Поддержание стабильности генома у Heterocephalus glabe

Полный текст

Повреждения ДНК, обусловленные воздействием внешних факторов и нормальных метаболических процессов, возникают с частотой от 1000 до 1 млн на клетку живого организма в день [1]. В результате поврежденным оказывается всего 0.00017% чело веческогогенома, состоящего из 3 млрд п. н., одна ко повреждение критически важных генов (таких, как гены белков-супрессоров опухолей) может при водить к серьезным нарушениям в функционировании клеток. Эффективная работа систем репарации ДНК, противостоящих накоплению повреждений, вносит существенный вклад в поддержание стабильности генома, которое является одной из критически важных функций клетки. Накопление повреждений ДНК и мутаций увеличивает риск развития рака и связано со старением [2-4]. У человека дефекты в работе систем репарации ДНК ассоциированы с рядом генетически обусловленных заболеваний [1-4]. Кроме того, высокая консервативность путей репа рации позволяет считать эффективность работы си стем, отвечающих за удаление повреждений из ДНК, одной из основ долголетия [2-7]. Количество экспериментальных исследований, посвященных поиску корреляции между активностью систем репарации ДНК и максимальной продолжительностью жизни, невелико [8, 9]. Сложность подобных исследований и противоречивые результаты, получаемые при их проведении, могли быть следствием как несовершенства методов оценки активности, так и некорректного выбора модельных систем [10]. В качестве одной из перспективных моделей для исследования функционирования систем под держания стабильности генома, в том числе и за счет эффективной репарации повреждений ДНК, интерес представляет голый землекоп (Heterocephalus glaber). H. glaber - обитающее в норах на Юго- Востоке Африки (Эфиопия, Кения, Сомали) экстремально долго живущее мелкое млекопитающее, не многим превышающее по размерам мышь. Около 60 зоопарков мира, а также ряд лабораторий содержат колонии H. glaber. Это один из примерно 50 известных обитающих под землей травоядных грызунов, который является представителем исключительно редких истинно эусоциальных млекопитающих [11]. На фоне повышенного интереса к H. glaber журнал Science в 2013 году назвал его «позвоночным года». Продолжительность жизни H. glaber может достигать 32 лет, что в 10 раз больше, чем у мыши. Большую часть жизни (не менее 80%) это животное не имеет признаков старения и сохраняет способность к размножению [12-14], а механизмы защиты от раковых заболеваний, в том числе индуцированных [15], у него работают очень эффективно. В 2016 году впервые были зарегистрированы единичные случаи развития опухолей у содержавшихся в неволе особей [16]. H. glaber привлекает большое внимание научного со общества, вовлеченного в изучение молекулярных основ высокой продолжительности жизни и устойчивости к развитию опухолей. Заметное продвижение в этом направлении обеспечили исследования, выполненные с использованием созданных в лабораториях линий клеток H. glaber, а также биоинформатических и «омиксных» подходов [17-21]. Были открыты уникальные особенности процессов метаболизма H. glaber и их регуляции. В данном обзоре мы попытались проанализировать результаты этих исследований, а также работ, вы полненных с применением биохимических и моле кулярно-генетических подходов, с целью составить представление о возможных особенностях работы систем репарации ДНК у H. glaber. ИССЛЕДОВАНИЕ ГЕНОМА И ТРАНСКРИПТОМА H. glaber С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БИОИНФОРМАТИЧЕСКИХ ПОДХОДОВ Развитие методов высокоэффективного полногеномного секвенирования предоставило беспрецедентную возможность выявления генетических отличий H. glaber, лежащих в основе его уникальных черт. Анализ данных, полученных при первом секвенировании генома H. glaber, позволил обнаружить ряд характерных и важных особенностей, в частности, черты, говорящие о его повышенной стабильности [17]. Позже была получена и проанализирована еще одна версия генома [18] и создан web-портал Naked Mole Rat Genome Resource (http://www.nakedmolerat. org). Сравнительный анализ полных транскрип омов H. glaber и мыши выявил существенно более высокую транскрипционную активность некоторых генов H. glaber. В основном, это гены, ассоциированые с окислением-восстановлением и функциониро нием митохондрий. Обнаружено рекордное 300 и 140-кратное повышение уровня экспрессии генов Epcam и A2m, кодирующих внеклеточные белки. Уровни экспрессии генов, кодирующих белки репа рации, у мыши и H. glaber различались не столь существенно [19]. Первые результаты глубокого (98.6%) секвенирования генома самца H. glaber были опубликованы в 2011 году [17]. Тогда же появились данные о раз чиях в уровне экспрессии митохондриальных ге ов и генов, имеющих отношение к окислительно-восстановительной системе, у H. glaber и мыши [19]. На основе результатов секвенирования были пред сказаны последовательности 22000 генов H. glaber. Анализ синтеничных областей хромосом H. glaber и человека позволил идентифицировать у H. glaber 750 приобретенных и 320 утраченных генов; 739 приобретенных и 448 утраченных генов выявлено у H. glaber при сравнении с