Некодирующие РНК, регулирующие транскрипцию в клетках эукариот

Полный текст

ВВЕДЕНИЕ По данным транскриптомного анализа лишь 1.5% от общего числа РНК в клетках эукариот кодируют белки, в то время как остальные транскрипты являются некодирующими (нкРНК). «Репертуар» генов, кодирующих белки, оставался, по-видимому, относительно статичным в ходе эволюции, а число генов нкРНК возрастало при переходе к более сложным организмам. Постоянно экспрессирующиеся в клетке рибосомные, транспортные, малые ядерные и малые ядрышковые нкРНК условно классифициру ют как нкРНК домашнего хозяйства - по аналогии с названием наиболее важных для клетки генов [1]. Однако большинство нкРНК выполняют регулятор ные функции и участвуют в не менее значимых и часто разнонаправленных молекулярных процессах, таких, как импринтинг и деметилирование ДНК, активация и репрессия транскрипции генов, а также ремоделирование хроматина, интерференция РНК и альтернативный сплайсинг [2-4]. Уровень синтеза многих нкРНК изменяется в различных стрессовых условиях, при онкологических и неврологических заболеваниях [5, 6]. Огромную роль нкРНК играют в дифференцировке клеток [7]. Учитывая, что это лишь малая часть известных на сегодняшний день свойств и функций нкРНК, можно предположить, что их вклад в поддержание нормального функционирования клетки не менее значителен, чем вклад белковых факторов. нкРНК принято разделять на короткие (~20- 30 н.о.), к которым относят микроРНК (miR), малые интерферирующие (siРНК), а также РНК, взаимодействующие c белками PIWI (P-element induced wimpy testis, piРНК) [8]; малые нкРНК длиной до 200 н.о. и длинные нкРНК (>200 н.о.). Среди малых нкРНК широкую известность получили РНК, ассоциированные с промотором (paРНК), хотя в этом классе встречаются представители разной длины [9]. Термин длинные некодирующие РНК (lncРНК) чаще применяют к транскриптам длиной несколько тысяч нукле отидов, относящихся к длинным межгенным нкРНК (lincРНК) и энхансерным РНК (eРНК) [10]. Тем не менее, встречаются и чрезвычайно протяженные нкРНК, состоящие из нескольких сотен тысяч ну клеотидов - очень длинные межгенные нкРНК (very long intergenic ncРНК, vlincРНК) и макроРНК [11]. Принимая во внимание многообразие классов и функций нкРНК, неудивительно, что многие из них участвуют в регуляции транскрипции в клетках эу кариот. Это происходит, в первую очередь, за счет различных эпигенетических механизмов, в частности, ремоделирования хроматина (эта область функционирования нкРНК относится к наиболее изученным) [12, 13]. Среди таких нкРНК наиболее известны: XIST РНК (X-inactive specific transcript), roX РНК, HOTAIR (Hox transcript antisense intergenic RNA); энхансерные РНК NRIP1, GREB1 и KLK; NEAT1 РНК (nuclear enriched abundant transcript 1), ответственная за формирование параспеклов в ядрах опухолевых клеток. В регуляции котранскрипционного сплайсинга участвуют MALAT1 РНК (metastasis associated lung adenocarcinoma transcript 1) и H19 РНК, служащие также терапевтическими мишенями при различных, в том числе онкологических, заболеваниях [14]. Кроме того, существуют нкРНК, взаимодействующие с РНК-полимеразой II (РНКП II) или транскрипционными факторами в составе преинициаторного (ПИК) или элонгационного ком плексов. К последним относятся 7SK мяРНК и TAR РНК, регулирующие активность фактора элонгации транскрипции P-TEFb; малая ядерная РНК U1 (U1 мяРНК), взаимодействующая с инициаторным фактором TFIIF; SRA РНК, активирующая рецепторы стероидов, и некоторые другие (рис. 1). Эти нкРНК вовлечены в сложные многостадийные механизмы регуляции и взаимодействуют, как правило, с целым каскадом белков, косвенно воздействуя на процесс транскрипции. Кодируемые мобильными генетическими элементами (SINE) B1 и B2 РНК мыши и Alu РНК человека, напротив, способны связывать саму РНКП II [15]. К настоящему времени их комплексы с ферментом не закристаллизованы. Единственная нкРНК, структура комплекса которой с РНКП II решена методом рентгеноструктурного анализа (РСА), - синтетический аптамер FC РНК, состоящий из двух коротких шпилек [16]. Поскольку во вторичной структуре почти всех перечисленных регуляторных нкРНК содержатся короткие шпилечные элементы, которые и взаимодействуют с активным центром РНКП II, их часто рассматривают как апта меры к ферменту [17]. Согласно общепринятой классификации TAR РНК, B1 РНК, B2 РНК и U1 мяРНК следует относить к малым нкРНК, тогда как Alu РНК, 7SK РНК, DHFR РНК, SRA РНК и GAS5 РНК являются длинными нкРНК (lncРНК). Конкретные свойства и функции каждой из этих нкРНК подробно рассмотрены в на стоящем обзоре. Структурные особенности взаимо действия FC РНК с РНКП II подробно описаны в ра боте [16]. РЕГУЛЯТОРНЫЕ РНК, КОДИРУЕМЫЕ ГЕНЕТИЧЕСКИМИ ЭЛЕМЕНТАМИ СЕМЕЙСТВА SINE SINE (short interspersed elements) - это ретротранспозоны длиной от 80 до 500 п.