Влияние порядка присоединения фрагментов НА2 и М2е вирусов гриппа A к флагеллину на свойства рекомбинантных белков

Полный текст

ВВЕДЕНИЕ Создание вакцин нового поколения, способных обеспечить защиту от широкого спектра вирусов гриппа А, а также от тяжелых форм гриппа А в течение по крайней мере 5 лет, является глобальной задачей. В качестве таргетных антигенов при конструировании таких вакцин рассматривают консервативные белки вируса гриппа (M2, HA2, M1, NP). В настоящее время на основе высококонсервативного эктодомена белка М2 (М2е) разработан ряд кандидатных вакцин, показана их иммуногенность и протективность у животных, безопасность и иммуногенность у человека [1-7]. Вакцины на основе М2е не относятся к профи лактическим, они не предотвращают развитие инфекции, однако снижают тяжесть заболевания, ограничивая репликацию вируса, и обеспечивают защиту от вирусов гриппа со сходной последовательностью М2е [8-11]. Защитное действие вакцин на основе М2е зависит от антител [8, 10, 12, 13]. Механизм действия анти-М2е-иммунитета обусловлен антителозависимой клеточной цитотоксичностью и антителозависимым клеточно-обусловленным фагоцитозом4. Анти-М2е-антитела в отличие от анти-НА-антител не предотвращают вирусную инфекцию и не являются нейтрализующими, но могут лизировать инфицированные вирусом гриппа клетки и тем самым ограничивать репликацию вируса [9, 11, 14]. В последнее время пристальное внимание привлекает консервативная в пределах филогенетической группы вторая субъединица НА (НА2), которая отвечает за слияние вирусной и клеточной мембраны в эндосомах, обеспечивая таким образом попадание рибонуклеинового комплекса в цитоплазму [15]. Перекрестно реагирующие моноклональные антитела, которые взаимодействуют с эпитопами, локализованными в стеблевой части НА, могут нейтрализовать вирусы гриппа в пределах филогенетической группы [16-22]. Предприняты попытки поиска наиболее перспективных эпитопов НА2 вирусов гриппа А филогенетических групп I и II (аминокислотные остатки 38-59, 23-185, 1-172, 76-103, 35-107) и конструирования рекомбинантных белков на их основе [23-27]. Исследования на животных показали, что та кие белки формируют как гуморальный, так и цитотоксический Т-клеточный ответ, они эффективно защищают от заражения летальными дозами гомо логичного и гетерологичного вирусов одной филогенетической группы. Вакцина на основе консервативных участков не скольких вирусных белков, вызывающих как гуморальный, так и Т-клеточный ответ, и нейтрализующих широкий спектр вирусных штаммов, была бы значительно более эффективной. В качестве платформы для разработки рекомбинантных вакцин на основе слабо иммуногенных анти генов против вирусных и бактериальных патогенов рассматривается флагеллин [2, 28]. Адъювантный эффект флагеллина обусловлен его способностью связываться с TLR5 на CD11c+ антигенпредставляющих клетках, что объясняет усиление иммуногенности слитых с флагеллином антигенов и способно стистимулировать CD4+ T-зависимый гуморальный ответ [28-31]. Способность флагеллина служить одновременно и платформой, и адъювантом при раз работке вакцин показана на различных моделях инфекционных заболеваний, включая грипп [2, 6, 27, 32-34]. В данной работе изучена возможность получения рекомбинантного белка на основе консервативных участков двух вирусных белков (М2 и НА), слитых с С-концом полноразмерного флагеллина. Сконструированы два рекомбинантных белка с раз личным порядком присоединения к С-концу флагеллина М2е пептидов разных субтипов вирусов гриппа А и консервативного фрагмента второй субъединицы гемагглютинина вирусов гриппа второй филогенетической группы. Рассмотрено влияние порядка присоединения таргетных антигенов к флагеллину на структуру, стабильность и иммуногенность рекомбинантных белков. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ Выбор консервативного фрагмента HA2 вирусов гриппа филогенетической группы II Аминокислотные последовательности НА2 получены из баз данных GenBank и GISAID. Для построения консенсусов последовательности выравнивали с использованием сервера MAFFT и алгоритмов FFTNS i, FFT-NS-2 (в зависимости от числа последовательностей) [35] и анализировали в программном пакете Unipro UGENE v.1.14.0 [36]. Выравнивание и анализ небольшого числа последовательностей проводили в программном пакете VectorNTI (Invitrogen, США). Поиск экспериментальных B и СD4+ T-клеточных эпитопов, гомологичных участкам НА2, проводили в базе данных Immune Epitope Database [37]. Поиск вероятных Т-клеточных эпитопов осуществляли с использованием NetCTLpan1.1 Server [38] и параметров поиска, установленных по умолчанию. Изображение трехмерной струк туры НА получали в программе UCSF Chimera v.1.9 [39] с использованием моделей 4JTV (4O5I (A/ Victoria/06/2011(H3N2)), взятых из базы данных RCSB Protein Data Bank. Визуализацию трехмерной структуры белков выполняли в программе Chimera 1.5.3 [39]. Для гомологичного моделирования трех мерной структуры белка по аминокислотной последовательности использовали открытый веб-ресурс Phyre2 [40]. Конструирование экспрессионных векторов Плазмиду pQE30 (Qiagen) использовали для конструирования векторов, обеспечивающих экспрессию белков с различным порядком присоединения таргетных антигенов. Гибридный белок Flg-4M2e-HA2 содержал флагеллин из Salmonella typhimurium (Flg), к С-концу которого были последовательно при соединены четыре копии пептида М2е (две копии консенсусной последовательности M2e вирусов гриппа человека А (M2eh) и две M2e вируса гриппа птиц A/H5N1 (M2ek)) и консенсусный фрагмент второй субъединицы (76-130) НА вирусов гриппа филогенетической группы II. Во втором гибридном белке (Flg-НА2-4M2e) к флагеллину был сначала присоединен НА2-фрагмент, а затем четыре копии пептида М2е. Химерные гены конструировали с использованием стандартных методов генной инженерии. Ген флагеллина был получен ранее с помощью ПЦР на геномной ДНК S. typhimurium и клонирован. Нуклеотидные последовательности, кодирующие консенсусную по следовательность НА2 (76-130) вирусов гриппа второй филогенетической группы и тандемные копии М2е синтезировали in vitro. Для экспрессии НА2 в клетках Escherichia coli проводили оптимизацию состава кодонов. Таким образом, были созданы век торы pQE30_Flg_HА2_4М2е и pQE30_Flg_4М2е_HA2, обеспечивающие получение соответствующих рекомбинантных белков. Экспрессия и очистка рекомбинантных белков С целью получения штаммов, продуцирующих ре комбинантные белки, клетки E. coli штамма DLT1270 трансформировали плазмидами pQE30/Flg-HA2- 4M2e и pQE30/Flg-4M2e-HA2. Штамм DLT1270, производное DH10B [41], содержит ген репрессора лак тозного оперона lacI, интегрированный в хромосому. Штаммы-продуценты накапливали в среде LB с ампициллином до середины логарифмической фазы роста (ОП600 = 0.4-0.7) при 37°C, затем добавляли IPTG до конечной концентрации 0.1 мM и культивировали в течение еще 4 ч при 37°C. Клетки обрабатывали ли зоцимом, рекомбинантные белки очищали из леточного лизата с помощью металл-аффинной хромато графии на Ni-сорбенте. Электрофорез и вестерн-блот Электрофорез в полиакриламидном геле (ЭФ в ПААГ) проводили в денатурирующих условиях по методу Лэммли [42]. Пробы смешивали с буфером для нанесения, содержащим β-меркаптоэтанол, ки пятили в течение 7 мин и наносили в градиентный 8-16% ПААГ. Электрофорез проводили в течение 1.5 ч при 10-12 мА. Гель фиксировали 10% уксус ной кислотой и окрашивали Кумасси G-250 в тече ние 18 ч. Горизонтальный перенос белков из ПААГ на нитроцеллюлозную мембрану (BioRad, США) осуществляли в TB-буфере (0.03 М глицин, 0.04 М Трис, 0.037% додецилсульфат Na, 20% этанол) с ис пользованием системы Mini Trans-Blot cell (BioRad, США) в охлаждаемой камере при +4°С в течение 1.5 ч при постоянном токе 200 мА. Затем мембрану бло кировали в 3% растворе БСА (бычий сывороточный альбумин, Amresco, ЕС) в фосфатно-солевом буфе ре (ФБР) в течение ночи при комнатной темпера туре, полосы рекомбинантных белков определяли окрашиванием мембраны мышиными моноклональными анти-М2е-антителами 14C2 (ab5416, Abcam, Великобритания). Мембрану инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре с первичными анти телами, разведенными в ФБР с 0.1% Твин 20 (ФБРТ) и 3% БСА, затем отмывали в ФБРТ. Белки выявляли окрашиванием мембраны в течение 1 ч при комнат ной температуре вторичными антителами (антимы шиные IgG козы, Abcam), меченными пероксидазой хрена и последующей инкубацией в течение 5 мин с субстратом TMB (тетраметилбензидин) Immunoblot solution (Invitrogen, США). Иммунизация мышей Мыши Ваlb/c (самки массой 16-18 г) получены из питомника «Столбовая» Научного центра биоме дицинских технологий