Когнитивная индексация нейронов: Cre-управляемое генетическое маркирование и изучение клеток, участвующих в обучении и памяти

Полный текст

ВВЕДЕНИЕ Исследование механизмов формирования и работы нейронных сетей, обеспечивающих когнитивные функции головного мозга, является одним из главных направлений современной нейронауки. Решение этих задач требует создания новых экспериментальных методов, позволяющих визуализировать нейронные субстраты когнитивных процессов в масштабе целого мозга с клеточным разрешением. Принципиальной при этом является необходимость сравнения клеточных популяций, отвечающих за различные когнитивные функции. Классическим методом выявления нейронных популяций, вовлекаемых в различные типы когнитивной активности животных, служит детекция экспрессии непосредственно ранних генов (НРГ, immediately early) [1-3]. НРГ - семейство генов, быстро активирующихся в клетке через внутриклеточные сигнальные каскады в ответ на те или иные внешние воздействия. К этому семейству относятся гены, которые кодируют транскрипционные факторы, структурные синаптические белки, цитоплазматические ферменты и др. [4]. Экспрессия некоторых НРГ, например с-fos, zif268 и arc, индуцируется новым для животного опытом и критически необходима для пластических перестроек и формирования долговременной памяти, хранящей следы индивидуального опыта [1, 3, 5, 6]. На этих свойствах НРГ основаны методы иммуногистохимического и in situ гибридизационного картирования мозга, позволяющие выявлять когнитивные нейронные сети, активные во время обучения [2, 7-9]. Однако выявление продуктов НРГ с помощью иммуногистохимии или in situ гибридизации трудоемко и ограничено узким временным окном после когнитивного воздействия. Перспективным способом решения части этих проблем является визуализация популяций когнитивно активных нейронов с помощью экспрессии генов флуоресцентных белков под контролем промоторов НРГ. Использование управляемых трансгенных систем дает возможность получать мышей, у которых флуоресцентный белок синтезируется только в тех нейронах, в которых в определенный момент времени происходила экспрессия НРГ, например, c-fos [10]. Такие технологии получают в последние годы все большее распространение. Однако они имеют существенное ограничение: мечение популяции когнитивно активных нервных клеток ограничено сроком жизни флуоресцентного белка. Способом решения этой проблемы может стать перманентное генетическое маркирование популяции нервных клеток мозга, отвечающих за решение определенной когнитивной задачи. С этой целью может быть использована широко применяемая в нейробиологии система сайт-специфических рекомбиназ [11-13], в частности, система с модифицированной Cre-рекомбиназой бактериофага P1, которая соединена с мутантным лигандсвязывающим доменом рецептора эстрогена [14, 15]. В присутствии тамоксифена, синтетического антагониста эстрогена, Cre-рекомбиназа распознает гомотипические loxP-сайты и вырезает ДНК, фланкированную этими сайтами. Сайты loxP обычно ограничивают STOPкодон, расположенный перед последовательностью репортерного гена, кодирующего флуоресцентный белок (GFP, tdTomato и др.), β-галактозидазу или каналородопсин [13, 16]. В настоящее время созданы десятки трансгенных линий мышей, у которых Cre-рекомбиназа экспрессируется избирательно в разных тканях или разных типах клеток, например, в отдельных типах интернейронов [17], или на определенных стадиях развития нейрональных предшественников [13]. Таким образом, технология генетического маркирования нейронов с помощью Cre-рекомбиназы в настоящее время хорошо развита, однако применяется преимущественно для анатомического картирования нервной системы или для эмбриональных исследований. Методической инновацией стала работа Guenthner и соавт. [18], которые создали линии трансгенных мышей, экспрессирующих Cre-рекомбиназу под управлением промоторов НРГ - c-fos и arc. Скрещивание мышей линии FosCre или Arc-Cre с мышами репортерной линии, несущей красный флуоресцентный белок tdTomato, дало возможность впервые получить перманентное генетическое маркирование нейронов, в которых активируются НРГ [18]. Нами получены двойные трансгенные мыши FosCre-eGFP, которые были использованы в настоящей работе для исследования морфологического и молекулярного фенотипа нейронов различных структур головного мозга, подвергающихся Cre-рекомбинации при приобретении животными нового опыта. Мы также впервые апробировали возможность использования трансгенных мышей Fos-Cre-eGFP для маркирования и сравнения двух популяций нейронов, активных у одного и того же животного в двух разных ситуациях нового опыта. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ Получение двойных трансгенных мышей линии Fos-Cre-eGFP Для получения мышей линии Fos-Cre-eGFP проводили скрещивание трансгенных мышей линий B6.129(Cg)-Fostm1.1(cre/ERT2)Luo/J (The Jackson Laboratory, стоковый номер: 021882), несущих Cre-рекомбиназу под промотором c-fos, с линией Tg(CAG-Bgeo/GFP)21Lbe/J (The Jackson Laboratory, стоковый номер 003920), несущей ген усиленного зеленого флуоресцентного белка eGFP под loxP-сайтами. Мышей содержали в индивидуально вентилируемых клетках по пять животных со свободным доступом к воде и пище при световом цикле 12/12 ч. Все эксперименты проводили в соответствии с требованиями приказа № 267 МЗ РФ (19.06.2003 г.), а также с постановлением локального этического комитета по вопросам биомедицинских исследований НИЦ «Курчатовский институт» (Протокол № 1 от 09.07.2015). Генотипирование У обеих родительских линий трансген находится в гетерозиготном состоянии, поэтому для выявления двойных трансгенных животных использовали генотипирование по каждому трансгену. В возрасте двух месяцев у мышей собирали образцы тканей и выделяли ДНК путем лизирования раствором протеиназы К (Sigma) в 1% SDS-буфере (Хеликон) с последующим осаждением 96% этанолом. Осадок ДНК растворяли в TE-буфере. Полученную ДНК использовали для проведения полимеразной цепной реакции (ПЦР) с праймерами к Cre-рекомбиназе и eGFP в среде ScreenMix (ЗАО «Евроген»). Использовали следующие праймеры: для Cre - CACCAGTGTCTACCCCTGGA (общая прямая последовательность для дикого типа и трансгена), CGGCTACACAAAGCCAAACT (обратная последовательность дикого типа), CGCGCCTGAAGATATAGAAGA (обратная последовательность трансгена); для GFP - TGGACGGCGACGTAAACGGC (первая последовательность трансгена), GGCGGTCACGAACTCCAGCA (вторая последовательность трансгена), CTAGGCCACAGAATTGAAAGATCT (прямая последовательность внутреннего позитивного контроля), GTAGGTGGAAATTCTAGCATCATCC (обратная последовательность внутреннего позитивного контроля). Условия ПЦР указаны в таблице. Продукты ПЦР выявляли в 2.5% агарозном геле в TAE-буфере с бромистым этидием. Индукция Cre-рекомбинации тамоксифеном Для индукции Cre-рекомбинации использовали однократную внутрибрюшинную инъекцию тамоксифена (Sigma) в дозе 150 мг/кг, растворенного в кукурузном масле (Sigma), согласно описанной ранее методике [18]. Для опыт-индуцируемой Cre-рекомбинации инъекцию тамоксифена проводили за 24 ч до получения животным нового опыта. Обследование обстановки При обследовании обстановки мышей помещали в экспериментальную камеру на 5 мин и давали свободно ее обследовать. Известно, что такое обследование приводит к формированию у животных долговременной памяти [19]. В работе использовали две обстановки. Обстановка А представляла собой освещенную диффузным белым светом камеру (средний уровень освещенности 87 лк) размером 20 × 30 × 20 см, снабженную с электродным полом; уровень шума в камере составлял 7 дБ. Перед помещением каждого животного камеру протирали 40% раствором этилового спирта. Обстановка В представляла собой камеру размером 20 × 15 × 20 см с электродным полом; камера была освещена только источником ближнего инфракрасного света, невидимого для мышей; уровень шума в камере составлял 25 дБ. Перед помещением каждого животного камеру протирали 3% раствором уксусной кислоты. Нанесение немедленного электрокожного раздражения Нанесение электрокожного раздражения (ЭКР) проводили через 3 дня после обследования