мышью. Среди приобретенных генов 75.5% транскрибируются, а список утраченных включает много генов, имеющих отношение к функционированию рибосом и путям биосинтеза нуклеозидов. Среди псевдогенов у H. glaber пре обладают гены, связанные со зрительной системой, обонянием, сперматогенезом и убиквитинированием белков [17]. Превращение этих генов в псевдогены (нефункциональные гены) коррелирует с ослабленными или подавленными у H. glaber физиологическими функциями [13] и к менее интенсивному, чем у мыши, накоплению убиквитинированных белков с возрастом [22]. С использованием GATK (Genome Analysis Toolkit, https://software.broadinstitute.org/gatk/) идентифицировано также 1.87 млн гетерозиготных одно нуклеотидных полиморфизмов (SNP). Значение ну клеотидного разнообразия составило 7 × 10-4 (среднее на нуклеотид), что гораздо ниже, чем в популяциях мыши или крысы и сравнимо с изменчивостью у чело века. Низкий уровень изменчивости может отражать низкий эффективный размер популяции H. glaber, но может быть связан с высоким уровнем инбридинга, сниженной скоростью мутаций или высокой эффективностью работы систем репарации ДНК [17]. Предполагается, что со стабильностью генома коррелирует пониженное содержание транспозонов. Согласно [17] только 25% генома H. glaber представлено повторами, происходящими из транспозонов (у человека - 40%, у мыши - 37%, у крысы - 35%). В число генов, подвергнутых действию положи тельного отбора, у землекопа, в отличие от крысы и мыши, входят Tep1 и Terf1, вовлеченные в регу ляцию длины теломер [23]. Длина теломер H. glaber невелика, они короче, чем у лабораторных мышей или крыс, и имеют примерно такую же длину, как теломеры человека. Ген Tert, кодирующий каталитиче скую субъединицу теломеразы, стабильно экспрессируется в соматических клетках H. glaber в любом возрасте. Активность теломеразы при этом невысока. В результате сравнительного исследования пришли к заключению, что между уровнями экспрессии теломеразы и размерами грызунов существует об ратная корреляция, тогда как не найдено корреляции между длиной теломер и продолжительностью жиз ни [21, 24, 25]. Недавно выполненное детальное срав нение структуры генов теломеразной РНК (hgTerс) H. glaber и других видов выявило два основных отличия. Это замена A → G в первой петле псевдоузла P2b-p3, что соответствует нуклеотиду 111 в теломе разной РНК человека, и замена G → A в домене CR7 p8b (соответствует нуклеотиду 421 hTERC). В промо торных участках гена hgTerc идентифицированы два сайта связывания факторов транскрипции: сайт взаимодействия с факторами семейства ETS, найденный в промоторных участках всех проанализированных генов, и сайт связывания фактора SOX17, уникальный для гена H. glaber. Еще одной отличительной чертой гена Terc H. glaber оказалось отсутствие одного из сайтов связывания Sp1 [26]. Таким образом, ген Terc H. glaber имеет уникальный полиморфизм и структуру промоторов. Как показали результаты секвенирования РНК, выделенных из мозга, печени и почек новорожденного, молодого (4 года) и старого (20 лет) H. glaber, лишь у малого числа генов уровень экспрессии с возрастом изменялся. В мозге человека в процессе старения падал уровень экспрессии 33 генов, а у 21, наоборот, возрастал [27]. У H. glaber уровень экспрессии 32 из этих генов не изменялся существенно с возрастом: у 30 генов он был стабильным, и только у двух генов (Cyp46a1 и Smad3) он несколько возрастал [17]. Транскрипционная активность этих генов человека с возрастом снижалась [27]. Также был выполнен биоинформатический анализ 39 генов H. glaber, кодирующих ряд белков, ассоции рованных с G1/S-переходом, термогенезом и зрением, в том числе циклин Е1 (Ccne1), белок UCP1 (Ucp1) и гамма-кристаллин (γ-crystallin), а также генов, кодирующих белки, непосредственно участвующие в процессах метаболизма ДНК: мультифункциональный белок репарации оснований AP-эндонуклеазу APE1, большую субъединицу фактора репликации/ репарации RFC1 и топоизомеразу TOP2A. TOP2A контролирует топологию ДНК во время транскрипции и наряду с TEP1 и TERF1 является частью комплекса пяти белков альтернативного пути удлинения теломер. В результате сравнения с ортологами, представленными в геномах 36 млекопитающих, в генах H. glaber были найдены отличия, говорящие о присутствии 45 уникальных замен аминокислотных остатков в соответствующих белках [17]. Таким образом, первое предпринятое секвенирование [17] позволило выявить важные особенности генома H. glaber, хотя некоторые результаты позже уточнялись и пересматривались [18, 28, 29]. Так безволосый фенотип H. glaber был объяснен замещением консервативного аминокислотного остатка в белке, ассоциированном с ростом волос (HR) [17]. Такая интерпретация была основана на том, что подобные мутации в данном кодоне приводят к потере волосяного покрова у мыши, крысы и человека. Однако два других грызуна - дамараландский пескорой и морская свинка, также содержат эту мутацию в гене Hr, но имеют волосяной покров [29]. По-видимому, различия между генами Hr H. glaber и мыши/человека скорее отражают филогенетическую дивергенцию от мыши до человека [29, 30]. Отличия в структуре HAS2 (гиалуронсинтаза 2) H. glaber