуанина не ингибируют работу ДНКП I Escherichia coli (Pol I) [83]. Однако с использованием химически стабильного аналога N7-me-G недавно показали, что Pol β чело века включает нуклеотиды напротив повреждения с низкой эффективностью и точностью (таблица) [84]. N7-me-G подвергается спонтанной депуринизации с образованием цитотоксичных АП-сайтов [75]. Кроме того, N7-me-G с открытым имидазольным кольцом (me-Fapy-G) ингибирует репликацию [85, 86]. O6 mе-G образуется преимущественно в результате воз действия на ДНК химических агентов SN1-типа [78]. Это повреждение обладает мутагенными и канцеро генными свойствами, образуя связи с тимином и вы зывая транзиции GC-AT при репликации [87-89]. O6 me-G может также блокировать работу некоторых ДНКП (таблица) [90, 91]. Важную роль в репарации «необъемных» алкилированных производных азоти стых оснований играет не только ЭРО, но и прямое восстановление структуры оснований с помощью ал килтрансфераз и диоксигеназ [92]. К относительно необъемным повреждениям, репа рация которых также обеспечивается ферментами, участвующими в репарации алкилированных азоти стых оснований, можно отнести и экзоциклические повреждения азотистых оснований с этеновым коль цом: 1,N6-этеноаденин (εА), 1,N2-этеногуанин (1,2-εG), N2,3-этеногуанин (2,3-εG) и 3,N4-этеноцитозин (εС) (рис. 1). Их появление вызывают альдегиды, образу ющиеся при перекисном окислении липидов под дей ствием свободных радикалов кислорода и азота [93, 94], а также некоторые промышленные генотоксиче ские соединения (например, винилхлорид и уретан) [95]. Экзоциклические повреждения ДНК обладают высокими мутагенными и генотоксическими свой ствами in vitro и in vivo [96-99]. 1,N6-этено-группа на рушает уотсон-криковские взаимодействия и блоки рует работу большинства ДНКП, включая некоторые спецДНКП (таблица) [17, 100, 101]. РЕПАРАЦИЯ НЕОБЪЕМНЫХ ПОВРЕЖДЕНИЙ ДНК Эксцизионная репарация оснований (ЭРО) Основным механизмом удаления необъемных повреждений ДНК является ЭРО (рис. 2 и 3). Существует два основных пути ЭРО: «короткоза платочный» (short-path) и «длиннозаплаточный» (long-path). В ходе «короткозаплаточного» пути про исходит замещение только одного поврежденного ну клеотида, тогда как при «длиннозаплаточном» уда ляются 2-8 нуклеотидов [102]. Классический путь ЭРО состоит из следующих ос новных этапов: 1) удаление поврежденного азотисто го основания: узнавание повреждения и расщепле ние N-гликозидной связи с помощью специфической монофункциональной ДНК-гликозилазы с образо ванием АП-сайта; 2) гидролиз фосфодиэфирной связи у 5’-конца АП-сайта с образованием 3’-OH и 5’-2-дезоксирибозо-5-фосфата (5’-дРФ) с помощью АП-эндонуклеазы; 3) удаление 5’-дРФ и заполнение бреши с помощью спецДНКП; 4) лигирование с по мощью ДНК-лигазы (рис. 3) [7-9, 102]. ЭРО инициируется ДНК-гликозилазой. ДНК гликозилазы, обладающие только гликозилазной активностью, называются монофункциональны ми (например, урацил-ДНК-гликозилаза UNG, N-метилпурин-ДНК-гликозилаза MPG, NEIL3) [103-105]. В этом случае АП-сайт расщепля ет АП-эндонуклеаза APE1 [23, 106]. Однако ряд ДНК-гликозилаз обладают одновременно ДНК гликозилазной и АП-лиазной активностями: OGG1 (слабая АП-лиазная активность), NEIL1, NEIL2 и NTH1. Такие ДНК-гликозилазы называются би функциональными, они не только удаляют по врежденное основание, но и гидролизируют цепи ДНК с 3’-конца АП-сайта с образованием 3’-α,β ненасыщенной альдегидной группы (3’-α,β-4 гидроксипентен-2-аль) (NTH1 и OGG1) или 3’-фос фата (NEIL1 и NEIL2) [103-105]. В удалении 3’-альдегидной группы и 3’-P участвуют APE1 (3’-фосфодиэстеразная активность) и полинуклео тидкиназа/фосфатаза PNKP (3’-фосфатазная ак тивность) соответственно [107-109]. В большинстве случаев повреждения удаляются в ходе «короткозаплаточного» пути ЭРО. Важную роль в регуляции работы ферментов при этом игра ет белок XRCC1 (белок, входящий в группу компле ментации, которая обуславливает чувствительность клеток к рентгеновскому излучению), выполняющий структурную и координирующую функции [110, 111]. Однако в ряде случаев ЭРО идет по «длиннозапла точному» пути, в котором функцию координации ра боты ферментов играют белок скользящего зажима PCNA (ядерный антиген пролиферирующих клеток) и белок-«погрузчик» RFC (фактор репликации C) [112]. Механизмы выбора пути ЭРО до конца не ясны. Предположительно, «длиннозаплаточный» путь может быть выбран в S-фазе в активно делящихся клетках [113] или когда удаление 5’-дРФ затруднено (например, в случае аналогов АП-сайта). Основной ДНКП, которая осуществляет репара тивный синтез ДНК при ЭРО у млекопитающих, яв ляется Pol β X-семейства. Pol β обладает одновремен но 5’-дРФ-лиазной активностью и способна не только эффективно застраивать брешь, но и удалять 5’ дРФ, образованный после расщепления АП-сайта APE1 [114]. Три другие ДНКП, Pol λ X-семейства, Pol ι Y-семейства и Pol θ A-семейства, также обладают 5’-дРФ-лиазной активностью и, предположительно, могут участвовать в ЭРО некоторых повреждений ДНК или при снижении активности Pol β [115-118]. В «длин нозаплаточном» пути ЭРО могут принимать участие также высокоточные репликативные Pol δ и Pol ε [119]. Pol β, Pol δ или Pol ε ведут синтез с замещением цепи ДНК (strand displacement synthesis), содержащей по вреждение. В результате образуется флэп-структура из трех цепей ДНК, одна из которых имеет «свисаю щий» одноцепочечный 5’-участок, который отщепля ет «флэп»-эндонуклеаза FEN1 [120]. Сшивание цепей ДНК при «короткозаплаточном» пути осуществляет ДНК-лигаза III (LIG3α), [121], а при «длиннозаплаточ ном» - ДНК-лигаза I (LIG1) [122]. Существует более 10 разных ДНК-гликозилаз человека, которые специализируются на узнавании разных типов повреждений ДНК [103, 104]. Во многих случаях одно повреждение могут распознавать не сколько ДНК-гликозилаз. Удаление остатков урацила происходит преиму щественно в результате ЭРО с помощью монофунк циональных урацил-ДНК-гликозилаз с образовани ем АП-сайтов. У млекопитающих обнаружено пять урацил-ДНК-гликозилаз, что подчеркивает особен ную роль дезаминирования цитозина в мутагенезе и цитотоксичности. У человека известны два варианта урацил-ДНК-гликозилазы, кодируемых геном UNG: UNG1 и UNG2. Изоформы образуются в результате альтернативного сплайсинга и считывания транс криптов с альтернативных промоторов. В репарации повреждений U:A ядерной ДНК участвует UNG2, тог да как UNG1 осуществляет репарацию остатков ура цила в митохондриальной ДНК [123-125]. SMUG1 (одноцепочечная селективная моно функциональная урацил-ДНК-гликозилаза), пред положительно, является резервной урацил-ДНК гликозилазой, участвующей также в удалении 5-гидроксиметилурацила и окисленных пиримиди нов [126, 127]. UNG1 и UNG2 удаляют остатки ураци ла из одноцепочечной и двухцепочечной ДНК, тогда как SMUG1 обладает высокой активностью на одно цепочечной ДНК [128]. «Мисматч»-специфичные тимин-ДНК-гликозилаза (TDG) и метил-СрG связывающий белок 4 (MBD4) участвуют в репара ции U и Т, спаренных с G, в том числе при репарации дезаминированных N5-me-C CpG-островков, уча ствуя в деметилировании ДНК и эпигенетической регуляции работы генов [129-132]. Репарацию окисленных производных азотистых оснований осуществляют преимущественно би функциональные ДНК-гликозилазы. Основной ДНК гликозилазой, обеспечивающей репарацию 8-oxo-G в ходе ЭРО, является OGG1 [133, 134]. Существует несколько изоформ OGG1, образующихся в ре зультате альтернативного сплайсинга. Изоформа 1а обнаруживается преимущественно в ядре, тогда как изоформа 