Вклад рибосомного белка S1 в структуру и функцию Qβ-репликазы

Полный текст

ВВЕДЕНИЕ Находящийся на малой (30S) субчастице белок S1 не только является самым большим белком рибосомы Escherichia coli, но и имеет необычную структуру [1]. В то время как другие рибосомные белки формируют компактные глобулы [2, 3], белок S1 представляет собой гибкую цепь [4, 5], почти такую же длинную, как рибосома [1], и состоящую из шести структурно подобных звеньев [6], называемых OB-доменами (от Oligonucleotide/oligosaccharide Binding [7]). Белок S1 жизненно важен для клетки, так как делеции или амбер-мутации его гена rpsA являются летальными [8, 9]. Однако точная функция белка S1 в рибосоме до сих пор не известна; не известно и то, как расположены в рибосоме его структурные звенья. Известно лишь, что N-концевой сегмент белка взаимодействует с белком S2, находящимся между головкой и платформой 30S субчастицы [10]. Не по могло прояснить ситуацию и решение кристаллической структуры рибосомы, так как удалось закристаллизовать лишь рибосомы, полностью лишенные белка S1 [3]. По-видимому, этот белок, не имеющий фиксированной конфигурации, мешает кристаллизации рибосом. Не вызывает сомнений, что обладающий выраженными РНК-связывающими свойствами белок S1 важен для инициации трансляции [1, 11]. Но не менее очевидно и то, что стадией инициации участие белка S1 в трансляции не ограничивается, так как, в отличие от факторов инициации, белок S1 присутствует в рибосоме в стехиометрических количествах и остается связанным с рибосомой во время элонгации синтезируемого полипептида [1]. Помимо собственно синтеза белка, белок S1 участвует в других процессах, происходящих в клетке - как на рибосоме, так и вне ее [11]. Одна из наиболее известных внерибосомных функций белка S1 - участие в синтезе РНК в виде α-субъединицы Qβ-репликазы, РНК-зависимой-РНК-полимеразы бактериофага Qβ. Помимо белка S1, Qβ-репликаза содержит кодируемую геномом фага каталитическую β-субъединицу, а также факторы элонгации трансляции EF-Tu и EF-Ts (γ- и δ-субъединицы со ответственно) [12]. Субъединицы β, γ и δ составляют кор Qβ-репликазы, с которым белок S1 связан относительно слабо (как и с рибосомой [1]) и частично диссоциирует в процессе выделения фермента [13]. Исследование белка S1 в составе Qβ-репликазы дало в последние годы результаты, позволяющие существенно продвинуться в понимании структуры и функции этого белка. Эти результаты и являются предметом настоящего обзора. ДОМЕННАЯ СТРУКТУРА БЕЛКА S1 «Классический» ОВ-домен состоит из ≈70 аминокислотных остатков и представляет собой «бочонок», образованный пятью уложенными в виде греческого ключа β-тяжами и обычно прикрытый α-спиралью [7, 14]. ОВ-домены присутствуют в структуре многих белков, способных связывать полинуклеотиды и полисахариды [15]. Анализ аминокислотной после довательности [6] позволил сделать вывод, что в белке S1 присутствует шесть ОВ-доменов (рисунок). Последующие структурные исследования подтвердили этот вывод с одним уточнением: N-концевой ОВ-домен (ОВ1) содержит не пять, а четыре β-тяжа [10, 16-18]. Название ОВ-домена предполагает, что он дол жен обладать сродством к полинуклеотидам. Действительно, показано, что домены ОВ3-ОВ6 обладают РНК-связывающими свойствами [1, 16, 19]. В то же время считалось, что домены ОВ1 и ОВ2 не способны связывать РНК, а вовлечены в белок белковые взаимодействия, обеспечивающие связывание белка S1 с рибосомой и кором Qβ-репликазы [1]. Недавно было показано, что домены ОВ1 и ОВ2 действительно образуют контакты с кором Qβ репликазы [17, 18]. Кроме того, домен ОВ2 способен взаимодействовать с РНК благодаря высокой концентрации положительно заряженных остатков на участке поверхности, не вовлеченной в белок-белковые взаимодействия [18]. Таким образом, все пять классических ОВ-доменов белка S1 обладают РНК связывающими свойствами. Особая роль принадлежит N-концевому сегменту, предшествующему домену ОВ1 и состоящему из 20 аминокислотных остатков. В несвязанном состоянии этот сегмент не имеет структуры [20], однако при обретает α-спиральную конфигурацию при взаимодействии с рибосомным белком S2 [10] и с кором Qβ репликазы [17, 18], причем в последнем случае эта спираль на виток длиннее. По-видимому, N-концевая α-спираль вносит основной вклад во взаимодействие белка S1 с рибосомой [19]. Она также важна для взаимодействия белка S1 с кором Qβ-репликазы. Это следует как из кристаллографических данных [17, 18], так и из экспериментов по гель-фильтрации белковых комплексов. Оказалось, что выход комплекса белка S1 или его фрагмента с кором Qβ-репликазы резко падает, если эта спираль удалена (З.