связывают с исключительной устойчивостью H. glaber к раку [31]. Однако некоторые из предположительно важных мутаций, найденных в гене, кодирующем Has2, одинаковы у нескольких видов, включая морскую свинку. Эти мутации не всегда ассоциированы с онкоустойчивостью, их функциональные последствия скорее неизвестны [32]. Интересно, что высокомолекулярные гиалуронаны синтезируются также у онкоу стойчивого долгоживущего землекопа Spalax galili, однако его геном не содержит ни одной из мутаций, отнесенных к ключевым у H. glaber [33, 34]. Кроме того, под вопросом остается вывод [17] о пониженном содержании источника нестабильности - транспозонов - в геноме H. glaber по сравнению с мышью и человеком [28]. Сравнительный анализ группы генов, участвую щих в поддержании стабильности генома у человека, мыши и землекопа, показал, что для генома H. glaber не характерно повышение числа копий генов [20]. В то же время ген Cebpg, кодирующий фактор транс крипции, участвующий в регуляции процессов репа рации, представлен тремя копиями, ген Tinf2 компо нента шелтеринового комплекса - двумя. Кроме того, у H. glaber и человека, в отличие от мыши, в геноме найден ген Rpa4, кодирующий аналог второй субъединицы белка RPA, состоящего из трех субъединиц (RPA1, RPA2 и RPA3) и участвующего во многих процессах, связанных с превращениями ДНК. Ранее полноразмерные кодирующие последовательности этого гена были обнаружены только у приматов и лошади [35]. Белки RPA4 и RPA2 могут экспрессироваться одновременно, а соотношение их количества зависит от типа ткани. Гетеротример αRPA (аль тернативный RPA, содержащий субъединицу RPA4 вместо RPA2) не способен поддерживать репликацию SV40 (распространенная модель для изучения процесса репликации in vitro), но имеет повышенное сродство к поврежденной ДНК, участвует в репарации, а также в активации процесса контроля клеточного цикла (стадии G2/M) [36-38]. Возросшее качество аннотаций генома позволило по результатам следующего секвенирования идентифицировать ~1800 некодирующих, ~42000 кодирующих участков ДНК и примерно столько же белков. В результате у H. glaber выявлен ряд особенностей в последовательностях генов, связанных с противостоянием канцерогенезу и старению [18]. Выявлены уникальные замены во фрагменте гена p53, который кодирует участок, участвующий в регуляции апоптоза, и в генах рецепторов гиалуронана CD44 и HMMR. Кроме того, р53 H. glaber содержит мотивы PXXP (P - пролина, Х - любая другая аминокислота), аналогичные PXXP р53 человека. Исследование геномов и транскриптомов девяти видов африканских голых землекопов показало, что у этих видов положительной селекции подвержены гены, связанные с супрессией опухолей, регуляцией теломер, делением клеток, репарацией ДНК и ответом на воздействие стресса [30]. Современные биоинформатические подходы позволяют проводить полноценное направленное сравнение транскриптомов групп генов у различных видов животных. Известно, что печень - орган с высоким уровнем окислительного метаболизма и большим количеством спонтанно возникающих повреждений. Направленное сравнение уровней экспрессии генов, кодирующих белки репарации, в тканях печени долгоживущих видов (человека и H. glaber) и ко роткоживущей мыши было проведено в работе [39]. Сравнение выборки из 130 генов выявило более вы сокую транскрипционную активность этих генов у долгоживущих видов. Среди 12 генов, уровень экспрессии которых не менее чем в 2 раза повышен и у человека, и у H. glaber, есть и ген опухолевого супрессора p53, важнейшего регулятора эксцизионных путей репарации. Повышен уровень экспрессии генов, кодирующих белки «мисматч» репарации (MSH3) и репарации оснований - ДНК-гликозилазы (MUTYH, MBD4, NEIL1, NEIL2 и TDG), белки, участвующие в негомологичной рекомбинации (NHEJ1, Ku70, ДНК-полимеразы λ - POLL и κ - POLK), а так же убиквитинлигазу UBE2N. Большинство генов, кодирующих белки репа рации, экспрессируются конститутивно и регулируются посттранскрипционными модификациями. Тем не менее, транскрипция некоторых генов этой группы индуцируется именно при генотоксическом стрессе, в том числе генов, кодирующих ключевые белки системы эксцизионной репарации нуклеотидов (NER): DDB1, DDB2, ERCC1, XPC, ERCC4 (XPF) и ERCC5 (XPG) [40]. С использованием специализированного алгоритма для сигнальных путей [41] показано, что у долгоживущих видов на генотоксическое воздействие более интенсивно реагируют пути, контролируемые ATM, BRCA1, p53 и PTEN [39]. РАННЕЕ КОНТАКТНОЕ ТОРМОЖЕНИЕ Опубликовано большое количество результатов из учения биохимических особенностей H. glaber с целью поиска механизмов, лежащих в основе реализации необычных фенотипических признаков H. glaber, в том числе устойчивости к раку. Один из таких механизмов - уникальная система раннего контактного торможения (early contact inhibition) роста клеток H. glaber, открытая в 2009 году [31]. Контактное торможение - ключевой механизм, блокирующий деление клеток при достижении куль турой клеток плотности, при которой они начинают контактировать друг с другом или с внеклеточным матриксом [42]. У человека и мыши регулярное контактное торможение управляется мембранными белками и