2а - в митохондриях [135, 136]. Другая ДНК-гликозилаза, NEIL1, также участвует в репа рации 8-oxo-G, хотя и обладает менее выраженной активностью [137, 138]. В репарации различных окисленных произ водных пиримидиновых нуклеотидов участвуют ДНК-гликозилазы NTH1 и NEIL1 [138-143]. NEIL2 участвует в репарации окисленных продуктов цито зина (5,6-DHU, 5-oh-U, 5-oh-C) [144]. NEIL3 может распознавать и удалять разные окисленные произ водные азотистых оснований, включая TG и Fapy пуриновые повреждения, но функции фермента еще мало изучены [145, 146]. OGG1 и NTH1 удаляют по вреждения в двухцепочечной ДНК, тогда как NEIL1, NEIL2 и NEIL3 эффективно работают на одноцепо чечных ДНК-матрицах, предположительно, уча ствуя в репарации окисленных азотистых оснований в ходе репликации и транскрипции [147-150]. В репарации алкилированных пуриновых азотистых оснований в ходе ЭРО участвует N-метилпурин-ДНК-гликозилаза MPG (также из вестная как N-алкиладенин-ДНК-гликозилаза и 3-метиладенин-ДНК-гликозилаза AAG, MAG). MPG обладает очень широкой субстратной специ фичностью, участвуя в распознавании и удалении N3-me-A, N7-me-G, N1-me-T, εА, 1,2-εG [151-155]. Кроме алкилированных азотистых оснований, MPG участвует в репарации повреждений, вызванных дезаминированием пуриновых азотистых основа ний (гипоксантина, ксантина, оксанина) [152, 153, 156, 157]. Особенности структуры активных центров ДНК-гликозилаз, влияющие на распознавание раз ных типов повреждений, рассмотрены в обзоре [104]. ЭРО в коррекции нуклеотидов, спаренных с поврежденными основаниями ДНК Интересны механизмы предотвращения возникнове ния мутаций и коррекции повреждений с помощью «мисматч»-специфичных ДНК-гликозилаз, уча ствующих в удалении неповрежденных азотистых оснований, спаренных с поврежденными нуклеоти дами. Например, MUTYH аденингликозилаза узнает аденин в паре с 8-oxo-G [158, 159]. Удаление dAMP и его замена на комплементарный dCMP предотвра щает трансверсии при последующих раундах репли кации. Процесс коррекции пары A:8-oxo-G рекон струирован in vitro с помощью MUTYH, APE1, Pol λ и ДНК-лигазы I в присутствии PCNA, RPA и FEN1 [159]. В сходном механизме удаления тимина, неком плементарно спаренного с цитозиновыми и гуанино выми основаниями, содержащими экзоциклические повреждения с этеновым кольцом, участвует ДНК гликозилаза TDG [160]. Инцизионная репарация нуклеотидов (ИРН) Альтернативным путем удаления повреждений с участием АП-эндонуклеаз является инцизионная репарация нуклеотидов (ИРН, Nucleotide Incision Repair, NIR) (рис. 2) [161, 162]. В этом процессе удаление поврежденного нуклеотида происходит без участия ДНК-гликозилаз и без образования по тенциально мутагенных промежуточных продук тов - АП-сайтов. APE1 разрезает ДНК с 5’-конца поврежденного нуклеотида, оставляя неповрежден ный 3’-конец свободным для ДНКП. Оставшийся поврежденный нуклеотид может затем удаляться «флэп»-эндонуклеазой FEN1. In vitro Pol β и LIG1 застраивают брешь и зашивают цепь ДНК [163]. Первоначально, роль ИРН была продемонстрирова на для окисленных нуклеотидов ДНК. APE1 может распознавать и участвовать в удалении TG, 5,6-ди гидропиримидинов и 5-гидроксипиримидинов [161, 164]. Недавно было показано, что ИРН может быть альтернативным путем репарации и других «необъ емных» повреждений: урацила [165], εA и εC [164]. Прямое восстановление структуры ДНК (ПВ) В удалении ряда «необъемных» повреждений так же участвуют ферменты, способные непосредствен но восстанавливать структуру азотистых оснований (рис. 2). К таким ферментам относятся диоксигеназы (окислительные деметилазы) семейства AlkB и алкил трансферазы, участвующие в репарации алкилиро ванных азотистых оснований ДНК [166]. Диоксигеназы осуществляют окислительное деметилирование по