Ш. Кутлубаева, П. Северин и А.Б. Четверин, неопубликованные данные). БЕЛОК S1 КАК ФАКТОР ТЕРМИНАЦИИ РЕПЛИКАЦИИ РНК Qβ-репликаза знаменита своей уникальной способ ностью быстро размножать РНК. Подобно ПЦР, ре акция имеет экспоненциальную кинетику: и исход ная матрица, и ее комплементарная копия служат матрицами в следующем цикле репликации; благо даря этому число матриц возрастает в каждом цикле вдвое до тех пор, пока репликаза остается в моляр ном избытке. Однако эта реакция, в отличие от ПЦР, изотермична: нет надобности повышать температуру для расплавления дуплекса, так как непосредствен ным продуктом реакции является одноцепочечная РНК. Как Qβ-репликазе удается осуществлять копирование РНК по принципу комплементарности, но сохранять матрицу и растущую цепь одноцепочечными, остается одной из неразрешенных загадок репликации фага Qβ [12]. В 1972 году Ч. Вайссманн и сотр. опубликовали работу [21], в которой утверждалось, что белок S1 ну жен Qβ-репликазе только для инициации копирования геномной (плюс) цепи РНК фага Qβ и не нужен для копирования других матриц репликазы, в том числе минус-цепи Qβ РНК и малых реплицирующихся РНК («6S» или RQ РНК, от Replicable by Qβ replicase). Вскоре первый автор этой работы опубликовал обзор, в котором, ссылаясь на свои неопубликованные результаты, утверждал, что белок S1 не нужен также и на стадиях элонгации и терминации минус цепи, образующейся при копировании плюс-цепи Qβ РНК [22]. Этот взгляд на роль белка S1 в репликации РНК продержался в течение последующих 40 лет. Свои результаты Вайссманн и сотр. получили в условиях, когда концентрации Qβ-репликазы и матрицы были близки, и экспоненциальный синтез РНК был невозможен. Мы обнаружили, что совсем другой результат получается в условиях большого избытка репликазы. Оказалось, что при этом белок S1 много кратно стимулирует репликацию не только Qβ РНК, но и RQ РНК. Выяснилось, что в присутствии белка S1 бóльшая часть продукта представлена одноцепочечной РНК, тогда как в его отсутствие - двухцепочечной [23]. Создавалось впечатление, что белок S1 помогает репликазе поддерживать одноцепочечное состояние матрицы и растущей цепи РНК благодаря известной способности связывать одиночные цепи РНК и расплавлять дуплексы [24]. Чтобы проверить это предположение, мы исследовали состояние РНК в процессе элонгации в присутствии и в отсутствие белка S1. В качестве матрицы использовали плюс-цепь Qβ РНК длиной 4217 нуклеотидов, копирование которой при 30°C занимает около 4 мин. Чтобы исключить завышение количества двухцепочечной РНК в результате ее образования при денатурации репликативного комплекса [25], со стояние РНК определяли до стадии фенольной экстракции как РНК, устойчивую к рибонуклеазе Т1. Оказалось, что как в присутствии, так и в отсутствие белка S1 синтезируемая цепь остается одноцепочечной в течение всей элонгации и даже некоторое время по ее завершении. Однако если в присутствии белка S1 наблюдали быстрый выход одноцепочечного полноразмерного продукта из репликативного комплекса, то в отсутствие белка S1 синтезированная цепь оставалась связанной с репликативным комплексом. Со временем меньшая ее часть спонтанно покидала комплекс в одноцепочечном состоянии, а бóльшая часть образовывала дуплекс с матрицей и приобретала устойчивость к рибонуклеазе [23]. Этот результат показал, что белок S1 катализирует выход одноцепочечного продукта из активного центра Qβ-репликазы. Иными словами, он выполняет функцию фактора терминации. По-видимому, эту функцию белок S1 выполняет при размножении любой законной матрицы [26] Qβ-репликазы. В результате, как исходная матрица, так и ее комплементарная копия оказываются доступными для копирования в следующем