происходит при повышении уровня экспрессии ингибитора циклинзависимой киназы (CDK) p27Kip1. P27Kip1 связывает комплексы циклин-CDK и останавливает клетки в фазе G1 клеточного цикла. Ключевые онкосупрессорные пути, пути Rb и p53, активируются продуктами генов Ink4a и Arf [43-46]. Белок p16INK4a - продукт гена Ink4a, связывается с CDK 4/6 и ингибирует ее, что, в свою очередь, при водит к активации Rb [43]. Продукт гена Arf активирует р53, связывая и ингибируя белок MDM2. Таким образом, гены Ink4a и Arf играют критическую роль в старении и защите от рака [44-48]. Для фибробластов H. glaber не характерно ре пликативное старение, но в культуре они растут медленно и прекращают рост (деление) при низкой плотности, демонстрируя гиперчувствительность к появлению межклеточных контактов. Показано, что в этих клетках существует дополнительный механизм, контролирующий пролиферацию, на званный «ранним контактным торможением» (РКТ). Первоначально предполагалось, что РКТ у H. glaber ассоциировано, прежде всего, с повышенными уровнями белка p16INK4a [31]. Основанием для такого пред положения послужил тот факт, что в мутантных клетках H. glaber SFMut, спонтанно образующихся в процессе длительного культивирования и утративших способность к раннему контактному торможению, p16INK4a не экспрессируется. С использованием рекомбинантных ДНК (плазмид), несущих гены, кодирующие мутантные формы большого T-антигена SV40, инактивирующие либо p53 (LTK1; pSG5 LTK1), либо pRb (LTKΔ434-444, pSG5 LTΔ434-444), либо ген белка дикого типа (wtLT; pSG5 LT), кото рый подавляет активность и p53, и pRb, показано, что, в отличие от фибробластов мыши, способность фибробластов H. glaber к РКТ после трансфекциита кими ДНК снижается в том случае, когда подавлена активность обоих белков-супрессоров. Возможность стандартного контактного торможения, в котором участвует p27 Kip1, лишь дублирует РКТ, происходящее при посредстве ингибитора киназ p16INK4a [31]. Позже с использованием данных секвенирования РНК показали, что в культивируемых клетках и тканях H. glaber при экспрессии продукта альтернативного сплайсинга генов p15a, p15b и Arf локуса Ink появляется белок, названный pALTINK4a/b. У мыши и человека белок pALTINK4a/b не выявлен. Экспрессия pALTINK4a/b индуцируется при РКТ и действии стрессов, таких, как УФ- или ионизирующее излучение, потеря прикрепления к субстрату и экспрессия онкогенов. Кроме того, pALTINK4a/b более эффективно индуцирует остановку клеточного цикла, давая клеткам больше времени на то, чтобы справиться с последствиями генотоксического воз действия, в том числе на репарацию повреждений ДНК до начала репликации. Двухуровневое контакт ное торможение, характерное для клеток H. glaber (в отличие от мыши и человека), может способствовать поддержанию стабильности его генома [49] (рис. 1). ВЫСОКОМОЛЕКУЛЯРНАЯ ГИАЛУРОНОВАЯ КИСЛОТА И ОНКОТРАНСФОРМАЦИЯ КЛЕТОК H. glaber В соответствии с данными [32], раннее контактное торможение связано с сверхвысокомолекулярными (6-12 МДа) гиалуронанами (HA, hyaluronic acid), которые синтезируются в тканях и клетках H. glaber и выделяются во внеклеточное пространство. Ранее этот полисахарид был более известен как компонент внеклеточного матрикса, связанный с воспалением и раком. Фрагменты HA разной молекулярной массы выполняют разные функции: молекулы среднего размера (30-500 кДа) могут стимулировать деление клеток, а меньшего (< 50 кДа) - их миграцию. Короткие фрагменты HA связываются с рецепторами НА, такими, как CD44 и HMMR, индуцируют воспаление и активируют сигнальные пути, которые способствуют выживанию, миграции и инвазии как опухолевых, так и нормальных клеток. В нормальных биологических жидкостях человека присутствуют НА 1-8 МДа [50, 51]. У H. glaber накопление молекул со сверхвысокой молекулярной массой происходит благодаря низкой активности его гиалуронидаз и высокой процессивности гиалуро нансинтазы 2 (HAS2), обладающей особой структурой активного центра. Синтезу сверхвысокомолекулярных полимеров НА способствует замена в HAS2 остатков аспарагина в позициях 188 и 301 на серин. Нарушения в работе сигнальных путей, снимающие ограничения для начала онкотрансформации фибробластов мыши, не приводят к трансформации клеток H. glaber. Если синтез высокомолекулярной HA остановлен в результате нокдауна HAS2 или происходит быстрая деградация HA в результате повышенного уровня экспрессии гиалуронидазы, то клетки H. glaber становятся доступными для трансформации [32]. РАННЕЕ КОНТАКТНОЕ ТОРМОЖЕНИЕ И НОВЫЙ ТИП СТАРЕНИЯ В КЛЕТКАХ H. glaber - «ИНДУЦИРОВАННОЕ СУПРЕССИЕЙ Arf СТАРЕНИЕ» Открытый в 2009 году феномен раннего контактного торможения роста фибробластов H. glaber продолжает привлекать внимание исследователей. Помимо не давно обнаруженного белка pALTINK4a/b, продукта экспрессии альтернативно сплайсированной формы Ink4, участвующего в РКТ [49], был открыт еще один новый, специфичный для клеток H. glaber эффект - старение, индуцированное супрессией Arf. С использованием классических процедур клонирования и последующего секвенирования по Сэнгеру были определены кодирующие последовательности генов Ink4a и Arf H. glaber, получены лентивирусные