РАМН. Животных содержа ли в виварии НИИ гриппа Минздрава России в со ответствии с действующими правилами. Мышей иммунизировали рекомбинантными белками Flg-4M2e-HA2 и Flg-НА2-4M2e интраназально (после ингаляционной анестезии 2-3% изофлюрана, 30% O2, 70% N2O) трехкратно с интервалом 2 недели в дозе 6 мкг/0.1 мл. Контрольным мышам вводили интрана зально 0.1 мл ФБР. Получение сывороток и бронхоальвеолярных лаважей Образцы крови и бронхоальвеолярные лаважи (БАЛ) получали от пяти мышей каждой группы через 2 не дели после третьей иммунизации, после эвтаназии в CO2-камере (Vet Tech Solutions, Великобритания). Для получения сыворотки кровь инкубировали в те чение 30 мин при температуре 37°С. После образо вания сгустков крови образцы помещали на поверх ность льда и охлаждали в течение 1 ч с последующим центрифугированием в течение 15 мин при 400 g. Аликвоты сыворотки крови (по 30 мкл) заморажива ли при температуре -20°С. Для получения БАЛ труп животного фиксирова ли на операционном столике брюшком кверху. Кожу разрезали по средней линии от нижней челюсти. В нижнюю часть трахеи в направлении легких вво дили катетер на глубину 3-5 мм. Дважды промывали бронхи и легкие 1 мл ФБР. БАЛ центрифугировали в течение 15 мин при 400 g, отбирали аликвоты надосадка и замораживали их при температуре -20°С. Синтетические пептиды Иммуногенность рекомбинантных белков оценивали с использованием следующих синтетических пепти дов, синтезированных НПО «Верта»: M2ek SLLTEVETPTRNEWECRCSDSSD (M2e ви руса гриппа A/Курган/05/05 (H5N1)), M2eh SLLTEVETPIRNEWGCRCNDSSD (кон сенсусная последовательность М2е вирусов гриппа А человека). Отличающиеся аминокислотные остатки выделе ны жирным шрифтом и подчеркнуты. Иммуноферментный анализ Уровни специфических IgG и IgA у мышей, иммуни зированных рекомбинантными белками, определяли в ИФА в 96-луночных планшетах с высокой сорбционной способностью (Greiner, Германия). На планше ты сорбировали М2е-пептиды (5 мкг/мл) или очи щенный вирус A/Аичи/2/68 (H3N2) (2 мкг/мл) в ФБР (рН 7.2) в течение ночи при 40С. Планшеты блокировали ФБР с 5% ЭТС (300 мкл/лунка) в течение 1 ч при комнатной тем пературе, затем планшеты отмывали 3 раза ФБР с Твин. В лунки планшетов добавляли по 100 мкл дву кратных разведений сывороток или БАЛ в блокиру ющем буфере, инкубировали в течение 1 ч при ком натной температуре. Использовали поликлональные козьи антимышиные IgG и IgA (Abcam), меченные пероксидазой хрена в разведении 1 : 20000. В каче стве субстрата использовали ТМБ (BD Bioscience, США), инкубация 15 мин. Оптическую плотность (ОП) измеряли с использованием микропланшетно го ридера i-Mark (Bio-Rad) при длине волны 450 нм. За титр принимали наибольшее разведение сыворот ки, при котором оптическая плотность по крайней мере в 2 раза превышает среднее значение бланка. Вирусы и заражение мышей В работе использован штамм, полученный из Коллекции вирусов гриппа и ОРЗ лаборатории эволюционной изменчивости вирусов гриппа НИИ гриппа Минздрава России - A/Аичи/2/68 (H3N2). Для заражения использовали вирус гриппа A/Aичи/2/68 (H3N2), адаптированный к мышам. Этот штамм получен в НИИ гриппа серией пассажей (мышь/куриный эмбрион) родительского штамма дикого типа. Адаптированный штамм A/Аичи/2/68 (H3N2) сохранял антигенные свойства исходного штамма дикого типа, но приобрел способность ле тально инфицировать мышей. Аминокислотная по следовательность поверхностных белков (M2, NA и HA) этого вируса была такой же, как у вируса гриппа дикого типа [6]. На 14-й день после послед ней иммунизации мышей Balb/c (по восемь мышей в опытных и контрольной группах) заражали адап тированным к мышам вирусом гриппа A/Аичи/2/68 (H3N2) в дозе 5LD50. Вирус вводили интраназально в объеме 50 мкл/мышь после ингаляционной анесте зии (2-3% изофлюрана, 30% O2, 70% N2O). После за ражения проводили ежедневное наблюдение за жи вотными. Протективное действие рекомбинантных белков оценивали ежедневно по динамике падения массы тела и выживаемости мышей после зараже ния. В качестве отрицательного контроля в экспери менте по летальному заражению использовали мы шей, которым вводили ФБР. Репродукция вирусов гриппа в легких Мышей (по три особи в каждой группе) интрана зально заражали вирусами гриппа A/Аичи/2/68 (H3N2), A/PR/8/34 (H1N1) и A/Курган/5/05 (H5N1) в дозе 5LD50 через 14 дней после