врежденных азотистых оснований, используя ката лизируемый Fe(II) механизм окисления алкильных групп молекулярным кислородом [167]. У человека об наружено восемь гомологов AlkB E. coli (ALKBH1-8). Диоксигеназы ALKBH2 и ALKBH3 играют ключевую роль в деметилировании N1-me-A, N3-me-C, εА, ал килированных оснований тимина [168-170]. O6-алкилгуанин-ДНК-трансфераза человека (AGТ или MGMT) участвует в репарации O6-me-G и O4-me-T, а также распознает и удаляет целый ряд относительно объемных алкильных групп O6 модифицированных азотистых оснований [171-173]. AGT необратимо связывает метильные группы, ис пользуя тиольную группу цистеина в качестве ак цептора (SN2-механизм реакции) [174, 175]. РЕПЛИКАЦИЯ ПОВРЕЖДЕННЫХ УЧАСТКОВ ДНК СПЕЦИАЛИЗИРОВАННЫМИ ДНК-ПОЛИМЕРАЗАМИ Далеко не все повреждения могут быть быстро уда лены из генома ферментами репарации. Большое количество нерепарированных повреждений нару шают работу высокоточных репликативных ДНКП Pol α, Pol δ и Pol ε (таблица), блокируют реплика цию, что приводит к остановке клеточного цикла, хромосомной нестабильности или гибели клеток. Важнейшим механизмом преодоления репликативного блока служит вовлечение в репликацию по врежденной ДНК спецДНКП, которые относятся к разным семействам и специализируются на ре пликации разных повреждений (рис. 2 и 4, таблица). В клетках человека ключевую роль в репликации через «необъемные» повреждения ДНК играют Pol ι, Pol η, Pol κ, Rev1 Y-семейства и Pol ζ B-семейства [176-179]. Для эффективной работы спецДНКП объединяются в мультисубъединичные комплексы (мутасомы, или транслесомы), состоящие из ДНКП и белков, выполняющих структурные и регулятор ные функции и участвующих в координации работы комплекса (рис. 4). СпецДНКП обладают активным центром, нетребовательным к структуре матрицы, и эффективно включают нуклеотиды напротив по вреждений. В то же время вследствие «толерантно сти» активного центра, использования неканониче ских водородных связей при включении нуклеотидов и отсутствия 3’-5’-корректирующей активности эти ферменты характеризуются низкой точностью син теза ДНК и сами служат источником мутаций в ор ганизме [180]. Роль Pol ι, Pol η и Pol κ в репликации поврежденной ДНК ДНКП Y-семейства Pol ι, Pol η и Pol κ - это одно субъединичные ферменты, обладающие очень низкой точностью синтеза (10-1-10-4) и низкой про цессивностью [181-186]. Pol η и Pol ι являются ДНКП-«инсертерами» (ДНКП-«инсертер» - ДНКП, которая ограничивается включением только одно го или нескольких нуклеотидов напротив повреж денного участка). Основная функция Pol η в клетке состоит в эффективной и точной репликации через фотопродукты (тимин-тиминовые циклобутановые димеры) и защите клеток от ультрафиолетового из лучения [187, 188]. Тем не менее, Pol η эффективно включает нуклеотиды напротив некоторых других «необъемных» повреждений (таблица) [82, 89, 187, 189-196]. Например, Pol η с высокой эффективно стью осуществляет синтез напротив АП-сайтов, включая dAMP и dTMP [189, 196], а также окислен ных азотистых оснований, преимущественно вклю чая корректные нуклеотиды напротив 8-oxo-G и TG, [192, 193, 195], играя важную роль в защите клеток от наиболее распространенных цитотоксичных и му тагенных повреждений. Pol ι эффективно включает нуклеотиды c разной точностью напротив целого ряда «необъемных» по вреждений ДНК: АП-сайтов [189, 196-199], урацила и его производных [200], 8-oxo-G [201], N3-me-A [190, 202], O6-me-G [203], 1,2-εG [204], εА [205, 206] (табли ца). Во многих случаях важную роль в эффективном синтезе через повреждения играет способность Pol ι к образованию неканонических водородных связей при спаривании нуклеотидов. Например, Pol ι ис пользует хугстиновские взаимодействия при вклю чении нуклеотидов напротив