конструкции, содержащие эти гены, и высокоспецифичные поликлональные антитела к соответствующим белкам. Было показано, что в фибробластах H. glaber после повреждающих ДНК воздействий или после серии пассажей активируется эндогенная экспрессия Ink4a и Arf [52]. Повышение уровня экспрессии Ink4a или Arf вызывало остановку клеточного цикла в фибробластах H. glaber. Таким образом, экспери ментально доказано, что консервативную функцию ингибиторов клеточного цикла у H. glaber выполня ют гены, участвующие в создании эффекта ранне го контактного ингибирования [52]. Эти результаты использовали при изучении механизмов, которые подавляют развитие опухолей из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток H. glaber (induced pluripotent stem cells, iPSCs) [53]. «Опухолеродность» iPSCs была проверена по способности формировать тератомы. Показано, что iPSCs H. glaber, подсаженные (привитые) в яички мыши, в отличие от множества других стволовых клеток, не образуют тератом, т.е. не являются опухолеродными. Это уникальное свойство базируется на видоспецифичной активации онкосупрессорного гена Arf и супрессорной мутации со сдвигом рамки считывания в экспрессируемом стволовыми клетками онкогене RAS (ERAS). Повышение уровня экспрессии гена Arf в iPSCs мыши заметно снижало их склонность к образованию опухолей. Найден связанный с клетками H. glaber механизм, который может защищать iPSCs и сома тические клетки от супрессии Arf и, как следствие, образования опухолей. Показано также, что в iPSCs H. glaber осуществляется особый тип старения - «индуцированное супрессией Arf старение» (Arf suppression-induced senescence). Специфичное для H.glaber Arf-зависимое старение может действовать как второй способ защиты, индуцирующий старение (и последующую гибель) клеток путем подавления экспрессии Arf в клетках, в которых этот ген был де репрессирован воздействием стрессоров [53]. АПОПТОЗ Апоптоз - один из механизмов сопротивления онко трансформации клеток. Способность клеток H. glaber вступать в апоптоз в ответ на генотоксические воз действия к настоящему моменту изучена недостаточно. При изучении механизма РКТ было показано, что уровень спонтанного апоптоза в фибробластах H. glaber невысок, он не превышает 7% у фибро бластов кожи и 15% - у культуры легочных фибробластов и отличается особым типом регуляции [31]. Примерно двукратное повышение количества апоптотических клеток в этих культурах происходило после трансфекции плазмидами, несущими гены, кодирующие мутантные формы большого Т-антигена SV40, pSG5 LTK1 и pSG5 LTΔ434-444. Трансфекция культур фибробластов H. glaber плазмидой pSG5 LT, несущей ген дикого типа, приводила к падению числа апоптотических клеток ниже контрольного уровня. При этом фибробласты мыши не давали выраженных ответов на такие воздействия [31]. Известно, что у мыши и человека апоптоз в той или иной степени индуцируется и при потере активности регулятора клеточного цикла pRb [54, 55]. Для выяснения механизма, который обеспечивает торможение роста фибробластов H. glaber при неактивном p53, трансфицированные (этими рекомбинантными плаз мидами) фибробласты H. glaber культивировали в присутствии ингибитора каспаз Z-Vad-FMK. Рост фибробластов, трансфицированных pSG5 LTΔ434- 444, в присутствии ингибитора апоптоза усиливался. Мутантный белок LTΔ434-444 инактивирует pRb, что нарушает механизм остановки клеточного цикла. Комбинация инактивации pRb и ингибирования апоптоза присутствием Z-Vad-FMK приводит к росту клеток до высокой плотности. Характер роста клеток, трансфицированных pSG5 LTK1, в присутствии ингибитора апоптоза не менялся. Z-Vad-FMK и LTK1 инактивируют p53, но при этом активным остается pRb, он включает остановку клеточного цикла и сдерживает пролиферацию [31]. Для устойчивых к раку слепышей Spalax (Spalax ehrenbergi, S. galili) также характерен некротический путь гибели клеток [56]. У Spalax p53 отлича ется от р53 большинства родственных млекопитающих заменой аргинина в положении 174 на лизин. Эта специфическая мутация часто обнаруживается в опухолях человека [57]. Замена аргинина на лизин влияет на свойства ДНК-связывающего домена p53. Белок, содержащий такую замену, способен индуцировать остановку клеточного цикла, но не способен инициировать апоптоз. Мутация R174K в р53 снижает его способность активировать апоптозный каскад и активирует иммуновоспалительные процессы, стимулирующие развитие некроза, индуцируемого интерфероном-бета 1 [55, 56]. Тем не менее, некротическая смерть клеток Spalax также нуждается в функционировании пути, ассоциированного с активностью р53 [57-60]. В отличие от Spalax, в позиции 174 аминокислотной последовательности р53 H. glaber, как и в p53 нормальных клеток человека и мыши, находится остаток аргинина [18]. Изучение токсических воздействий на фибробласты H. glaber показало, что эти клетки более устойчивы к метилметансульфонату, параквату и низкому содержанию глюкозы в среде, при этом более чувствительны к H2O2, ультрафиолету и ротенону, чем фибробласты мыши [61]. В другой работе было проведено сравнение апоптотического ответа культивируемых клеток артериального эндотелия H. glaber и ла бораторной мыши на