третьей иммуниза ции. На 6-й день после заражения мышей подверга ли эвтаназии (CO2-камера для эвтаназии, Vet Tech Solutions) и асептически удаляли легкие. Легкие гомогенизировали в 2.7 мл ФБР (Tissue Lyser II homogenizer, Qiagen, США) для получения 10% (w/v) суспензии, центрифугировали в течение 15 мин при 400 g и 4°C для удаления клеточного дебриса и хранили при -20°C. Для определения титра вируса гриппа использовали культуру клеток MDCK в среде МЕМ, выращенных на 96-луночных панелях. Клетки заражали серийными десятикратными разведения ми легочного гомогената (в квадрипликатах) от 10-1 до 10-8 и инкубировали в термостате (36.0 ± 0.50С) в течение 72 ч. По окончании срока инкубации куль туральную жидкость переносили в лунки планшета для иммунологических реакций, после чего добавля ли равный объем 1% куриных эритроцитов в физио логическом растворе. Уровень репродукции вируса в лунках панели оценивали по реакции гемагглюти нации эритроцитов. Инфекционную активность ви руса рассчитывали по методу Рида и Менча. За титр вируса принимали величину, противоположную де сятичному логарифму наибольшего разведения ви руса, способного вызвать положительную реакцию гемагглютинации, и выражали в логарифмах 50% тканевой цитопатической инфекционной дозы виру са (lg ТЦИД50). Статистическая обработка Статистическую обработку проводили в программе GraphPad Prizm v6.0. Статистическую значимость различий титров антител оценивали с использова нием непараметрического критерия Манна-Уитни. Показатели выживаемости сравнивали с использо ванием критерия Мантела-Кокса. Различия считали значимыми при р < 0.05. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Анализ фрагмента НА2 (76-130) вирусов гриппа филогенетической группы II Фрагмент НА2 (76-130) представляет собой боль шую α-спираль второй субъединицы НА, частич но доступную с поверхности молекулы (рис. 1А). Консенсусные последовательности гемагглютининов вирусов гриппа филогенетической группы II (под типы Н3 и Н7) в участке HA2 (76-130) идентичны на 63.6% (рис. 1Б). С учетом замен аминокислотных остатков на близкие по свойствам гомология состав ляет 80%. Для вирусов гриппа филогенетической группы II B- и СD4+ T-клеточные эпитопы сосредо точены в первой половине участка - аминокислоты 76-103 (рис. 2А). Кроме того, участок НА2 (76-130) вирусов гриппа второй филогенетической группы со держит потенциальные CD8+ Т-клеточные эпитопы для различных аллелей HLA (рис. 2Б). Дизайн рекомбинантных белков В качестве консервативных пептидов, предназначен ных для включения в состав рекомбинантных вак цин, были выбраны: «консенсусная» последователь ность штаммов вируса гриппа А человека (M2eh), M2e вируса гриппа A/Kурган/05/200 H5N1 (M2ek), фрагмент второй субъединицы НА (76-130) вирусов гриппа филогенетической группы II (рис. 3). Были созданы химерные гены, кодирующие ги бридные белки, включающие последовательность флагеллина бактерии S. typhimurium, к С-концу которого в различных сочетаниях были присоеди нены М2е-пептид разных подтипов вируса гриппа, а также консервативные фрагменты второй субъ единицы гемагглютинина вирусов гриппа второй филогенетической группы (рис. 3). Рекомбинантный белок Flg-HА2-4M2e содержит последователь ность флагеллина, к С-концу которой присоединен фрагмент второй субъединицы (76-130) НА виру сов гриппа филогенетической группы II, за которым следуют четыре копии М2е (М2h-М2k-М2h-М2k). Белок Flg-4М2е-HА2 содержит последовательность флагеллина, к С-концу которой присоединены че тыре копии М2е (М2h-М2k-М2h-М2k) и фрагмент второй субъединицы (76-130) НА вирусов гриппа филогенетической группы II. В этих белках после довательности М2е отделены друг от друга и от НА2 глицин-богатыми линкерами. «Сборку» химерных генов из отдельных компонентов проводили непо средственно в экспрессионном векторе pQE30. Ген флагеллина без собственного стартового кодона кло нировали в сайт BamHI вектора, что обеспечивало экспрессию флагеллина с присоединенным к нему кодируемым вектором N-концевым 6His-тагом, пред назначенным для очистки рекомбинантных белков методом металл-аффинной хроматографии. Химерные гены получали с использованием стан дартных методов генной инженерии. Ген флагеллина был получен ранее с помощью ПЦР на геномной ДНК S. typhimurium и клонирован. Нуклеотидные после довательности, кодирующие