εА, этеновое кольцо которого делает невозможным образование уотсон криковских водородных связей [206]. Использование хугстиновских взаимодействий Pol ι показано и при включении dNMP напротив O6-me-G, метиль ная группа которого экспонирована в большую бо роздку ДНК [203]. Необычной особенностью Pol ι является преиму щественное включение dGMP напротив тимина, урацила и производных урацила в матричной ДНК [184, 185, 200, 207]. Это свойство может играть важ ную роль в снижении мутагенного потенциала де заминированных остатков цитозина и 5-me-С [200]. Включение dGMP напротив Т матричной ДНК ста билизируется уникальной водородной связью, кото рая образуется непосредственно между N2-атомом dGTP и Gln59 в активном центре Pol ι [208]. С доста точно высокой эффективностью Pol ι включает ну клеотиды напротив АП-сайтов, являясь также одной из немногих ДНКП, которая включает напротив этого повреждения преимущественно не dAMP, а dGMP или dTMP [189, 196, 198, 199]. Основной функцией Pol κ в клетке считается син тез через гуаниновые дезоксирибонуклеотиды, со держащие химические группы в положении N2, об разующиеся под действием канцерогенов. К ним относятся как крупные повреждения [209-211], так и относительно «необъемные»: 1,2-εG и 2,3-εG (таблица) [96, 212]. Pol κ также с высокой эффектив ностью и точностью осуществляет репликацию ма тричной ДНК с TG [213]. Поскольку Pol η и Pol ι не всегда могут осуще ствить удлинение праймера после включения ну клеотида напротив поврежденного основания, даль нейший синтез после поврежденных участков, в том числе от некомплементарных концов праймеров, обе спечивает ДНКП-«экстендер» (ДНКП-«экстендер» - ДНКП, которая продолжает синтез после повреж дения). В отличие от Pol η и Pol ι, Pol κ с достаточно высокой эффективностью продолжает синтез от не комплементарных концов праймеров [214, 215] и, предположительно, в ряде случаев может выполнять функцию ДНКП-«экстендера», в том числе способ ствуя закреплению мутаций. Однако ключевая роль в продолжении репликации после поврежденных участков принадлежит ДНКП В-семейства Pol ζ [197, 216]. Роль Pol ζ и Rev1 в репликации поврежденной ДНК Pol ζ состоит из четырех субъединиц: каталитиче ской Rev3 и регуляторных Rev7, p50 и p66 [217-219]. Четырехсубъединичный комплекс Pol ζ человека впервые был выделен в 2014 году [218], и исследова ния репликации через «необъемные» повреждения ДНК с участием Pol ζ еще не проведены. Препараты Pol ζ из S. cerevisiae c высокой эффективностью про должают синтез ДНК от некомплементарных концов праймеров и праймеров, спаренных с повреждения ми [215, 220]. С участием дрожжевого фермента показано так же, что Pol ζ кооперируется с Pol ι человека или Pol η дрожжей для эффективной репликации через АП сайты [215, 221], с Pol κ для высокоточной репли кации напротив TG [222] и Pol ι для эффективной репликации напротив εA [206]. В отличие от ДНКП Y-семейства, функции которых взаимозаменяемы, потеря каталитической активности Pol ζ в клетках млекопитающих является летальной, что указывает на роль Pol ζ в репликации большого числа эндоген ных повреждений ДНК [223, 224]. Предполагается, что другой белок Y-семейства, Rev1, обладает слабой ДНК-полимеразной активно стью (преимущественно включает dCMP при синтезе ДНК напротив G в матричной ДНК), но играет важ ную структурную и регуляторную роли при сборке мутасомы [177]. Rev1 одновременно содержит сайты связывания с ДНКП Y-семейства Pol ι, Pol η, Pol κ (через RIR-мотив в Pol ι, Pol η, Pol κ) [225-227] и не сколькими субъединицами Pol ζ [228-230]. Rev1 так же взаимодействует с неубиквитинилированным и моноубиквитинилированным фактором процессив ности PCNA [231, 232]. Наличие множества сайтов связывания с ДНКП и факторами репликации позво ляет