н., хаотично расположенные в геноме высших эукариот. Нуклеотидные последовательности SINE, обладающие 65-90% сходством, образуют семейства, и число гомологичных SINE может варьировать от 103 до 106 копий на клетку [18]. Исторически SINE рассматривали как «генетический мусор», используемый для уста новления филогенетических связей и изучения видообразования млекопитающих, пока не обнаружили, что транскрипция SINE-«генов» актиируется в клетках в ответ на тепловой шок [19]. Предполагают, что это обусловлено повышением доступности SINE для транскрипции в процессе ремоделирования хроматина, а также активацией фактора транскрипции TFIIIС, связывающего про моторные области SINE. Как оказалось, SINE во влечены в процессы регуляции экспрессии генов, локализации мРНК и могут служить энхансерами или мобильными промоторами РНКП II [20]. На данный момент известно, что SINE не кодируют белки и транскрибируются РНКП III, образуя соответствующие SINE РНК. Неожиданным стало открытие способности некоторых SINE РНК связывать РНКП II и ингибировать транскрипцию. Основные результаты получены для B1 и B2 РНК мыши и Alu РНК человека [14, 21]. Повышение уровня экспрессии этих нкРНК в клетках происходит при воздействии УФ- и γ-излучения, вирусных инфекциях, обработке этанолом, антибиотиками и противоопухолевыми препаратами [14]. Эти данные, несомненно, указывают на важную функциональную роль B1, B2 и Alu РНК в жизнедеятельности клетки. Alu РНК человека и B1 РНК мыши Свое название SINE-элемент Alu получил благо даря присутствию в нем участков, узнаваемых эндонуклеазой рестрикции из Arthrobacter luteus (R.AluI). В геноме человека содержится более 1 млн копий Alu, кодирующих Alu РНК, что составляет около 10.6% ядерной ДНК. В геноме мышей SINE, кодирующие B1 РНК, встречаются реже - не более 550000 на клетку. Обе эти РНК относятся к семейству ретроповторов малой цитоплазматической 7SL РНК [22] и имеют схожую вторичную структуру (рис. 2). Полноразмерная Alu РНК длиной ~280 н.о. представляет собой тандемный повтор двух B1-подобных элементов, соединенных 20-звенным А-богатым линкером. В ходе процессинга Alu РНК образуется scAlu РНК длиной 118 н.о., которая локализуется в цитоплазме и является полным аналогом B1 РНК мыши (рис. 2) [23]. Alu РНК имеет необычное строение, ее структурированные части были на званы «левой» (идентичной scAlu РНК) и «правой рукой» (Alu-RA (right arm), 135-280 н.о. Alu РНК). Каждый домен Alu РНК может связывать одну молекулу РНКП II, но только взаимодействие Alu-RA (или полноразмерной Alu РНК) с ферментом приводит к ингибированию транскрипции. B1 РНК мыши, несмотря на высокое сродство к РНКП II, не способ на влиять на транскрипцию (рис. 2А), хотя химер ная РНК, состоящая из B1 РНК и Alu-RA, обладает всеми свойствами полноразмерной Alu РНК [24, 25]. Помимо двух РНКП-связывающих доменов, рас положенных в «левой» и «правой руке», Alu РНК имеет два домена, обеспечивающих ингибирование транскрипции и локализованных в центральной об ласти «правой руки» и в районе А-богатого линкера (рис. 2Б). B1 РНК и scAlu РНК соответственно имеют только РНКП-связывающий домен. По данным кри оэлектронной микроскопии как Alu, так и B1 РНК взаимодействуют с доменом «зажим» РНКП II вблизи активного центра фермента [26]. Каким же образом происходит транскрипция в случае нефункциональных B1 РНК и scAlu РНК? Показано, что за «освобождение» РНКП II от ассоциированных с ней B1 РНК и scAlu РНК отвечает фактор транскрипции TFIIF, вызывающий диссоциацию этих нкРНК из ПИК, в то время как Alu РНК остается связанной с полимеразой (рис. 2). При этом контактов между самим TFIIF и B1 или scAlu РНК не обнаружено [27]. Вероятно, конформационные изменения в РНКП, вызываемые присоединением TFIIF, приводят к нарушению РНК белковых контактов. Поскольку в условиях in vivo TFIIF обычно ассоциирован с РНКП II еще до сборки ПИК на промоторе, вероятно, «бесполезное» связывание нкРНК, не регулирующих транскрипционную активность РНКП, просто не происходит. Точный механизм взаимодействия Alu РНК с ПИК до конца не выяснен. В условиях in vitro ингибирование наблюдалось только при добавлении Alu РНК до инициации транскрипции с промотора, хотя эф фективность синтеза абортивных транскриптов в присутствии Alu РНК падала в ~10 раз. При этом методом «торможения» в геле показано, что Alu РНК комигрирует вместе с ДНК в составе ПИК РНКП II [23]. Таким образом, ингибирование транскрипции осуществляется не за счет конкуренции с ДНК, а в результате изменения активности фермента вследствие образования специфических нкРНК-белковых контактов. Тем не менее, Alu РНК не может остановить активную транскрипцию и выполняет свои функции до стадии инициации. B2 РНК мыши В2 РНК транскрибируется РНКП III в присутствии факторов TFIIIB и TFIIIС с соответствующих B2 SINE (относящихся к семейству ретроповторов тРНКAla), количество которых оценивается в ~105 копий на клетку [28]. Эта РНК выделяется вместе с РНКП II при иммуносоосаждении ядерных экс трактов клеток, подвергнутых тепловому шоку [29], и способна ингибировать транскрипцию in vitro [25]. Нокдаун В2 РНК в клетках мыши приводит к повышению уровня экспрессии актина и гексокиназы II, тогда как в условиях теплового шока их гены репрессированы [24]. Увеличение количества B2 РНК зафиксировано при клеточном ответе на различные факторы стресса, а также в эмбриональных и опухолевых клетках [30]. Таким образом, важная роль этой нкРНК как ингибитора транскрипции не вызывает сомнений. К сожалению, количество данных о характере функционировании В2 РНК in vivo весьма не значительно, однако механизм действия этой нкРНК изучен достаточно детально. Клетки мыши содержат не менее четырех вариантов В2-транскриптов различной длины: ~150, ~180, ~240 и ~500 н.о. Два наиболее протяженных варианта полиаденилированы и весьма стабильны (τ1/2 = 60 мин), тогда как время деградации транс крипта 180 н.о. составляет всего 3-4 мин. Самый короткий 150-звенный вариант B2 РНК более устойчив и характеризуется значением τ1/2 около 20 мин [31]. В 2004 г. была определена вторичная структура именно транскрипта длиной ~180 н.о. [25], в которой условно выделяют три части (рис. 3А): (1) протяженный двухцепочечный участок (1-72 н.о.), в центре которого находится расплетенный фрагмент; (2) слабо структурированный участок (73-153 н.о.), содержащий три небольшие шпильки; (3) короткая 3'-концевая неструктурированная АU-богатая область (154- 178 н.о.), консервативная у всех SINE. Методом футпринтинга установлено, что РНКП II связывает наименее структурированную поло вину молекулы (73-155 н.о.), а 5'-концевая шпилька не обязательна ни для связывания В2 РНК с РНКП II, ни для репрессии транскрипции. Анализ различных делеционных мутантов В2 РНК позволил определить участок длиной 51 н.о. (81-131 н.о.), который непосредственно взаимодействует с РНКП II и ингибирует транскрипцию in vitro с такой же эффективностью, как и полноразмерная В2 РНК [31]. Причем наиболее важную роль в ингибировании транскрипции играет неструктурированная область В2 РНК (99-115 н.о.), фланкированная двумя шпильками. Удаление любой из них приводит к потере ингибирующей способности полностью функционального делеционного производного В2 РНК (81-131 н.о.). В то же время отсутствие этих шпилек в полноразмерной В2 РНК не сказывалось на ее свойствах. При этом все перечисленные делеционные мутанты В2 РНК специфически связывали РНКП при сборке ПИК на промоторе [31, 32]. Таким образом, для репрессии транскрипции необходимо правильное позиционирование одноцепочечного участка (99-115 н.о.) В2 РНК в комплексе с РНКП II, которое, по-видимому, может осуществлять любая из имеющихся шпилечных структур. Сходство структурной организации B2 РНК и Alu РНК указывает на то, что помимо активного центра (блокирование которого приводит к глобальному ингибированию синтеза мРНК) РНКП II содержит дополнительный докинг-центр, высокоспецифич ный к нкРНК. Как и в случае Alu РНК, в условиях in vitro образуется тройной комплекс РНКП II с В2 РНК и промотором одновременно [25]. Таким образом, В2 РНК может также связываться с РНКП после образования ее стабильного комплекса с промо тором и ингибировать транскрипцию уже на стадии инициации. При этом невозможным становится не только синтез полноразмерных мРНК, но и абортивных транскриптов. В результате экспериментов по кросслинкингу и футпринтингу ПИК, связанного с В2 РНК, установлено, что эта нкРНК мешает правильной координации промотора в активном центре полимеразы, тем самым переводя ПИК в инертную форму. По сути, В2 РНК меняет конформацию «закрытого» комплекса РНКП и препятствует его переходу в «открытый» и, тем более, в инициаторный комплексы. В то же время все ассоциированные с ПИК факторы, в частности TBP и TFIIB, остаются связанными с промотором и удерживают комплекс на ДНК [25]. Напомним, что в клетках мыши экспрессируется также B1 РНК, связывающая РНКП II, но не способная ингибировать транскрипцию. В1 РНК имеет сравнимое с В2 РНК сродство к полимеразе и способна вытеснять B2 РНК из ПИК. Следовательно, B1 РНК должна препятствовать функционированию B2 РНК. Однако в экспериментах in vitro было показано, что B2 РНК может ингибировать транскрипцию даже в том случае, когда ПИК предварительно был свя зан с B1 РНК [27]. Как осуществляется конкуренция между этими двумя нкРНК in vivo не установлено. Поскольку нефункциональный аналог существует и у Alu РНК человека, можно предположить, что эти неактивные нкРНК - B1 и scAlu РНК, в определен ных условиях могут заменять соответственно B2 и Alu РНК и вновь стимулировать транскрипцию. Интересно, что помимо непосредственного «фи зического» блокирования активного центра РНКП II, В2 РНК специфически ингибирует киназную ак тивность фактора транскрипции TFIIH ( рис. 3Б). В состав TFIIH входит циклинзависимая киназа 7 (CDK7), в обычных условиях фосфорилирующая остатки серина в составе гептапептидных повторов YSPTSPS (главным образом Ser5) С-концевого до мена (CTD) большой субъединицы (Rpb1) РНКП II. Модификация Ser2 и Ser5 CTD Rpb1 чрезвычайно важна для транскрипции. Она происходит на раз личных стадиях транскрипции: в инициаторном комплексе домен не фосфорилирован и, наоборот, гиперфосфорилирован при элонгации транскрипции [33]. Таким образом, В2 РНК не только создает конформационные затруднения самой РНКП II, но и делает невозможным переход в стадию элонгации, влияя на функционирование фактора транскрипции. Хотя TFIIH не является основной мишенью В2 РНК, и его репрессия обусловлена скорее всего взаимодействием В2 РНК с ПИК, этот случай уникален для подобных нкРНК. Еще более удивительным свойством В2 РНК оказалась ее способность к собственной элонгации в комплексе с РКНП II [34]. При этом фермент использует 3'-конец