цикле репликации, что создает условия для экспоненциального размножения РНК. ДВЕ ФУНКЦИИ БЕЛКА S1 ИМЕЮТ РАЗНУЮ СТРУКТУРНУЮ ОСНОВУ Таким образом, белок S1 выполняет при репликации Qβ РНК две функции: функцию фактора терминации, общую для всех законных матриц, и ранее представлявшуюся единственной, специальную функцию, выполняемую только при инициации на плюс-цепи. Проведенное нами прямое исследование скорости инициации на плюс-цепи Qβ РНК показало, что потребность в белке S1 не является абсолютной. В буфере с низкой концентрацией соли (50 мМ NaCl) инициация в отсутствие белка S1 происходит почти так же хорошо, как и в его присутствии. Однако до бавление 50 мМ (NH4)2SO4 приводит к практически полному подавлению инициации в отсутствие белка S1 и только к двукратному торможению в его присутствии (инициация на других законных матрицах подавляется приблизительно вдвое независимо от присутствия белка S1) [23]. Таким же эффектом обладает добавление 100 мМ любого другого одно валентного катиона независимо от природы аниона (З.Ш. Кутлубаева, Е.В. Четверина и А.Б. Четверин, неопубликованные данные). В силу сказанного, функцию белка S1 на стадии инициации мы называем антисолевой. По-видимому, при размножении фага Qβ в клетках E. coli антисолевая функция используется наряду с терминационной, так как цито плазматическая концентрация одновалентных катионов даже превышает 150 мМ [27]. Чтобы выяснить, все ли домены белка S1 необходимы для выполнения его функций, мы клонировали и очистили фрагменты белка S1, содержащие разное число ОВ-доменов, начиная с N-конца (рисунок). Оказалось, что фрагмент ОВ1-2 может заменить белок S1 на стадии терминации, а фрагмент ОВ1-3 - в защи те стадии инициации от соли [23]. СТРУКТУРА КОМПЛЕКСОВ КОРА Qβ-РЕПЛИКАЗЫ С ФУНКЦИОНАЛЬНЫМИ ФРАГМЕНТАМИ БЕЛКА S1 Как и при исследовании рибосомы, отсутствие у белка S1 фиксированной конформации не по зволяло получить кристаллы холофермента Qβ репликазы. Эту проблему удалось преодолеть после того, как обнаружили, что относительно короткие (и, следовательно, менее гибкие) фрагменты способны заменять белок S1 во всех его функциях [23]. Ранее две команды (датско-российская и японская) не зависимо друг от друга решили кристаллическую структуру кора Qβ-репликазы [28, 29]. Недавно те же команды независимо решили структуру ком плекса, содержащего кор репликазы и два первых ОВ-домена белка S1 [17, 18, 30]. Хотя японская ко манда исследовала кристаллы комплекса кора ре пликазы с фрагментом ОВ1-3 [17], а датско-россий ская - с фрагментом ОВ1-2 [18], в обоих случаях была получена равноценная структурная информа ция, так как третий ОВ-домен не виден, поскольку не фиксирован в структуре комплекса [17]. Помимо вклада в понимание механизма репликации РНК, эти работы интересны тем, что впервые установлена кристаллическая структура 1/3 молекулы рибосомного белка S1, причем именно той ее части, структура которой была наименее изучена. Связывание доменов ОВ1 и ОВ2 почти не влияет на структуру кора Qβ-репликазы. Эти домены взаимодействуют с β-субъединицей в районе домена «пальцев», который участвует в формировании активного центра репликазы, связывании РНК и раз ведении комплементарных цепей репликативного комплекса [28, 31]. N-Концевая α-спираль белка S1 находится между доменами ОВ1 и ОВ2 и образует ряд контактов с β-субъединицей и EF-Tu [18]. Эти кон такты аналогичны тем, которые та же спираль образует с рибосомным белком S2 [10]. Хотя две группы исследователей приводят почти идентичные структурные данные [17, 18], они дела ют несколько разные выводы. Так, японская группа утверждает, что домены ОВ1 и ОВ2 не имеют на своей поверхности положительно заряженных и гидрофобных аминокислотных остатков, способных образовывать связи с фосфатами и азотистыми основаниями РНК, и поэтому не могут взаимодействовать с РНК [17]. Другая группа, напротив, указывает на существование протяженного участка поверхности доме на ОВ2, несущего положительный заряд, и с помощью ЯМР выявляет способность этого домена связывать РНК [18]. ВКЛАД БЕЛКА S1 В ИНИЦИАЦИЮ РЕПЛИКАЦИИ РНК Эта функция аналогична той, которой обычно наделяют белок S1, рассматривая его роль