Полногеномное секвенирование российских штаммов Neisseria gonorrhoeae, отнесенных к геногруппе ST 1407

Полный текст

ВВЕДЕНИЕ Гонококковая инфекция остается одним из наиболее распространенных заболеваний, передающихся половым путем. В 2012 году ВОЗ сообщала о 78.3 млн новых случаев гонореи среди лиц репродуктивного возраста [1]. В Российской Федерации в 2015 году зарегистрировано 27056 случаев гонококковой инфекции, что соответствует 18.5 на 100 000 населения [2]. И если российские показатели снижаются на 10-20% в год, то мировой тенденцией стал устойчивый рост заболеваемости. Это обстоятельство в значительной степени связано с появлением и распространением эпидемически значимых клонов Neisseria gonorrhoeae, проявляющих множественную устойчивость к антимикробным препаратам (в том числе к препаратам выбора - цефалоспоринам III поколения) [3]. Среди них в настоящее время наибольшее значение приобрел генетический вариант, который в соответствии с протоколом молекулярного типирования NG-MAST (от англ. Neisseria gonorrhoeae Multi Antigen Sequence Typing) [4] описан как ST 1407 [5]. К 2010 году этот ST-тип обнаружен в 20 из 21 страны Европейского союза, составляя более 10% изолятов в 13 из них (в том числе в Австрии, Бельгии, Италии, Голландии, Португалии, Румынии, Словении, Испании и Великобритании) [6]. При этом генетический анализ выявил у N. gonorrhoeae ST 1407 множественные детерминанты резистентности к антимикробным препаратам [7], что объясняет участившиеся случаи неэффективной терапии гонококковой инфекции [3, 5]. Эпидемическая значимость ST 1407 дополнительно определяется существованием филогенетически связанных с ним молекулярных типов N. gonorrhoeae, имеющих более чем на 99% идентичные нуклеотидные последовательности генов porB или tbpB, используемых при проведении NG-MASTтипирования, и в этой связи обозначаемых как представители геногруппы ST 1407. С их учетом доля N. gonorrhoeae, выделенных в странах Европейского союза, достигает 23% [6], а на Тайване один из представителей данной геногруппы - ST 4378 - занял доминирующее положение [8]. В Российской Федерации случаи гонококковой инфекции, вызванной N. gonorrhoeae ST 1407, имеют спорадический характер и регистрируются в городах с интенсивной туристической (Москва) или экономической (Калуга, Мурманск) миграцией из стран Европейского союза [9]. Немногочисленные вероятные представители геногруппы ST 1407, выявленные на территории Российской Федерации, впервые были описаны нами ранее [10]. Цель данной работы состояла в углубленной генетической характеристике подобных изолятов с использованием метода полногеномного секвенирования, в настоящее время ставшего востребованным инструментом анализа молекулярных механизмов антибиотикорезистентности и филогении патогенных микроорганизмов. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ Штаммы N. gonorrhoeae Объектом исследования стали три штамма N. gonorrhoeae, выделенные в 2015 году от пациентов с диагнозом «Гонококковая инфекция нижних отделов мочеполового тракта» (А54.0 по МКБ-10) и депонированные в специализированной коллекции ФГБУ «ГНЦДК» Минздрава России под номерами 20/15/004, 41/15/003 и 19/15/005. N. gonorrhoeae 20/15/004 выделен в Калуге от 41-летнего мужчины и при NG-MAST-типировании [4] охарактеризован как представитель эпидемически значимого типа ST 1407 (аллель 908 гена porB и аллель 110 гена tbpB согласно номенклатуре базы NG-MAST). Штамм N. gonorrhoeae 41/15/003 выделен в Томске от мужчины 19 лет и описан как новый сиквенс-тип ST 12556, имеющий ранее неизвестную комбинацию аллеля 6 гена tbpB и аллеля 971 гена porB, последний из которых характеризовался гомологией 99.97% с сиквенс-типом ST 1407. Штамм N. gonorrhoeae 19/15/005 выделен в Омске от женщины 31 года и также описан как новый ST 12450, особенности которого определялись