молекулы В2 РНК в качестве матрицы для транскрипции и синтезирует de novo 18 «дополнительных» нуклеотидных остатков, образующих протяженную стабильную шпильку (рис. 3В,Г). Элонгация B2 РНК приводит к диссоциации молекулы из ПИК и, по-видимому, обеспечивает обратимость ингибирования. Высвободившаяся удлиненная B2 РНК подвергается деградации. Анализ данных компьютерного моделирования свидетельствует о том, что удлинение цепи B2 РНК (как и любой другой РНК, находящейся в активном центре полимеразы) должно приводить к частичному открытию домена «зажим» РНКП и, как следствие, к ослаблению связывания лиганда с ферментом. По сути, образующийся новый структурный элемент элонгированной B2 РНК «выталкивает» молекулу из ПИК. Отметим, что элонгация B2 РНК пока изучена в условиях in vitro только при обработке комплекса B2 РНК с РНКП II клеточным экстрактом [34]. Полагают, что РНК-зависимая транскрипция РНКП II инициируется белковым фактором, природа которого не известна. Поскольку большинство РНК-полимераз являются ДНК-зависимыми (за исключением РНКП ретровирусов), удлинение B2 РНК представляет своего рода исключение из правила, так как фермент меняет свою субстратную специфичность. На сегодняшний день известно лишь несколько подобных примеров, также связанных с функционированием нкРНК. Например, данный механизм используется вирусом гепатита δ, а также вироидами растений для репликации собственных геномов. Не имея своей РНК-полимеразы, эти патогенные кольцевые нкРНК используют РНКП клеток хозяев, перепрограммируя их на синтез РНК с РНК-матрицы [35]. Более ярким примером может быть прокариотическая 6S РНК, которая, как и B2 РНК, ингибирует транскрипцию за счет взаимодействий с РНКП. В определенных условиях бактериальная РНКП может синтезировать на матрице 6S РНК короткие транскрипты длиной до 30 н.о. (пРНК). При этом фермент диссоциирует из комплекса с 6S РНК и возобновляет транскрипцию с промоторов генов [36]. Таким образом, несмотря на колоссальные различия в процессах транскрипции у про- и эукари от, между функционированием 6S РНК бактерий и B2 РНК мыши можно отметить несомненное сходство. НЕКОДИРУЮЩИЕ РНК, РЕГУЛИРУЮЩИЕ АКТИВНОСТЬ ОСНОВНЫХ ФАКТОРОВ ТРАНСКРИПЦИИ U1 мяРНК U1 мяРНК - одна из пяти основных мяРНК, формирующих ядро сплайсосомы. U1 мяРНК человека имеет длину 164 н.о. и ассоциирована с белками U1-A, U1-C и U1-70k, а также с восемью белками семейства Sm, образующими вместе комплекс U1 мяРНП (~245 кДа). Основная функция U1 мяРНП - узнавание пре мРНК на первой (инициирующей) стадии сборки сплайсосомы, осуществляемое благодаря комплементарным взаимодействиям 5'-концевого участка U1 мяРНП с сайтом сплайсинга интронов [37]. Тем не менее, помимо своей основной роли, U1 мяРНК способ на взаимодействовать с циклином Н (CycH) в составе TFIIH, что, в свою очередь, приводит к повышению киназной активности другой субъединицы этого фак тора - CDK7 (рис. 4А). В условиях транскрипции in vitro было показано, что присутствие в реакционной смеси U1 мяРНК повышает скорость образования первой фосфодиэфирной связи, а эффективность инициации транскрипции увеличивается более чем в 10 раз. Кроме того, U1 мяРНК стимулирует абортивную инициацию, а также реинициацию транскрипции с промотора, предшествующего 5'-концевому сайту сплайсинга [38]. Помимо TFIIH, U1 мяРНК может взаимодействовать с другим фактором транскрипции - TAF15, ассоциированным с TFIID в составе ПИК и предположительно участвующим в стадии элонгации [39]. Так или иначе, U1 мяРНК активирует процесс транскрипции, в отличие от других описан ныхвыше регуляторных нкРНК. DHFR нкРНК Ген DHFR кодирует дигидрофолатредуктазу - один из основных ферментов метаболизма фолатов. Около 99% мРНК DHFR транскрибируются с основного про мотора и содержат шесть экзонов. В условиях сывороточного голодания и замедления роста клеток «включается» альтернативный промотор, расположенный на расстоянии ~450 н.о. от основной точки инициации транскрипции. В результате преждевременной терминации транскрипции во втором интроне образуется короткий продукт экспрессии с минорного промотора - DHFR нкРНК, длина которой варьирует от 800 до 2-3 т.н.о. [40]. Функциональной частью молекулы считается участок длиной ~400 н.о., комплементарный промоторной области собственного гена и содержащий протяженные поли(dG)-последовательности, благо даря которым DHFR нкРНК образует с промотором пурин-пурин-пиримидиновый триплекс, имеющий H-форму и препятствующий сборке ПИК [41]. Таким образом, DHFR нкРНК относится к классу нкРНК, ассоциированных с промотором [9]. Кроме того, она способна взаимодействовать с транскрипционным фактором TFIIB в составе ПИК, что приводит к его диссоциации [42]. Поскольку связывание TFIIB с про мотором является ключевой стадией сборки ПИК, а DHFR нкРНК полностью предотвращает этот процесс, наступает ингибирование транскрипции. Какой именно участок DHFR нкРНК отвечает за взаимодействие с TFIIB, неизвестно, как, впрочем, и детали про цессинга самой DHFR нкРНК. 