в трансляции. Разница в том, что, стимулируя инициацию трансляции подавляющего большинства мРНК [1, 11], белок S1 стимулирует инициацию репликации только одной из многих матриц Qβ-репликазы. В отличие от других матриц, инициация на плюс-цепи Qβ РНК требует, чтобы репликаза связалась не только с 3’-концом, с которого начинается ее считывание, но и с «М-сайтом» - внутренним участком, отстоящим от 3’-конца матрицы на ≈1500 нуклеотидов. В отсутствие белка S1 репликаза не может связаться с М-сайтом [32]. По-видимому, белок S1 стимулирует инициацию на плюс-цепи Qβ РНК, повышая сродство репликазы к М-сайту. В пользу этого говорит и тот факт, что инициация становится чувствительной к повышенной концентрации соли как в отсутствие белка S1 [23], так и в его присутствии при наличии определенных мутаций в М-сайте [33]. Способность фрагмента ОВ1-3, но не ОВ1-2 заменять белок S1 в антисолевой функции означает, что третий ОВ-домен играет основную роль во взаимодействии с М-сайтом, а домены ОВ1 и ОВ2 нужны постольку, поскольку они формируют связь между доменом ОВ3 и кором ре пликазы. ВКЛАД БЕЛКА S1 В ТЕРМИНАЦИЮ РЕПЛИКАЦИИ РНК Японская группа предложила механизм действия белка S1, в котором ключевая роль в инициации и терминации принадлежит подвижному домену ОВ3, взаимодействующему на стадии инициации с М-сайтом плюс-цепи Qβ РНК, а на стадии терминации - с новосинтезированной цепью РНК [17, 34]. Хотя при этом авторы цитируют нашу статью [23], читали они ее, как видно, невнимательно, поскольку там прямо показано, что на стадии терминации белок S1 может быть заменен фрагментом ОВ1-2, в котором домен ОВ3 отсутствует, а следовательно, играть решающую роль не может (как, впрочем, не заметили они и того факта, что в той же статье на полтора года раньше них продемонстрирована решающая роль до мена ОВ3 на стадии инициации). В датско-российской работе показано, что область с высокой плотностью положительного заряда доме на ОВ2 непосредственно примыкает к подобной же области на поверхности β-субъединицы и образует с ней непрерывный положительно заряженный тракт, ведущий от отверстия, предназначенного для выхода синтезированной цепи из активного центра [18]. Вероятно, этот тракт существен для выхода синтезированной цепи из репликативного комплекса. Однако детальный механизм терминации предлагать еще рано, так как терминация осуществляется в составе закрытой конформации Qβ-репликазы [26], тогда как структура комплекса кора с фрагментом ОВ1-2 решена для открытой конформации. В этой связи отметим, что белок S1 катализирует терминацию, даже если он добавлен на стадии элонгации, но не после ее завершения [23]. Иными словами, где-то в кон цестадии элонгации существует «точка невозврата», после которой белок S1 не может помочь выходу синтезированной цепи. Что это за точка? В результате инициации на законной матрице с участием GTP Qβ-репликаза переходит в закрытую конформацию, из которой ни матрица, ни ее комплементарная копия не могут диссоциировать пока не завершится элонгация [26]. Это обеспечивает высокую процессивность репликазы, но препятствует эвакуации ее активного центра по завершении синтеза копии. Чтобы обеспечить «рециклинг» фермента, необходимо осуществить обратный переход из закрытой конформации в открытую. Возможно, что этот переход индуцируется загадочным безматричным 3’-концевым аденилированием синтезированной цепи, которое предшествует ее терминации [12] и представляет тот самый момент, до наступления которого белок S1 должен успеть встроиться в репликазу, чтобы выполнить функцию фактора терминации. В заключение отметим, что обнаружение способности белка S1 удалять РНК из комплекса изменяет базовую парадигму, согласно которой назначение этого белка состоит в удержании РНК вблизи актив ного центра фермента, будь то репликаза или рибосома [1], и заставляет переосмыслить возможную роль белка S1 в трансляции и иных клеточных процессах.

Об авторах

З. Ш. Кутлубаева

Email: alexch@vega.protres.ru
Россия

Е. В. Четверина

Email: alexch@vega.protres.ru
Россия

A. Б. Четверин

Автор, ответственный за переписку.
Email: alexch@vega.protres.ru
Россия

Список литературы

Дополнительные файлы