обстановки А. Для этого мышей помещали в обстановку А или обстановку В и немедленно наносили ЭКР силой 1 мА и длительностью 2 с, после чего сразу же возвращали в домашнюю клетку. Обучение в задаче условно-рефлекторного замирания (УРЗ) Для обучения УРЗ мышей помещали в обстановку А и через 120 с подавали звуковой сигнал (90 дБ, 5 кГц) длительностью 30 с. Последние 2 с звука сочетали с подачей ЭКР силой 1 мА. Через 30 с после окончания ЭКР мышей возвращали в домашнюю клетку. Экспериментальные группы Для оценки фоновой и опыт-индуцированной экспрессии eGFP использовали две группы животных: мышей группы «Обучение» (n = 4) обучали в задаче УРЗ как описано выше; мыши из группы «Контроль» (n = 4) при этом оставались в домашних клетках и не подвергались каким-либо воздействиям. Для определения фенотипа клеток, проходящих опыт-зависимую Cre-рекомбинацию, брали животных, которые обследовали обстановку А в течение 5 мин (n = 5). Для выявления двух популяций когнитивно активных нейронов в одном мозге использовали группы «А - А + ЭКР» (n = 5) и «А - В + ЭКР» (n = 5). Мыши группы «А - А + ЭКР» обследовали обстановку А и затем через 3 дня получали немедленное ЭКР в той же обстановке; мыши группы «А - В + ЭКР» обследовали обстановку В и через 3 дня получали немедленное ЭКР в обстановке В. Взятие образцов мозга и изготовление плавающих срезов Образцы мозга мышей забирали через 3 дня после предъявления животным нового опыта, сопровождавшегося Cre-рекомбинацией. В экспериментах по выявлению двух популяций активных нейронов образцы мозга мышей брали через 90 мин после второго когнитивного эпизода (нанесения ЭКР). Мышей наркотизировали внутрибрюшинной инъекцией 15% хлоралгидрата в физиологическом растворе. После этого проводили интракардиальную перфузию растворами фосфатного буфера и 4% параформальдегида в фосфатном буфере и извлекали мозг. Полученные образы мозга постфиксировали 4% раствором параформальдегида в фосфатном буфере: 2 ч при комнатной температуре и 14-18 ч при +4 °С. После этого образцы переносили в фосфатный буфер на 2 ч и изготавливали фронтальные срезы мозга толщиной 50 мкм с помощью вибратома Leica VT1200S (Leica). Срезы брали на расстоянии +2.46 и -1.34 мм от брегмы. Координаты срезов определяли с помощью стереотаксического атласа мозга мыши [20]. Выявление флуоресцентного белка eGFP и двойное иммуногистохимическое окрашивание В экспериментах по определению фоновой и опытиндуцированной экспрессии eGFP клетки, подвергшиеся Cre-рекомбинации, выявляли по собственной флуоресценции белка eGFP. Изготовленные срезы мозга заключали под покровные стекла с помощью водной среды Fluoromount™ Aqueous Mounting Medium (Sigma-Aldrich) и проводили оцифровку как описано ниже. В экспериментах по определению фенотипа и доли клеток, проходящих опыт-зависимую Creрекомбинацию, а также выявлению двух популяций когнитивно активных нейронов, подвергшиеся Creрекомбинации клетки выявляли иммуногистохимически при помощи окраски на белок eGFP. Срезы мозга подвергали процедуре пермеабилизации в 1% растворе Triton-Х100 (Sigma) в фосфатном буфере с 5% нормальной сывороткой осла (Sigma) и 5% нормальной сывороткой козла (Abcam) в течение 60 мин. После этого срезы трижды отмывали 0.2% раствором Triton-Х100 в фосфатном буфере по 5 мин. Затем проводили инкубацию с первичными антителами в течение 18 ч при +4°С. В разных реакциях использовали следующие первичные антитела для выявления различных маркеров: eGFP (Rabbit Anti-GFP Antibody, Life Technologies; разведение 1 : 250), eGFP (Chicken Anti-GFP Antibody, Aves Labs; разведение 1 : 500), с-Fos (Goat Anti-c-Fos Antibody, Santa Cruz Biotechnology; разведение 1 : 150), GFAP (Chicken Anti-GFAP Antibody, Abcam; разведение 1 : 500), NeuN (Mouse Anti-NeuN Antibody, EMD Millipore; разведение 1 : 500), CaMKII (Mouse Anti-CaMKII Antibody, EMD Millipore; разведение 1 : 200), SOM (Rabbit Anti-Somatostatin Antibody, Santa Cruz Biotechnology; разведение 1 : 1000), NPY (Rabbit Anti-Neuropeptide Y Antibody, Novus Biologicals; разведение 1 : 10000) и PV (Rabbit