7SK и TAR РНК 7SK РНК человека и TAR РНК ВИЧ являются, вероятно, самыми известными эукариотическими нкРНК, участвующими в регуляции элонгации транскрипции. Обе нкРНК выступают в роли платформ для сборки белковых ассоциатов, модулирующих ак тивность элонгационного комплекса РНКП II, а так же взаимодействуют с фактором P-TEFb [43-45]. P-TEFb - ключевой транскрипционный фактор, который стимулирует переход РНКП II, приостановленной на промоторе (так называемые паузы транскрипции, необходимые для 5'-кэпирования растущей цепи мРНК), в стадию активной элонгации. P-TEFb состоит из циклинзависимой киназы 9 (CDK9) и циклина Т1 или его аналогов СусТ2a и СусТ2b (далее CycT). Его основная функция состоит в фосфорилировании Ser2 CTD Rpb1 РНКП II, а также репрессоров транскрипции NELF и DSIF [46] (рис. 5А). Привлечение P-TEFb к полимеразе осуществляется благодаря различным ДНК-связывающим белкам, в первую очередь Brd4, а также классическим транскрипционным факторам, таким, как NF-κB, HSF, p53, с-Myc и др. После преодоления паузы P-TEFb связывает ряд других белков, образующих суперэлонгационный комплекс (SEC) РНКП II [47]. В отсутствие P-TEFb РНКП II способна синтезировать только короткие 5'-концевые последовательности пре-мРНК, т.е. этот фактор необходим для синтеза большинства клеточных мРНК. Взаимодействуя с P-TEFb, 7SK мяРНК ингибирует его активность, что является важным регуляторным механизмом экспрессии генов в клетках эукариот. С другой стороны, высвобождение P-TEFb из комплекса с 7SK мяРНК может служить сигналом для роста и пролиферации клеток [48]. TAR РНК ВИЧ, наоборот, активирует P-TEFb, что способствует инициации транскрипции с 5'-концевого вирусного промотора (5'-LTR) [45]. В данном обзоре описаны лишь основ ные особенности этих нкРНК и принципы их функционирования. 7SK мяРНК имеет длину 332 н.о. и состоит из че тырех основных длинных шпилечных структур, со единенных неструктурированными участками, и дополнительных малых шпилек. Хотя геном человека содержит сотни псевдогенов 7SK мяРНК, эта РНК (~2×105 копий на клетку) транскрибируется РНКП III с единственного истинного гена, расположенного в шестой хромосоме. Нуклеотидная последовательность этого гена высококонсервативна у позвоночных [49]. В процессе посттранскрипционной модификации нуклеазы отщепляют от 7SK РНК 3'-концевые 1-3 н.о., а затем происходит аденилирование, при водящее к существованию в клетке трех различных вариантов 7SK мяРНК длиной 330, 331 и 332 н.о., из которых наиболее устойчив 331-звенный. Помимо этого, 7SK мяРНК кэпируется с 5'-конца: метил трансфераза MePCE метилирует 5'-концевой оста ток гуанозина по γ-фосфатной группе. Такой процесс не характерен для транскриптов, синтезированных РНКП III, и к настоящему времени описан только для U6 и 7SK мяРНК [50]. Примерно 90% 7SK мяРНК в клетке остаются свя занными с MePCE и вместе с белком LARP7 обра зуют так называемое ядро рибонуклеопротеинового комплекса 7SK мяРНП (рис. 5Б). MePCE и LARP7 также образуют контакты друг с другом, дополнительно обеспечивая стабильность мяРНП; в таком виде 7SK РНК надежно защищена от деградации. Далее с комплексом связывается белок HEXIM в форме димера, состоящего из взаимозаменяемых паралогов HEXIM1 и/или HEXIM2. Аргинин-богатый РНК-связывающий домен (ARM) HEXIM связывает 5'-концевую шпильку 7SK мяРНК, при этом кон формация белка изменяется, и он может взаимодействовать с CycT P-TEFb. Дополнительно C-концевой домен LARP7 связывает CDK9, обеспечивая прочную структуру всего комплекса. По-видимому, 7SK РНК также участвует в образовании контактов с P-TEFb. В итоге фактор теряет киназную актив ность, что не позволяет ему обеспечивать элонгацию транскрипции [48, 51, 52]. Однако не весь P-TEFb оказывается связанным с 7SK мяРНП. Многочисленные экспериментальные данные свидетельствуют о том, что в клеточном ядре свободная и связанная формы P-TEFb находятся в постоянно поддерживаемом равновесии, контролируемом с помощью различных сигнальных механизмов. Например, ряд гетерогенных ядерных рибонуклеопротеинов (hnRNP) и РНК-хеликаза A (RHA), связываясь с ядром 7SK мяРНП, блокируют доступ P-TEFb (рис. 5Б). Еще один механизм связан с временной инактивацией P-TEFb, поскольку толь ко активированная форма белка (с фосфорилированным остатком Т186 в так называемой T-петле CDK9) может взаимодействовать с 7SK мяРНП. За этот процесс отвечают серин-треониновые фосфатазы, включая PPM1G, которую привлекает NF-κB. Ряд белков может также ацетилировать CycT, фосфорилировать HEXIM, деметилировать 7SK мяРНК с 5'-конца или осуществлять протеолиз MePCE, что приводит к дестабилизации комплекса и диссоциации P-TEFb. После высвобождения из 7SK мяРНП фактор вновь модифицируется [52]. Отметим, что значительная часть P-TEFb в комплексе с 7SK мяРНП ассоциирована с хроматином (например, посредством бел ка Brd4, взаимодействующего с ацилированными гистонами H3 и H4), и описанные механизмы часто осуществляются котранскрипционно. Brd4 также может связывать P-TEFb в комплексе с 7SK мяРНП и инициировать изменение конформации CycT и диссоциацию CDK9 [53]. Более известен механизм диссоциации P-TEFb из комплекса с 7SK мяРНП в клетках, зараженных ВИЧ, в котором принимает участие TAR РНК (рис. 5Б). TAR РНК - это 5'-концевой структурный элемент (шпилька) растущей цепи вирусной РНК, синтезирующейся с 5'-LTR. В отсутствие дополни тельной активации РНКП II не способна синтезировать с 5'-LTR транскрипты длиной более 60-80 н.