НА2 и тандемные копии М2е, синтезировали in vitro. Таким образом, созданы векторы pQE30_Flg_HА2-4М2е и pQE30_ Flg_4М2е-HА2, позволяющие получать соответствующие ре комбинантные белки. Гомологичное моделирование трехмерной струк туры рекомбинантных белков Flg-HA2-4M2e и Flg-4M2e-HA2 показало сохранение α-спирализации в участке НА2 (76-130) независимо от места их при соединения к флагеллину (рис. 4). Можно предполо жить, что нативная структура этого фрагмента НА2 скорее всего сохранена, и гибридные белки способ ны стимулировать образование антител, в том числе к структурным эпитопам, характерным для натив ного НА. Однако между двумя белками существу ют некоторые различия. В случае концевого присо единения НА2 структура антигена более компактна. 3D-структура четырех копий М2е существенно различалась в двух моделях рекомбинантных бел ков. Внутренняя локализация четырех копий М2е приводила к появлению частичной α-спирализации (Flg-4M2e-HA2), не характерной для нативной кон формации М2е на поверхности вириона или инфи цированной вирусом гриппа клетке (рис. 4). Концевое расположение М2е (Flg-HA2-4M2e) в большей степе ни сохраняло нативную конформацию М2е, неструк турированную в белке М2. Подобные конформацион ные различия в структуре двух белков могут влиять на их иммуногенность. Получение и очистка рекомбинантных белков Нуклеотидные последовательности, кодирующие гибридные белки Flg-4M2e-HA2 и Flg-HA2-4M2e, были клонированы в вектор pQE30 и экспрессирова ны в штамме E. coli DLT1270 (рис. 5А). Теоретически рассчитанная молекулярная масса белков составля ла 73.9 кДа, что совпадало с величиной, определенной по их электрофоретической подвижности в ПААГ (рис. 5Б). Очищенные белки Flg-4M2e-HA2 и Flg-HA2-4M2e взаимодействовали в вестерн-блот с мо ноклональными анти-М2е-антителами 14C2 (рис. 5Б). Поскольку показано, что антитела 14C2 распознают протективный эпитоп М2е [14, 43], полученные ре зультаты подтверждают, что пептид М2е присут ствует в обоих белках. Оба рекомбинантных белка были достаточно стабильными. Не выявлено призна ков деградации белков при их хранении в течение 2 месяцев при 40С (рис. 5В). Сравнение иммуногенности рекомбинантных белков Flg-HA2-4M2e и Flg-4M2e-HA2 Иммуногенность гибридных белков Flg-HA2-4M2e и Flg-4M2e-HA2 оценивали на мышах Balb/c, имму низированных 3 раза, интраназально. На 14-й день после третьей иммунизации в сыворотках и БАЛ пяти мышей каждой группы определяли присут ствие анти-М2е- и анти-A/H3N2-антител в ИФА. Не выявлено различий в уровнях анти-M2eh- и анти- M2ek-IgG в сыворотках мышей, иммунизированных Flg-HA2-4M2e и Flg-4M2e-HA2 (p > 0.05) (рис. 6A). Но средний геометрический титр (СГТ) анти-М2е-IgG после иммунизации рекомбинантным белком Flg-HA2-4M2e был в 4-6 раз выше, чем у мышей, им мунизированных Flg-4M2e-HA2. Уровень анти-НА2-IgG к вирусу гриппа А/Аичи/2/68 (H3N2) также был значительно выше (рис. 6Б) у мышей, иммунизиро ванных Flg-HA2-4M2е (различия между двумя бел ками были статистически значимыми, р = 0.0317). Для изучения IgA- и IgG-специфического отве та на мукозальных поверхностях определяли титры M2eh- и M2ek-специфических IgA и IgG в БАЛ пяти мышей каждой группы через 14 дней после третьей иммунизации. Как показано на рис. 7, интраназаль ная иммунизация гибридным белком Flg-HA2-4M2e стимулировала более высокие уровни IgG- и IgA анти-M2e в БАЛ, чем белок Flg-4M2e-HA2 (р < 0.05). Эти результаты показывают, что гибридный белок с концевым положением М2е-пептидов (Flg-HA2-4M2e) был более иммуногенным, чем белок с вну тренней локализацией этих пептидов (Flg-4M2e-HA2). Сравнение протективных свойств рекомбинантных белков Flg-HA2-4M2e и Flg-4M2e-HA2 Для сравнения протективных свойств гибридных белков мышей (по восемь в каждой группе), имму низированных гибридными белками Flg-HA2-4M2e и Flg-4M2e-HA2, заражали вирусом гриппа А/Аичи/2/68 (H3N2) в дозе 5LD50 через 14 дней после третьей иммунизации. В качестве контроля в опы те по летальному заражению использовали мышей, которым интраназально вводили ФБР. В течение 14 дней после заражения ежедневно оценивали падение массы тела (показатель тяжести гриппозной инфек ции) и выживаемость. Из рис. 8А видно, что у мышей, иммунизированных Flg-HA2-4M2e, максимальная потеря массы тела составила 13% на 4-й день после заражения, а у