сочетанием аллеля 931 гена porB с ранее неизвестным аллелем 2097 гена tbpB, имеющим гомологию 99.74% с шестью другими описанными ранее аллелем 6 этого гена. Анализ данных штаммов в составе выборки из 124 культур N. gonorrhoeae, проведенный на основе сравнения слитых последовательностей генов porB и tbpB с использованием программы MEGA 6 (Molecular Evolutionary Genetics Analysis version 6.0) [11], объединял их в единую геногруппу, соотнесенную с ST 1407 [10]. Анализ чувствительности исследуемых штаммов к шести антимикробным препаратам, ранее или в настоящее время рекомендованных при гонококковой инфекции, показал их устойчивость или умеренную чувствительность к бензилпенициллину, тетрациклину и ципрофлоксацину, дополняемую у N. gonorrhoeae 41/15/003 умеренной чувствительностью к азитромицину (табл. 1). Секвенирование генома N. gonorrhoeae Геномную ДНК выделяли с использованием набора «Проба-НК» («ДНК-Технология», Россия) из чистых культур N. gonorrhoeae, выращенных в течение 18-24 ч на шоколадном агаре с добавлением 1% ростовой добавки ISOVitalex (Becton Dickinson, США). Библиотеку случайных фрагментов ДНК размером 400-700 п.н. готовили по стандартному протоколу GS Rapid Library. Библиотеки амплифицировали с использованием эмульсионной ПЦР и комплекта реагентов GS Junior emPCR kit. Полногеномное секвенирование выполнено с применением 454 пиросеквенирующей технологии на приборе GS Junior (Roche, Швейцария). Каждый геном секвенирован в течение отдельного запуска с использованием набора реагентов GS Junior Titanium Sequensing Kit. Средняя кратность покрытия генома составляла не менее 20. Биоинформатические методы исследования Аннотацию секвенированных геномов N. gonorrhoeae проводили при помощи приложения Prokka [12] с использованием общедоступных референсных наборов аминокислотных последовательностей Swiss-Prot и UniProt. Кластеризацию осуществляли с использованием приложения CD-HIT [13] при 90% уровне сходства белков по длине и аминокислотной последовательности. Аннотацию рибосомных генов осуществляли при помощи программы Barrnap (https://github.com/tseemann/barrnap), поиск геномных островов - с использованием сервиса IslandViewer4 [14]. Поиск генетических детерминант устойчивости N. gonorrhoeae к антимикробным препаратам осуществляли при помощи сервиса RGI базы данных CARD [15]. Для NG-MAST-типирования N. gonorrhoeae использовали программу NGMASTER [16], для мультилокусного MLST-типирования - программу SRST2 [17]. На основании аминокислотных последовательностей белков трех исследуемых изолятов и 24 ранее секвенированных штаммов N. gonorrhoeae, а также N. meningitidis, N. lactamica и N. elongata, в приложении OrthoFinder [18] были выделены ортологические группы белков рода Neisseria. Проведено множественное корректирующее выравнивание каждой из 790 отобранных ортологических групп в программе MAFFT [19]. Отфильтрованные и конкатенированные выравнивания использованы для построения филогенетического дерева N. gonorrhoeae методом максимального правдоподобия в программе RAxML [20] с последующей визуализацией в графическом редакторе FigTree (http://tree.bio.ed.ac.uk/software/figtree/). Для оценки взаимосвязи между общей эволюцией кодирующих последовательностей и последовательностей, связанных с развитием устойчивости к антимикробным препаратам, были сформированы две выборки конкатенированных множественных выравниваний соответствующих ортогрупп, проведено вычисление p-дистанции в пределах каждой выборки. Соответствие между значениями в ячейках двух полученных матриц оценено с использованием коэффициента корреляции Спирмена. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Общая характеристика геномов N. gonorrhoeae Сборка геномов штаммов N. gonorrhoeae выявила у каждого из них по одной кольцевой хромосоме размером от 2223815 до 2271213 п.