о., и TAR РНК, состоящая из 59 н.о., является мини мальным фрагментом, после которого наступает па уза транскрипции. Для стимуляции элонгации TAR РНК связывается с вирусным белком Tat, который привлекает к 5'-LTR различные транскрипционные факторы, включая P-TEFb [54]. Данное взаимодей ствие обусловлено специфическими контактами между аргинин-богатым РНК-связывающим доме ном (ARM) Tat и тринуклеотидной боковой петлей 5'- UCU-3' в TAR РНК. При этом апикальная петля TAR РНК и фланкирующий ее участок взаимодействуют с CycT (рис. 5Б). Эта область молекулы имитирует 5'-концевую шпильку 7SK мяРНK, что позволяет TAR РНК также связывать ARM HEXIM и в отсутствие Tat не допускать активацию P-TEFb. Кроме того, Tat непосредственно взаимодействует с CycT и CDK9, образуя стабильный комплекс, кристаллическая структура которого была решена в 2010 г. [55]. Связывая так называемую T-петлю CDK9, Tat меняет субстратную специфичность киназы, которая на чинает фосфорилировать не только Ser2 в CTD Rpb1, но и остатки Ser5 [56]. Это позволяет ВИЧ активиро вать элонгацию транскрипции даже без привлечения TFIIH (рис. 5Б). Формирование тройного комплекса Tat-TAR-P-TEFb регулируется набором ферментов, осуществляющих ацетилирование, фосфорилирование, метилирование и убиквитинирование Tat [54]. Очевидно, что между комплексом Tat-TAR РНК и 7SK мяРНП должна существовать конкуренция за связывание с P-TEFb. Как оказалось, Tat может вытеснять фактор элонгации из его комплекса с 7SK мяРНП благодаря непосредственному взаимодействию Tat с CycT и изменению конформации P-TEFb [57, 58]. Похожий механизм описан для РНК связывающих белков SRSF1 и SRSF2, вовлеченных в процессы сплайсинга и метаболизма РНК в клетках млекопитающих и, как правило, ассоциированных с промоторными областями активно транскрибиру емых генов. Оба белка способны связывать 5'-концевую шпильку 7SK мяРНК, образуя альтернативный 7SK мяРНП. Если растущая цепь РНК содержит последовательность ESE (exonic-splicing enhancer), SRSF1 и SRSF2 связываются с ней, высвобождая активный P-TEFb в непосредственной близости от РНКП II и стимулируя элонгацию транскрипции нужного гена [59]. НЕКОДИРУЮЩИЕ РНК, ВЗАИМОДЕЙСТВУЮЩИЕ С ДРУГИМИ ТРАНСКРИПЦИОННЫМИ ФАКТОРАМИ SRA РНК SRA РНК (steroid receptor activator) человека - длинная нкРНК, участвующая в активации эстрогеновых (ER), прогестероновых (PR), глюкокортикоидных (GR) и других ядерных рецепторов. Так же, как и 7SK мяРНК, SRA РНК выступает в роли плат формы для связывания (в том числе и конкурентного) различных факторов транскрипции, важнейшие из которых - CTCF, SLIRP и SHARP, а также РНК-хеликазы p68 и p72 [60, 61]. Кроме того, SRA РНК модулирует активность транскрипционного фактора MyoD, играющего ключевую роль в дифференцировке мышечных клеток [62]. SRA РНК присутствует во всех тканях человека, хотя более высокий ее уровень наблюдается в тканях печени, сердца и в скелетных мышцах [63]. Экспрессия SRA РНК повышена при поликистозе яичников и раке молочной железы у женщин, что обуславливает растущий интерес к этой РНК как к одной из терапевтических мишеней [61]. Ген sra1, кодирующий SRA РНК, высококонсервативен в геноме мыши, крысы и человека. Он имеет длину около 6500 н.о. и состоит из пяти экзонов. В клетках человека обнаружено не менее 20 раз личных изоформ SRA РНК длиной от 700 до 1500 н.о. Большинство транскриптов содержат кор-элемент длиной 687 н.о., соответствующий экзонам 2-5, и отличаются 5'- и 3'-концевыми участками [64]. В 2012 г. методами химического и ферментативного пробинга была установлена вторичная структура 873-звенного варианта SRA РНК, состоящая из 25 шпилек (H1- H25) различной длины и формы, условно разделяемых на четыре домена D1-D4 и 12 главных структурных элементов STR1-STR12 (рис. 6А) [65]. Анализ делеционных производных позволил выявить шесть наиболее важных STR, ответственных за связывание с теми или иными белками. При этом удаление любого STR приводило к полной или частичной потере молекулой ее функциональных свойств, т.е. все основные взаимодействия осуществляются именно благодаря мультиплетной структуре SRA РНК [66]. Тем не менее, наиболее важным для взаимодействия с ядерными рецепторами является домен D3 (494-699 н.о.). Входящий в его состав эле мент H15-H18 (505-575 н.о.) высококонсервативен у позвоночных. Интересно, что индивидуальная экспрессия этого элемента приводит, наоборот, к ингибированию транскрипции ERα-зависимых генов [67]. Переключение функции SRA РНК с активации на репрессию ядерных рецепторов также наблюдалось при замене чрезвычайно важного остатка U207 в STR5 на аденозин. U207 является сайтом псевдоуридилирования, осуществляемого псевдо уридинсинтазами Pus1p и Pus3p - коактиваторами ядерных рецепторов. Например, непосредственное взаимодействие SRA РНК с Pus1p в клетках мыши активирует транскрипцию генов, зависимых от рецепторов ретиноевой кислоты (mRARc) [68]. Синтетический олигонуклеотид, идентичный STR5, способен конкурировать с полноразмерной SRA РНК и блокировать Pus1p, предотвращая модификацию этой нкРНК, что приводит к ингибированию транскрипции AR- и ERα-зависимых генов [69]. STR7 SRA РНК взаимодействует с РНК узнающими мотивами (RRM) факторов SHARP и SLIRP, инициируя тем самым как активацию, так и ингибирование транскрипции различных генов. Еще один партнер SRA РНК - рецептор PPARγ, регулирующий экспрессию генов, вовлеченных в контроль адипогенеза и чувствительности к инсулину [60]. Так или иначе, SRA РНК это один из важнейших звеньев контроля активности ядерных рецепторов, участвующий в различных регуляторных механизмах, в которые вовлечены целые каскады белков (рис. 6Б). Как и для других нкРНК в клетке существуют механизмы подавления активности SRA РНК, главным образом с участием белка SRAP, закодированного в 39% SRA РНК-транскриптов, что представляет собой пример своеобразной саморегуляции. Фактически SRA РНК является кодирующей РНК, хотя основную функцию все же выполняет некодирующий вариант транскрипта гена sra1. На данный момент не до конца ясно, способен ли SRAP непосредственно связывать SRA РНК и препятствовать ее взаимодействию с другими белками, или этот процесс осуществляется через факторы транскрипции, ассоциированные с SRA РНК или ядерными рецепторами [70]. Тем не менее, соотношение между количеством транслируемого и нетранслируемого продуктов транскрипции гена sra1 является одним из ключевых моментов регуляции транскрипции в клетке. Например, при дифференцировке миоцитов равновесие сильно смещается в сторону некодирующей SRA РНК, и она может беспрепятственно взаимодействовать с активаторами транскрипции, привлекая их на MyoD-зависимый промотор и активируя транскрипцию соответствующих генов [71]. GAS5 РНК Еще одна длинная нкРНК, контролирующая транскрипцию через регуляцию ядерных рецепторов - GAS5 РНК (growth arrest-specific 5). В обычных условиях GAS5 РНК быстро подвергается деградации. Однако в условиях сывороточного голодания в остановленных на определенной стадии роста (арестованных) клетках или при обработке ингибиторами трансляции наблюдается индукция ее экспрессии и повышение стабильности, с чем и связано название этой нкРНК [72]. Основная функция GAS5 РНК - ингибирование глюкокортикоидного рецептора GR - фактора транскрипции, ответственного за активацию глюкокортикоидзависимых генов. GR является ДНК связывающим белком, который узнает нуклеотидные последовательности GRE (gluticorticoid responsive element) в промоторных областях контролируемых генов. Функциональный участок GAS5 РНК имити рует GRE и, связываясь с GR, блокирует его доступ к промоторам, тем самым предотвращая активацию их транскрипции (рис. 7). GAS5 РНК может взаимодействовать не только с GR, но и с другими ядерными рецепторами, связывающими GRE, в частности с рецепторами андрогенов, прогестерона и др. [73]. Последние исследования, проведенные in vitro и in vivo, однозначно указывают на важную роль GAS5 РНК в инициации апоптоза различных видов опухолевых клеток и в ингибировании пролиферации и метастазирования, а также в регуляции иммунного ответа при различных воспалительных, бактериаль ных и вирусных заболеваниях [74, 75]. GAS5 РНК человека кодируется геном gas5, ко торый содержит 12 экзонов, перемежающихся с 10 интронами, кодирующими малые ядрышковые РНК. После транскрипции, осуществляемой РНКП II, пре мРНК гена gas5 подвергается полиаденилированию и альтернативному сплайсингу, что приводит к по явлению различных изоформ GAS5 РНК, основными из которых являются GAS5a (612 н.о.) и GAS5b (651 н.о.) РНК, содержащие экзоны 7а или 7b соот ветственно. Более длинные варианты GAS5 РНК (~1200-1800 н.о.) встречаются реже и содержат одну или несколько последовательностей, кодирующих малые ядрышковые РНК [72, 76]. В нормальных условиях GAS5 РНК локализуется в цитоплазме, оставаясь ассоциированной с рибосомой. Но при задержке роста клеток она транслоцируется в ядро, где и взаимодействует с рецептором GR [76]. Вторичная структура GAS5 РНК представлена набором шпилек, а функциональный участок, идентифицированный путем делеционного анализа, рас положен в 3'-концевой части молекулы (400-598 н.о., рис. 7А), которая встречается по всех изоформах GAS5 РНК. Основные контакты образуются между GR и стеблем шпильки GRE-1/GRE-2 (539-544 и 553-559 н.о.), имитирующей конформацию палиндромной GRE-последовательности ДНК d(5'-AGAACANNNTGTTCT-3'/ 3'-TCTTGTNNNACAAGA-5', где N = A, T, C, G). Остатки G540 и С554 в GAS5 РНК консервативны среди консенсусных GRE последовательностей человека и взаимодействуют соответственно с K442 и R447 в ДНК-связывающем домене белка GR. Замена С554U в GAS5 РНК при со хранении стабильности двойной спирали приводила к потере способности этой РНК ингибировать GR-зависимую транскрипцию с промотора MMTV (mouse mammary tumor virus) in vivo [76]. Таким об разом, GAS5 РНК конкурирует с GRE-содержащими промоторами за связывание с GR по аналогии с бактериальной 6S РНК, также имитирующей промо тор и ингибирующей РНКП [36]. Было показано, что трансфекция опухолевых клеточных линий олигодезоксирибонуклеотидами, идентичными участку 538-560 н.