мышей, иммунизированных гибрид ным белком Flg-4M2e-HA2, - 20% на 8-й день после заражения. Максимальная потеря массы тела у контрольных животных, также отмеченная на 8-й день, составила 28%. Полученные данные свидетельствуют о более легком течении инфекции у мышей, получав ших гибридный белок Flg-HA2-4M2e. Иммунизация гибридным белком Flg-HA2-4M2e обеспечивала полную защиту (рис. 8Б) от летального заражения (выживаемость 100%), тогда как выживаемость мы шей, получавших Flg-4M2e-HA2, составила 87.5%, а контрольных животных - 12.5% (статистически значимое отличие опытных групп от контрольных, р = 0.0007 и р = 0.0066, критерий Montel-Cox). Для определения титров вируса в легких через 2 недели после окончания протокола иммунизации мышей опытных и контрольной групп (по три особи каждой группы) интраназально заражали вируса ми гриппа A/PR/8/34 (H1N1), А/Аичи/2/68 (H3N2) и А/Курган/05/05 (H5N1) в дозе 5LD50. На 6-й день после заражения мышей скарифицировали для ти трования остаточного количества вирусов грип па в легких. Мы наблюдали значительное сниже ние вирусных титров в легких иммунизированных мышей по сравнению с контрольными (рис. 8В). Иммунизация мышей гибридным белком Flg-HA2-4M2e снижала титр вируса в легких на 3.7, 3.3 и 3.3 log10 при заражении вирусами гриппа A/PR/8/34 (H1N1), А/Аичи/2/68 (H3N2) и А/Курган/05/05 (H5N1) соответственно, что статистически значимо отличалось от значений в контроле (р < 0.05, крите рий Манна-Уитни). Гибридный белок Flg-4M2eh-HA2 приводил к менее выраженному снижению репродукции вирусов в легких (на 2.0, 3.2 и 2.4 log10 соответственно), однако отличия от контроля были выявлены (р < 0.05). ВЫВОДЫ Высококонсервативный эктодомен белка М2 и кон сервативные регионы второй субъединицы НА яв ляются перспективными антигенами для создания вакцин с широким протективным потенциалом. Вакцинный белок, содержащий два или более кон сервативных таргетных антигена, стимулирующих формирование различных звеньев иммунного ответа (антител с различным механизмом действия, CD4+, CD8+ Т-лимфоцитов), позволит усилить эффектив ность таких препаратов. Гибридный белок на осно ве флагеллина и консервативных фрагментов двух белков вируса гриппа (М2е и НА2 76-130) сочета ет адъювантную активность флагеллина, обуслов ленную его специфическим связыванием с TLR5, консервативность М2е среди вирусов гриппа А че ловека и птиц (формирование не нейтрализующих антител с механизмом действия, связанным с АЗКЦ) и консервативность участка стеблевой части моле кулы гемагглютинина, содержащей потенциаль ные В-клеточные (формирование нейтрализую щих и не нейтрализующих антител), а также CD4+ и CD8+ Т-клеточные эпитопы. Сконструированы два рекомбинантных белка с различным порядком присоединения к С-концу флагеллина М2е-пептидов разных подтипов вирусов гриппа А и консервативного фрагмента второй субъединицы гемагглютинина вирусов гриппа второй фи логенетической группы. Показана возможность получения стабильного рекомбинантного белка с двумя таргетными антигенами (гетерологичного М2е и НА2 (76-30)), слитыми с флагеллином. Такой белок обладает иммуногенностью, стимулирует формирование антител как к М2е, так и антител, связывающихся с НА вируса гриппа. Рекомбинантный белок защищал мышей от летального заражения и значительно снижал вирусную нагрузку в легких. Показано, что порядок расположения таргетных антигенов в рекомбинантном белке может влиять на третичную структуру рекомбинантного белка, а также на его иммуногенность и протективный эффект. Выявлены различия в уровне продукции антител двумя гибридными белками, что свидетельствует о большей иммуногенности гибридного белка с концевым положением М2е, чем белка с концевым положением НА2. Протективный эффект двух белков также различался. Белок с концевым расположением М2е приводил к полной защите животных от летального заражения вирусом гриппа A/H3N2 и быстрое восстановление их веса после небольшого снижения. Кроме того, высокую эффективность белка Flg-HA2-4M2e подтверждает также более выраженное снижение вирусной нагрузки в легких мышей по сравнению с белком Flg-4M2eh-HA2. Дальнейшие исследования будут направлены на выяснение роли каждого из таргетных антигенов в составе слитого белка в формировании протективного иммунитета, длительности его сохранения и ши роты защитного действия.