Anti-Parvalbumin Antibody, Abcam; разведение 1 : 10000). По окончанию инкубации срезы отмывали 0.2% раствором Triton-Х100 в фосфатном буфере 3 раза по 5 мин. Далее инкубировали срезы с вторичными антителами в течение 2 ч при комнатной температуре в темноте. В разных реакциях были использованы следующие вторичные антитела: AlexaFluor® 488 Donkey Anti-Goat Antibody (Life Technologies; разведение 1 : 500), AlexaFluor® 488 Goat Anti-Chicken Antibody (Life Technologies; разведение 1 : 500), AlexaFluor® 568 Donkey Anti-Rabbit Antibody (Life Technologies; разведение 1 : 500), AlexaFluor® 568 Goat Anti-Chicken Antibody (Life Technologies; разведение 1 : 500) или AlexaFluor® 568 Donkey AntiMouse Antibody (Life Technologies, разведение 1 : 500). После инкубации с вторичными антителами срезы отмывали 3 раза по 5 мин в 0.2% растворе Triton-Х100 в фосфатном буфере. После окончания окраски срезы заключали под покровные стекла с помощью водной среды Fluoromount™ Aqueous Mounting Medium (Sigma-Aldrich). Оцифровку срезов проводили на конфокальном микроскопе Olympus FV1000BW61WI (Olympus) при увеличении ×20. С каждого среза мозга получали 10-13 оптических срезов с шагом 5 мкм по оси Z. Подсчет eGFP-положительных клеток и анализ колокализаций Обработку полученных изображений и дальнейший анализ проводили в программе Imaris 7.1.0 (Bitplane). Поскольку окраска на eGFP является цитоплазматической и выявляет не только тела, но и отростки клеток, автоматический подсчет eGFP-положительных нейронов затруднителен. В связи с этим, eGFPположительные клетки отмечали вручную, а затем подсчитывали их количество автоматически. Окраски на NeuN и с-Fos являются ядерными, поэтому NeuN-положительные и с-Fos-положительные клетки выделяли и подсчитывали автоматически на основании размера и порогового уровня интенсивности окраски в красном канале. Для окрасок на eGFP, NeuN и с-Fos отмечали все положительные клетки, сомы которых полностью помещались в глубине среза по оси Z; клетки, сомы которых лежали на верхней и нижней границах срезов мозга по Z, не отмечали. Колокализацию eGFP с NeuN или с-Fos оценивали экспертно для каждой клетки в трех проекциях. Двойными положительными считали клетки, у которых NeuN- или с-Fos-положительное ядро было полностью окружено окрашенной на eGFP цитоплазмой. Двойные положительные клетки отмечали вручную и затем подсчитывали автоматически. Подсчет положительных клеток проводили по всей площади фронтальной ассоциативной коры на срезе мозга, а для совместной окраски с NeuN - также отдельно в слоях 1, 2/3, 5 и 6. Границы фронтальной ассоциативной коры определяли с помощью стереотаксического атласа мозга мыши [20]. Границы слоев определяли в соответствии с Алленовским атласом мозга мыши (Allen Mouse Brain Atlas, http://mouse. brain-map.org/static/atlas). От каждого животного анализировали по 3 среза фронтальной ассоциативной коры. Результаты подсчета положительных клеток усредняли для правого и левого полушария на одном срезе и трех срезов с одного мозга. Статистический анализ данных Статистическую обработку данных проводили с помощью пакета Prism 7 (GraphPad) с использованием двухвыборочного t-критерия, а также двухфакторного дисперсионного анализа ANOVA или дисперсионного анализа ANOVA с повторными измерениями и t-теста Сидака. Критический уровень значимости принимали равным р < 0.05. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Фоновая и опыт-индуцированная экспрессия зеленого флуоресцентного белка в мозге двойных трансгенных мышей Fos-Cre-eGFP В результате скрещивания мышей линий B6.129(Cg)-Fostm1.1(cre/ERT2)Luo/J и Tg(CAGBgeo/GFP)21Lbe/J получено потомство, часть которого была двойными трансгенными животными, несущими одновременно ген Cre-рекомбиназы под промотором c-fos и ген усиленного флуоресцентного белка eGFP под loxP-фланкированным стоп-сигналом (рис. 1). Для оценки базового уровня Cre-рекомбинации и опыт-зависимой индукции рекомбинации трансгенным мышам вводили тамоксифен и через 24 ч после инъекции обучали в задаче УРЗ (группа «Обучение») или