координировать работу ферментов репликации и своевременно обеспечивать переключение синте за с высокоточных ДНКП на спецДНКП и с ДНКП- «инсертера» Y-семейства на процессивную Pol ζ (рис. 4). Однако детальный механизм работы мутасо мы в рамках двухполимеразной модели репликации понятен не до конца. Роль PrimPol в репликации поврежденной ДНК В 2013 году была открыта спецДНКП нового типа - праймаза-полимераза PrimPol, которая обладает одновременно ДНК-полимеразной и праймазной активностями, но отличается от Pol α-праймазы способностью к инициации синтеза ДНК с исполь зованием dNMP [233-235]. PrimPol не относится ни к одному из семейств известных ДНКП эукари от, а принадлежит AEP-семейству праймаз [236]. Нокаут гена PRIMPOL не только вызывает чув ствительность клеток к повреждениям ДНК [233], но и замедляет скорость движения репликативной вилки в отсутствие экзогенных повреждающих фак торов [237]. PrimPol эффективно включает нуклео тиды напротив некоторых «необъемных» повреж дений ДНК (например, точный синтез напротив 8-oxo-G) (таблица) [234, 238], но предполагается, что основной функцией PrimPol может быть реини циация репликации после поврежденных участков ДНК [239]. Активность PrimPol, в отличие от боль шинства ДНКП человека, не стимулируется PCNA [240], но активируется белком PolDIP2 [241]. PrimPol обнаруживается не только в ядре, но и в митохон дриях [234] и активируется митохондриальной хе ликазой Twinkle [242]. ЗАКЛЮЧЕНИЕ В ходе эволюции у живых организмов выработа лись механизмы, обеспечивающие эффективную защиту от генотоксичности повреждений ДНК. К ним относятся как механизмы удаления повреж денных оснований и восстановления первоначаль ной структуры ДНК (репарация), так и механизмы, обеспечивающие толерантность клеток к поврежде ниям ДНК без их удаления (синтез через повреж денные участки). Ключевую роль в репарации «не объемных» повреждений ДНК играют ЭРО и целый ряд ДНК-гликозилаз, обладающих субстратной специфичностью по отношению к разным типам по вреждений. В последние годы были открыты аль тернативные механизмы репарации «необъемных» повреждений ДНК (ИРН, прямое восстановление структуры ДНК с помощью диоксигеназ, APE1 независимая репарация АП-сайтов и др.). Показано, что пути репарации в клетке перекрываются и ду блируют функции друг друга. Небольшое число по вреждений, которое может оставаться в геномной ДНК, часто приводит к остановке работы высоко точных репликативных ДНКП и переключению на репликацию с участием спецДНКП. Недавно был открыт новый механизм преодоления блоков ре пликации, вызванных повреждениями ДНК - ре инициация репликации после повреждений ДНК с участием ДНК-полимеразы и праймазы PrimPol. Множественность механизмов репарации и репли кации поврежденной ДНК обеспечивает высокую защиту клеток от цитотоксического и мутагенного воз действия повреждений. Накопление «необъемных» повреждений в резуль тате нарушения работы ферментов репарации и ре пликации приводит к развитию многих заболеваний человека, прежде всего, онкологических. Связь нару шений функции ферментов репарации и репликации с болезнями человека рассмотрена в обзорах [243- 246]. Поиск эффективных способов регуляции актив ности ферментов репарации и репликации является перспективным направлением, которое может при вести к созданию новых терапевтических подходов.

Об авторах

А. В. Игнатов

Институт молекулярной генетики РАН; Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова

Email: amakarova-img@yandex.ru
Россия

K. A. Бондаренко

Институт молекулярной генетики РАН

Email: amakarova-img@yandex.ru
Россия

A. В. Макарова

Институт молекулярной генетики РАН

Автор, ответственный за переписку.
Email: amakarova-img@yandex.ru
Россия

Список литературы

Дополнительные файлы