Об авторах

Л. А. Степанова

Научно-исследовательский институт гриппа Министерства здравоохранения Российской Федерации

Автор, ответственный за переписку.
Email: stepanoval60@mail.ru
Россия

Р Ю. Котляров

Институт биоинженерии, Исследовательский центр биотехнологии РАН

Email: stepanoval60@mail.ru
Россия

М. А. Шуклина

Научно-исследовательский институт гриппа Министерства здравоохранения Российской Федерации

Email: stepanoval60@mail.ru
Россия

Е. А. Блохина

Институт биоинженерии, Исследовательский центр биотехнологии РАН

Email: stepanoval60@mail.ru
Россия

М. В. Сергеева

Научно-исследовательский институт гриппа Министерства здравоохранения Российской Федерации

Email: stepanoval60@mail.ru
Россия

М. В. Потапчук

Научно-исследовательский институт гриппа Министерства здравоохранения Российской Федерации

Email: stepanoval60@mail.ru
Россия

А. А. Ковалева

Научно-исследовательский институт гриппа Министерства здравоохранения Российской Федерации

Email: stepanoval60@mail.ru
Россия

Н. В. Равин

Институт биоинженерии, Исследовательский центр биотехнологии РАН

Email: stepanoval60@mail.ru
Россия

Л. М. Цыбалова

Научно-исследовательский институт гриппа Министерства здравоохранения Российской Федерации

Email: stepanoval60@mail.ru
Россия

Список литературы

Дополнительные файлы