оставляли в домашних клетках (группа «Контроль»). Через 3 дня на срезах мозга мышей выявляли eGFP (рис. 2). Нейроны, в которых выявлялся зеленый флуоресцентный белок - это нейроны, в которых происходила активация промотора гена c-fos и следующая за ней Creрекомбинация. У мышей из группы «Обучение» выявлено большое количество eGFP-положительных нейронов во всех структурах, специфически связанных с обучением УРЗ [21], а именно: в обонятельных ядрах, гиппокампе, миндалине, вентральном таламусе, а также в различных областях неокортекса - фронтальной ассоциативной, прелимбической, инфралимбической, цингулярной, ретросплениальной, теменной ассоциативной, височной ассоциативной, энторинальной, соматосенсорной, слуховой, зрительной, моторной, инсулярной и орбитальной (рис. 2Б,Г,Е,З). При этом у контрольных мышей eGFP-положительные клетки в перечисленных выше областях мозга почти не выявлялись (рис. 2А,В,Д,Ж). Единичные eGFPположительные клетки у контрольных животных отмечены только в некоторых областях неокортекса: в фронтальной ассоциативной, дорсолатеральной орбитальной, моторной, соматосенсорной, пириформной и экторинальной. Эти результаты свидетельствуют о том, что метод генетического маркирования активных нейронов у мышей Fos-Cre-eGFP позволяет успешно визуализировать активацию широко распределенной популяции нейронов, захватывающей большое число разнообразных структур головного мозга. Определение фенотипа клеток, проходящих опытзависимую Cre-рекомбинацию В эксперименте по определению типа клеток, проходящих опыт-зависимую Cre-рекомбинацию, мышей после инъекции тамоксифена помещали в новую для них обстановку А и через 3 дня выявляли пары маркеров: eGFP и одного из специфических маркеров типов клеток. В качестве маркера зрелых нейронов был выбран белок NeuN, который локализуется в ядрах практически всех типов нейронов в центральной нервной системе млекопитающих, за исключением клеток Пуркинье мозжечка, митральных клеток обонятельной луковицы и фоторецепторных клеток сетчатки [22]. В качестве клеточного маркера астроцитов был выбран белок GFAP [23]. Во всех исследованных структурах все eGFP-положительные клетки были также NeuN-положительными (рис. 3А,Б); при этом не выявлено ни одного случая колокализации eGFP с белком GFAP (рис. 3В). Нейроны головного мозга можно разделить на возбуждающие (пирамидные) и тормозные (интернейроны). Маркером возбуждающих нейронов может служить CaMKII. Данный фермент принимает участие в организации возбуждающих синапсов и никогда не синтезируется в ГАМКэргических интернейронах [24]. Интернейроны очень вариабельны по своим морфологическим, электрофизиологическим и биохимическим свойствам, в связи с чем их подразделяют на несколько разных типов, например, на основании синтеза специфических биохимических маркеров: PV, SOM и NPY [25]. Чтобы определить, к какому типу нейронов относятся клетки, проходящие Cre-рекомбинацию, мы оценили колокализацию белка eGFP и маркера возбуждающих пирамидных нейронов CaMKII или одного из маркеров тормозных интернейронов (PV, SOM и NPY). Нами не обнаружено колокализации eGFP ни с одним из маркеров интернейронов (рис. 4-6). При этом eGFP-положительные нейроны были также CaMKII-положительными, т.е. относились к возбуждающим пирамидным клеткам (рис. 7). CaMKII-положительные eGFP-положительные нейроны были выявлены в различных слоях неокортекса (рис. 7А), а также в пирамидном слое зоны СА1 и гранулярном слое зубчатой фасции гиппокампа (рис. 7Б). При иммуногистохимическом выявлении белка eGFP окрашивались не только тела клеток, но и значительная часть отростков. Визуальный анализ анатомии таких eGFP-положительных клеток также подтвердил заключение о том, что опыт-зависимая Cre-рекомбинация происходила именно в пирамидных клетках (рис. 7В,Г). Таким образом, по результатам молекулярного фенотипирования клеток было установлено, что опыт-зависимая Cre-рекомбинация у мышей FosCre-eGFP происходит только в нейронах, но не в глиальных клетках. При этом нейроны, проходящие Cre-рекомбинацию, относятся к возбуждающим