воздействие окислителя (H2O2, от 10-6 до 10-3 М) и повышенной температуры (42°С). Апоптотический ответ клеток H. glaber на действие H2O2 был в 3-10 раз слабее, а их устойчивость к воз действию повышенной температуры была выше, чем у клеток мышиного эндотелия [62]. ВЫСОКАЯ ТОЧНОСТЬ ТРАНСЛЯЦИИ И РАСЩЕПЛЕННАЯ 28S рРНК Одна из важных особенностей функционирования ключевых систем H. glaber - высокая точность процесса трансляции. При близкой скорости трансляции количество ошибочно включенных аминокислот в фибробластах H. glaber в 4 раза ниже, чем в фибробластах мыши [63]. Повышение точности трансляции в H.glaber связали с тем, что расщепленная на два фрагмента 28S рРНК (так препараты 28S рРНК H. glaber выглядят при электрофоретическом анализе в денатурирующих условиях) неким образом оптимизирует укладку и/или динамику большой субъединицы рибосомы [63]. Сравнение транскриптомов ряда грызунов показало, что разрушение 28S рРНК H. glaber происходит в результате удаления фрагмента специфической последовательности, расположенной в домене D6 предшественника 28S рРНК [64]. У H. glaber и ту ко-туко (Ctenomys talarum) эти последовательности отличает высокая степень консервативности, его 28S рРНК также выглядит расщепленной, однако для ту ко-туко повышенная точность синтеза белка не характерна [64]. Известно немало видов, в РНК которых выявлено подобное расщепление, что никак не коррелировало с продолжительностью их жизни. Неясно также, действительно ли 28S рРНК расщепляется в результате специфического сплайсинга, а фрагменты объединены в одну структуру только водородными связями, или расщепление - артефакт, возникающий при воздействии высокой температуры при выделении или анализе РНК [65-69]. Объяснение необычно высокой точности трансляции в H. glaber особенностью структуры 28S рРНК представляется, таким образом, спорным. Высокая точность процесса синтеза белков, безусловно, вносит вклад в стабильность протеома H. glaber, однако особенности молекулярных механизмов, ее определяющих, только предстоит изучить. В частности, у H. glaber совершенно не изучена первая стадия трансляции - аминоацилирование тРНК, которая в значительной степени определяет точность белкового синтеза [70]. ОКИСЛИТЕЛЬНЫЕ ПОВРЕЖДЕНИЯ И СТАБИЛЬНОСТЬ СТРУКТУРЫ БЕЛКОВ Теория окислительного стресса рассматривает накопление в клетке окислительных повреждений (ОП) как один из факторов старения. По этой причине внимание исследователей привлекает вопрос о содержании ОП и особенностях механизмов антиоксидантной защиты у «долгожителя» H. glaber. Одна из главных мишеней, в которых возникают ОП, это белки. Окислительные воздействия могут приводить к нарушению структуры и функций белков, в частности, инактивировать ферменты и способствовать образованию белковых агрегатов, содержащих ковалентные сшивки. Высокой чувствительностью к окислению отличаются SH-группы цистеина, способные формировать как обратимые (дисульфид S-S, сульфеновая кислота), так и необратимые повреждения (сульфиновая и сульфоновая кислоты) [22]. Другой распространенный тип ОП белков - карбонилирование, необратимая модификация боковых цепей остатков пролина, аргинина, лизина, треонина, цистеина и гистидина [71]. В качестве модельных систем для изучения ОП белков используют, в основном, лизаты тканей раз личных органов H. glaber и лабораторных мышей соответствующего физиологического возраста [22, 72-76]. Изучено содержание ОП цистеина и уровень карбонилирования, белков, а также влияние ОП на структуру и функционирование белков, а также активность ряда ферментов, участвующих в противостоянии накоплению окислительных повреждений. Сравнение активности глутатионсинтетазы, ката лазы, супероксиддисмутаз и глутатионпероксидазы (GPX1) показало, что в экстракте из печени молодой особи H. glaber активность всех ферментов, кроме GPX1, в 1.3-2 раза выше, чем в экстракте из печени мыши C57BL/6 соответствующего физиологического возраста. Активность GPX1 в экстракте H. glaber оказалась почти на порядок ниже [72]. В соответствии с более поздними данными у H. glaber резко снижен также уровень мРНК Gpx1 и содержание соответствующего белка [19, 73]. Согласно [22], белки молодого H. glaber содержат в 1.6 раза больше как свободных SH-групп, так и обратимых ОП, таких, как S-S и сульфеновые произ водные цистеина, чем белки мыши (C57BL/6). Кроме того, у мышей количество ОП цистеина с возрастом возрастает в 3.4 раза, растет количество необратимых ОП цистеина и карбонильных повреждений, в то время как у H. glaber такие изменения отсутствуют [22, 72-76]. Это указывает на более эффективную работу противостоящих окислительному стрессу систем у H. glaber. Анализ уровней карбонилирования белков в тканях H. glaber и мыши показал, что во всех образцах основными мишенями карбонилирования являются триозофосфатизомераза (TPI) и пероксиредоксин 1 (Prdx1). Белки H. glaber содержат в 1.5 раза больше карбонильных повреждений, но при этом лучше сохраняют ферментативную активность. Удельная активность TPI в цитозольной фракциилизата ткани почки H. glaber была в 3 раза выше, чем у мыши. Кроме того, при действии окислительного стресса (аскорбат/Fe2+) TPI и Prdx1 H. glaber