о. GAS5 РНК, приводит к эффективной индукции апоптоза и снижению выживаемости клеток [77], что, возможно, позволит в будущем использовать их в терапевтических целях. Количество GAS5 РНК в клетке регулируется с помощью системы NMD (nonsense-mediated RNA decay), осуществляющей деградацию «бессмыс ленных» последовательностей мРНК, и сигнального пути, зависимого от киназы mTOR (mammalian target of rapamycin). Предполагается, что в условиях активного клеточного роста может происходить mTOR-зависимая трансляция короткой открытой рамки считывания (ORF), локализованной в GAS5 РНК (напомним, что нкРНК в этих условиях ассоциирована с рибосомой). Однако большое число стоп кодонов в ORF и малая длина потенциально синтезируемого пептида приводят к активации NMD и деградации GAS5 РНК. В случае клеточного ареста и низкой концентрации комплекса mTOR GAS5 РНК не транслируется, и ее уровень возрастает [73]. Помимо своей основной функции GAS5 РНК связывает онкогенные miR-21, miR-222 и miR-103, вы ступая тем самым в роли миРНК-губки и предотвращая их влияние на экспрессию генов [74, 78]. Более того, в последних исследованиях обнаружено, что 5'-концевой участок GAS5 РНК (1-250 н.о.) способен связывать белок NS3 вируса гепатита С (HCV) и ингибировать его функцию, подавляя тем самым репликацию HCV [79]. Очевидно, мультифункциональность GAS5 РНК обусловлена различными до менами молекулы, каждый из которых отвечает за взаимодействие с определенной мишенью (рис. 7). ДРУГИЕ РНК, УЧАСТВУЮЩИЕ В РЕГУЛЯЦИИ АКТИВНОСТИ ТРАНСКРИПЦИОННЫХ ФАКТОРОВ В настоящее время известны десятки различных нкРНК, модулирующих активность транскрипционных факторов. Большинство из них «работают» лишь в определенных (стрессовых) условиях и зачастую тканеспецифичны [13, 17]. Например, NRSE РНК (neuron-restrictive silencer element) экспрессируется в стволовых клетках и связывается с транскрипционным репрессором NRSF/REST, ответственным за молчание нейронспецифичных генов. Механизм этого РНК-белкового взаимодействия аналогичен механизму GAS5 РНК: NRSE РНК представляет со бой короткую (~20 п.о.) двухцепочечную РНК, имитирующую структуру промотора. Связанный с NRSE РНК фактор NRSF/REST превращается в активатор транскрипции и «включает» экспрессию нейронспецифичных генов [80]. TSU РНК (trophoblast STAT utron) - 5'-нетранслируемый конец мРНК гена, ко дирующего фактор транскрипции STAT1, связывает собственный белок, имитируя STAT-связывающий промотор, и ингибирует тем самым экспрессию генов главного комплекса гистосовместимости [81]. Длинная некодирующая РНК HSR1 (~600 н.о.) активирует HSF1 - основной фактор транскрипции теплового шока, который инициирует работу элонгационного комплекса РНКП II, остановленного на промоторах стрессовых генов [82]. Другие нкРНК влияют на активность факторов транскрипции, из меняя их клеточную локализацию, например, NRON РНК и lncРНК-p21 [83]. Отдельного внимания заслуживают кольцевые РНК (circРНК, или ciРНК) - продукты альтернативного сплайсинга, в результате которого происходит замыкание 5'- и 3'-концов молекулы. По последним данным более 100 кольцевых РНК ассоциировано с РНКП II, и, по крайней мере, некоторые из них активируют транскрипцию собственных генов [84]. Предполагается, что кольцевые нкРНК косвенно взаимодействуют с РНКП II через рибонуклеопротеиновый комплекс U1 сплайсосомы, однако конкретный механизм их действия не известен [13]. ЗАКЛЮЧЕНИЕ В последнее время появляются все новые данные о различных нкРНК, вовлеченных в регуляцию транскрипции в клетках эукариот как на уровне конкретных генов, так и в более глобальном масштабе. Чаще всего это длинные нкРНК, регулирующие этот процесс на стадиях ремоделирования хрома тина. В данном обзоре описаны те нкРНК, механизмы действия которых тесно связаны с контролем функционирования транскрипционного комплекса РНКП II. Рассмотренные нкРНК имеют и ряд других, не менее важных свойств. Например, Alu РНК связывает белки SRP9/14 (signal recognition particle) и в составе этого РНП ингибирует инициацию трансляции. Отметим, что в свободном виде Alu РНК, напротив, способна активировать этот процесс [85]. U1 мяРНК представляет собой один из основных компонентов сплайсосомы, и ее участие в активации транскрипционных факторов не столь значимо. В то же время способность GAS5 РНК взаимодействовать с онкогенными miR может оказаться не менее важной, чем способность связывать GR-рецепторы. Наконец, показано, что B2 РНК регулирует транс крипцию, не только взаимодействуя с РНКП II и подавляя ее активность, но и непосредственно связываясь с генами белков теплового шока и ингибируя их экспрессию в отсутствие стресса. При повышении температуры B2 РНК подвергается деградации, инициированной белком EZH2 в составе комплекса PRC2, и освобождает эти гены для активной транскрипции [86]. Эти и другие факты свидетельствуют о многообразии свойств и функций нкРНК, и, несомненно, указывают на их чрезвычайную важность для жизнедеятельности клетки.

Об авторах

O. Ю. Буренина

Сколковский институт науки и технологий; Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова

Автор, ответственный за переписку.
Email: alunit@inbox.ru
Россия

T. С. Орецкая

Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова

Email: alunit@inbox.ru
Россия

E. A. Кубарева

Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова

Email: alunit@inbox.ru
Россия

Список литературы

Дополнительные файлы