пирамидным клеткам. Определение доли клеток, проходящих Cre-рекомбинацию после обследования животным новой обстановки Для того чтобы определить, какая доля нейронов подвергается опыт-зависимой Cre-рекомбинации после получения животным нового опыта, а также проанализировать паттерны распределения таких клеток в мозге, оценивали количество eGFP-положительных нейронов в различных слоях фронтальной ассоциативной коры у мышей, обследовавших обстановку на фоне действия тамоксифена (n = 5). Для оценки доли eGFP-положительных клеток от всех нейронов данного слоя проводили совместное выявление eGFP и маркера зрелых нейронов NeuN [22]. eGFP-положительные клетки обнаружены во всех слоях фронтальной ассоциативной коры, однако их количество было наибольшим в слоях 2/3 и 5 (F(1.298,5.191) = 41.47, р = 0.0009; попарные сравнения слоев 2/3 и 5 с другими слоями: р < 0.02), тогда как в слое 1 выявлялись только единичные нейроны, прошедшие Cre-рекомбинацию (рис. 8А). При этом доля eGFP-положительных клеток от всех нейронов, помеченных NeuN, также была наибольшей в слоях 2/3 и 5 (F(1.203,4.812) = 7.122, р = 0.0425; попарные сравнения слоев 2/3 и 5 со слоем 6: р < 0.02), и для всей фронтальной ассоциативной коры составляла в среднем 11.0% (рис. 8Б). Использование Cre-рекомбинации для выявления двух популяций когнитивно активных нейронов в одном мозге Активность Cre-рекомбиназы приводит к перманентному маркированию нейронов, активных во временном окне, ограниченном действием тамоксифена. Это открывает возможность повторно помещать такое животное с генетически маркированными нейронами в ситуацию приобретения нового или реактивации прошлого опыта, и затем выявлять в одном мозге две отдельные популяции нейронов, активные при двух разных когнитивных нагрузках. При этом нейроны, прошедшие Cre-рекомбинацию после первого когнитивного эпизода, можно выявить по наличию белка eGFP, а нейроны, активированные после второго эпизода, можно визуализировать иммуногистохимически по присутствию белка с-Fos. Ранее во фронтальной ассоциативной коре выявлен высокий уровень перекрытия популяций нейронов, помеченных при обследовании мышами новой обстановки (первый когнитивный эпизод) и последующем нанесении немедленного ЭКР в этой же обстановке через 25 мин после ее обследования (второй когнитивный эпизод) [26]. В связи с этим в нашем эксперименте для визуализации двух популяций нейронов, вовлеченных в различные когнитивные эпизоды, мышам давали обследовать новую обстановку на фоне действия тамоксифена и через 3 дня наносили немедленное ЭКР. Двойное иммуногистохимическое окрашивание образцов мозга позволило выявить нейроны активные при обследовании обстановки (по белку eGFP) или при нанесении немедленного ЭКР (по белку c-Fos), а также нейроны, которые были активны в обоих когнитивных эпизодах (eGFP и c-Fos) в различных областях мозга мышей (рис. 9). Нами проведена оценка количества нейронов, активированных при обследовании обстановки и последующем нанесении немедленного ЭКР, а также степени перекрытия этих популяций нейронов, во фронтальной ассоциативной коре мышей группы «А - А + ЭКР» и контрольных мышей из группы «А - В +ЭКР» (рис. 10). Обследование новой обстановки и нанесение немедленного ЭКР активировали сходные по объему популяции нейронов фронтальной ассоциативной коры, однако большее число нейронов активировалось в том случае, если ЭКР наносили в ранее обследованной обстановке А, чем в новой обстановке В (фактор «группа»: F(1,8) = 12.33, р = 0.0080; фактор «когнитивный эпизод»: F(1,8) = 11.37, р = 0.0098; взаимодействие факторов: F(1,8) = 3.947, р = 0.0404; сравнение количества с-Fos-положительных клеток у групп «А - А + ЭКР» и «А - В + ЭКР»: p = 0.0212) - см. рис. 10А. Кроме того, нанесение ЭКР в знакомой обстановке активировало больше нейронов, чем ее изначальное обследование (сравнение количества с-Fos-положительных и eGFP-положительных клеток у группы «А - А + ЭКР»: p = 0.01924). При этом доля нейронов, активных во время обследования новой обстановки и затем повторно активировавшихся