формируют меньше ковалентно сшитых белковых олигомеров [73, 74]. С использованием 4,4’-дианилино-1,1’-бинафтил- 5,5’-дисульфоновой кислоты (BisANS) в качестве неполярного флуоресцентного зонда, взаимодействующего с гидрофобными остатками аминокислот на поверхности белковых глобул, показано, что белки H. glaber гораздо более устойчивы к денатурирующему воздействию 1 М мочевины, чем белки мыши. В частности, глицеральдегидфосфат-дегидрогена за (GAPDH), в активный центр которой входят SH группы, у H. glaber сохраняет 60% активности, в отличие от 10% у GAPDH мыши [22]. Сравнение распределения карбонилированных белков по субклеточным фракциям у долгоживущих, в том числе и H. glaber, и короткоживущих млекопитающих показало, что в ядре у долгоживущих животных, в отличие от короткоживущих, относительное содержание белков с ОП ниже, чем в цитоплазме [9, 76]. Это позволило предположить существование обратной корреляции между уровнем окислительных повреждений ядерных белков и продолжительностью жизни [76]. Однако детально это не изучено. Данные о содержании повреждений в белках, участвующих в процессе репарации ДНК, отсутствуют. Результаты оценок, которые не различают типов повреждений или поврежденных молекул (белков, ДНК), происходящих из различных клеточных компартментов, могут маскировать истинную картину. Затрудняет анализ данных и путаница в названиях методов и препаратов, используемых в различных публикациях. Одной из причин противоречий может быть то, что высокий уровень ОП характерен только для определенных молекул (классов молекул) и/или компартментов клетки [76]. Кроме того, существуют противоречивые данные, касающиеся антиоксидантного статуса. Так, содержание GSH в тканях H. glaber в одной работе оценено как в 1.4 раза более низкое [77], в другой - как в 1.4 раза более высокое [22], чем у мыши. Такие противоречия не позволяют сравнивать антиоксидантный статус этих организмов. Кроме того, на результаты экспериментов с использованием экстрактов тканей органов, а также биологических жидкостей H. glaber может влиять феномен его эусоциальности [78]. УБИКВИТИН-ПРОТЕАСОМНАЯ СИСТЕМА И УНИВЕРСАЛЬНЫЙ ИНГИБИТОР ПРОТЕАЗ - АЛЬФА- 2-МАКРОГЛОБУЛИН Важную роль в поддержании содержания в клетке нужного количества активных белков правильной структуры (протеостаза) играет убиквитин-протеа сомная система [79]. Оценка протеолитической активности в сочетании с результатами вестерн-блот-анализа выявила более высокую химотрипсин-подобную (chymotrypsin like, ChT-L) и трипсин-подобную (trypsine-like, TL) про теазную активность 26S и 20S протеасом в экстрактах ткани печени H. glaber. Показано, что удельная ChT-L активность протеасом H. glaber в 3-5 раз выше, чем у протеасом мыши [80]. Основная часть этой активности обеспечивается работой 26S протеасом. Кроме того, известно, что 20S протеасомы могут осуществлять убиквитин независимый гидролиз белков, со держащих ОП, например карбонилированных белков [79]. Это может способствовать поддержанию стабиль ной работы протеома H. glaber, уровень убиквитинирования белков которого невысок и не увеличивается с возрастом. Содержание 19S регуляторных субъединиц и каталитических субъединиц иммунопротеасом (β5i и β2i) у H. glaber также выше, чем у мыши [80]. Кроме того, у H. glaber выше базовый уровень экспрес сии ключевых шаперонов: HSP72, HSP40 и HSP25. Два из этих шаперонов входят в состав так называемого цитозольного фактора, который защищает протеа сомы от ингибиторов и увеличивает эффективность их работы [81]. Наблюдаемое у H. glaber увеличение пептидазной активности и участие шаперонов в за щите протеасом от действия ингибиторов не относят ся к ранее известным функциям шаперонов. Все это может отражать высокий уровень контроля качества протеома у H. glaber. С поддержанием протеостаза связан и много функциональный белок плазмы крови - альфа-2 макроглобулин (A2m). Известно, что А2m человека способен связывать различные цитокины, факторы роста (TGF-β1, TNF-α, IL-1β) и является универсальным ингибитором протеиназ (трипсина, химотрипсина, эластазы и металлопротеиназ). Связывание A2m-протеиназных комплексов с рецептором LRP1 (CD91) запускает их быстрое удаление из крови и тканей путем рецепторзависимого эндоцитоза. Предполагается, что этот белок обладает функцией шаперона, предотвращающего агрегацию белков, а также способствует удержанию в клетках цинка, снижение концентрации которого с возрастом сопровождается развитием ряда заболеваний у человека [82-85]. Уровень транскрипции гена, кодирующего Α2m в печени H. glaber, повышен в 140 раз по срав нению с уровнем в печени мыши [19]. Концентрация белка A2m в плазме крови H. glaber в 2-3 раза выше, чем в плазме крови человека. Вероятно, с этим связана протеолитическая активность плазмы крови H. glaber, пониженная по сравнению с активностью в плазме крови человека [86]. Еще одна важная особенность H. glaber - постоянная активность сигнального пути, регулируемого фактором Nrf2, который активирует транскрипцию более 200 генов, принимающих участие в антиоксидантном и противовоспалительном ответе организма на эндогенные и экзогенные воздействия [87]. ЗАКЛЮЧЕНИЕ: СТАБИЛЬНЫЙ ГЕНОМ, СТАБИЛЬНЫЙ УРОВЕНЬ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ, СТАБИЛЬНЫЙ ПРОТЕОМ, ЭФФЕКТИВНАЯ РЕПАРАЦИЯ ДНК Одной из основ поддержания стабильности генома считается эффективная работа систем репарации ДНК. К характерным особенностям генома H. glaber относятся повышенная стабильность его структуры и функционирования, которые сохраняются на протяжении всей жизни. Стабильностью отличается и его белковая система (протеом). Высокая точность трансляции, повышенный уровень экспрессии ключевых шаперонов и постоянно активные протеасомы в сочетании с высоким уровнем экспрессии A2m способствуют поддержанию в клетках H. glaber пула эффективно функционирующих бел ков. Экспериментально доказана устойчивость ряда белков H. glaber к денатурирующим воздействиям и их способность сохранять функциональную активность в условиях постоянного окислительного стресса. Все это, а также повышенный уровень экспрессии ряда генов, кодирующих белки репарации, и интенсивность ответа сигнальных путей на по вреждение позволяют предполагать, что эффективность работы систем репарации ДНК у H. glaber должна быть высока. С таким предположением согласуются, в частности, результаты исследований, в которых были использованы клетки млекопитающих с различной продолжительностью жизни. Скорость УФ-индуцированного синтеза ДНК в фибробластах долгоживущего белоногого (оленьего) хомячка (Peromyscus leucopus) была в 2.5 раза выше, чем скорость синтеза ДНК в фибробластах мыши (Mus musculus) [8]. В фибробластах мутантной мы ши-долгожителя (Snell dwarf mice) удаление УФ повреждений происходит более эффективно, чем в фибробластах мыши с нормальной продолжительностью жизни [9]. Cравнение активности поли(ADP рибоза)-полимераз (PARP) в моноядерных лейкоцитах крови 13 видов млекопитающих выявило положительную корреляцию между уровнем активности PARP и максимальной продолжительностью жизни, характерной для этих млекопитающих. В частности, активность PARP в клетках человека была в 5 раз выше, чем в клетках крысы. При этом содержание соответствующего белка не отличалось, а отсутствие в условиях эксперимента значимой видоспецифичной деградации полимера поли(ADP-рибозы) позволило исключить искажение результатов оценки активности PARP вследствие работы PARG (поли(ADP-рибоза)-гликогидролаза). Высказано предположение, что более высокая способность к поли(ADP-рибозил)ированию может вносить вклад в эффективное поддержание целостности и стабильности геномов долгоживущих видов [88]. Вполне вероятно, что активность процессов поли(ADP-рибозил)ирования, регулирующего раз личные механизмы репарации [89], повышена и у экстремально долгоживущего H. glaber, однако экспериментальные доказательства этого факта на сегодняшний день отсутствуют. Очевидно, что в основе уникальных фенотипических характеристик H. glaber [90] лежат особенности устройства и регуляции работы его генома и протеома. Для изучения этих особенностей используются модельные системы различной степени сложности с использованием все более широкого набора методов [91]. Недавно в исследовании, проведенном с использованием фибробластов 16 видов млекопитающих, было показано, что для долгоживущих млекопитающих характерен повышенный уровень экспрессии генов, кодирующих белки, имеющие отношение к репарации ДНК [92]. Моделирование и анализ стабильности генных сетей, связывающих возраст, устойчивость к стрессу и замедленное физиологическое старение, показали, что стабильность простейшей модельной генной сети резко возрастает при введении в расчеты такого параметра, как «эффективная репарация». Кроме того, согласно результатам моделирования, вклады в стабильность генной сети процессов репарации ДНК и процессов, обеспечивающих присутствие в клетке эффективно функционирующих белков («поддержание протеостазиса», «репарация протеома»), в равной степени существенны, а сами эти процессы взаимосвязаны [7]. Можно, таким образом, полагать, что молекулярные «машины», противостоящие накоплению повреждений в геноме H. glaber, включая механизмы репарации ДНК, функционируют с высокой эффективностью. Мы попытались проиллюстрировать этот вывод схемой, представленной на рис. 2. Однако отсутствие исследований процесса индукции апоптоза при различных генотоксических воздействиях и экспериментальных данных о работе систем репарации ДНК образует своего рода белое пятно в знаниях о реальном вкладе этих процессов в долголетие и он корезистентность H. glaber. Сравнительная оценка функциональной активности систем репарации ДНК представляется в этой связи весьма важной и актуальной задачей.

Об авторах

И. O. Петрусева

Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН

Email: lavrik@niboch.nsc.ru
Россия

A. Н. Евдокимов

Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН

Email: lavrik@niboch.nsc.ru
Россия

O. И. Лаврик

Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН; Новосибирский национальный исследовательский государственный университет Министерства образования и науки РФ; Алтайский государственный университет Министерства образования и науки РФ

Автор, ответственный за переписку.
Email: lavrik@niboch.nsc.ru
Россия

Список литературы

Дополнительные файлы