при нанесении ЭКР, была значимо выше у группы «А - А + ЭКР» (48.8%), чем у группы «А - В + ЭКР» (4.2%) - p < 0.0001. Аналогичный результат получен и для доли нейронов, активных в обоих когнитивных эпизодах, от всех нейронов, активируемых при нанесении ЭКР (рис. 10Б). Результаты этого эксперимента указывают на возможность использования метода Cre-управляемого генетического маркирования нейронов для выявления и последующего анализа популяций нейронов, активных в одном мозге во время двух разных когнитивных эпизодов. Ранее для мечения двух популяций когнитивно активных нейронов была применена трансгенная технология, основанная на использовании системы tTA-tetO. В статье Reijmers и соавт. систему tTA-tetO использовали для анализа перекрытий популяций нейронов, активных во время формирования и реактивации памяти [27]. При этом для сопоставления этих популяций использовали два разных генетических маркера транскрипционной активации клеток - c-fos и zif268. Однако известно, что эти два гена имеют различный базовый уровень экспрессии, различные клеточные функции, разную специфичность по отношению к типам клеток мозга и активируются в ответ на различающиеся типы когнитивной активности животных [28]. Поэтому соотнесение вовлечения популяций нейронов в два эпизода когнитивной активности по этим двум различающимся маркерам представляет большие теоретические сложности и вызывает серьезные возражения. Кроме того, система tTA-tetO имеет и ряд методических ограничений: трансгенным мышам tTA-tetO в течение всей жизни необходимо вводить доксициклин, а генетическое маркирование нейронов возможно только в период отмены препарата. При этом временное окно активации системы после отмены доксициклина может занимать несколько дней, что приводит к большому числу неспецифически маркированных нейронов [27, 29]. Таким образом, трансгенная система с Cre-рекомбиназой представляется более адекватной для применения в экспериментах по выявлению в одном мозге двух нейрональных сетей, активных в разных когнитивных эпизодах. ЗАКЛЮЧЕНИЕ В работе получены двойные трансгенные мыши FosCre-eGFP, у которых в результате опыт-зависимой Cre-рекомбинации происходит генетическое маркирование нейронов, активных в период действия тамоксифена. У данных мышей наблюдали низкий фоновый уровень Cre-рекомбинации в спокойном состоянии и значительное увеличение количества eGFP-экспрессирующих генетически маркированных нейронов после эпизода приобретения нового опыта. Опыт-индуцированная Cre-рекомбинация у этих мышей проходит в большом числе структур головного мозга, принадлежащих к разным функциональным группам. При этом Cre-рекомбинация проходит в пирамидных возбуждающих нейронах, но не в тормозных интернейронах. Также показано, что метод Cre-опосредованного генетического маркирования нейронных сетей может быть успешно применен для выявления в одной нервной системе активности двух разных популяций нейронов, связанных с разными когнитивными эпизодами, а также для анализа степени перекрытия этих популяций нейронов.

Об авторах

О. И. Ивашкина

Национальный исследовательский центр «Курчатовский институт»; Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова

Автор, ответственный за переписку.
Email: k.anokhin@gmail.com
Россия

Н. С. Воробьева

Национальный исследовательский центр «Курчатовский институт»

Email: k.anokhin@gmail.com
Россия

А. М. Груздева

Национальный исследовательский центр «Курчатовский институт»

Email: k.anokhin@gmail.com
Россия

М. А. Рощина

Институт высшей нервной деятельности и нейрофизиологии РАН

Email: k.anokhin@gmail.com
Россия

К. А. Торопова

Национальный исследовательский центр «Курчатовский институт»; Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова

Email: k.anokhin@gmail.com
Россия

К. В. Анохин

Национальный исследовательский центр «Курчатовский институт»; Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова; Научно-исследовательский институт нормальной физиологии им. П.К. Анохина

Email: k.anokhin@gmail.com
Россия

Список литературы

Дополнительные файлы