н., доля G+C в которых составляла 52.5-52.7% (табл. 2). Общее количество идентифицированных открытых рамок считывания составило 2448 (N. gonorrhoeae 20/15/004), 2297 (N. gonorrhoeae 41/15/003) и 2293 (N. gonorrhoeae 19/15/005), из которых 1332 (54.4%), 1266 (55.1%) и 1281 (55.9%) соответственно были аннотированы как белоккодирующие гены с известной функцией. В анализируемых геномах обнаружены по 49 (N. gonorrhoeae 20/15/004 и N. gonorrhoeae 41/15/003) или 47 (N. gonorrhoeae 19/15/005) генов тРНК, одному гену тмРНК, а также по четыре копии оперона 16S-23S-5S рРНК. У каждого штамма идентифицированы криптические плазмиды размером от 4556 (N. gonorrhoeae 20/15/004) до 5266 п.н. (N. gonorrhoeae 19/15/005), содержащие характерный для конъюгативных плазмид ген релаксосомы MobC, гены криптических лазмидных белков A, B и C, а также по пять открытых рамок считывания с неизвестными функциями. Соотнесение среднего значения покрытия плазмиды, деленного на среднее покрытие хромосомы, у штаммов 20/15/004 и 41/15/003 приводило к показателям 18.4 и 12.3 соответственно против 33.6 у штамма 19/15/005, что характеризовало обнаруженные плазмиды как многокопийные (> 10 копий на клетку). В целом на первом этапе биоинформатического анализа было выявлено сходство исследуемых геномов с референсным FA1090 (GenBank: AE004969) и некоторыми другими ранее секвенированными штаммами N. gonorrhoeae [21], в том числе относящимися к ST 1407 [22]. Некоторые количественные вариации сравниваемых геномов могли быть обусловлены их высокой пластичностью, традиционно объясняемой наличием профагов, транспозонов и инсерционных элементов IS110 и IS1016 [23], в значительном количестве обнаруженных в составе «геномных островов» у всех трех штаммов N. gonorrhoeae (табл. 2). Собранные de novo геномы депонированы в базу данных GenBank NCBI под номерами NTCT00000000 (N. gonorrhoeae 20/15/004), NTCS00000000 (N. gonorrhoeae 41/15/003) и NTCU00000000 (N. gonorrhoeae 19/15/005). Генетические детерминанты устойчивости N. gonorrhoeae к антимикробным препаратам На следующем этапе биоинформатического анализа проведен поиск и изучение четырех групп генов, кодирующих: 1) ферменты инактивации антибиотиков или модификации их мишеней; 2) белки-мишени, мутации в которых могут приводить к снижению их аффинности к соответствующим антимикробным препаратам; 3) транспортные белки, осуществляющие поступление антибиотиков в бактериальную клетку; 4) системы эффлюкса антибиотиков (табл. 3). Детерминанты устойчивости к β-лактамам (пенициллинам и цефалоспоринам) Проведенный поиск не выявил в составе анализируемых последовательностей N. gonorrhoeae генов blaТЕМ-1 или blaТЕМ-135, кодирующих ферменты β-лактамазы, гидролизующие лактамное кольцо в молекуле пенициллина и других структурно близких антибиотиков [24]. С другой стороны, последовательности хромосомных генов, кодирующих пенициллинсвязывающие белки (PBP, penicillin binding proteins), содержали ряд нуклеотидных замен, значимо снижающих чувствительность к β-лактамным антибиотикам. Так, в гене ponA (кодирует PBP1) во всех трех штаммах обнаружена мутация, приводящая к аминокислотной замене L421P и в 3-4 раза снижающая аффинность к пенициллинам в сравнении с белком дикого типа [25]. Еще более выраженные изменения выявлены при анализе гена penA (кодирует PBP2 ), структура которого у штаммов N. gonorrhoeae 20/15/004 и N. gonorrhoeae 41/15/003 соответствовала представлениям о мозаичном характере организации, возникшей в результате вероятной генетической рекомбинации с синантропными комменсалами видов N. cinerea и N. perflava [26]. Эта особенность сопровождалась появлением аминокислотных замен F504L, N512Y, G545S на С-концевом участке белка PBP2 , значимо снижающих скорость связывания его пептидилтрансферазного центра с антибиотиком и препятствующих функционально важным конформационным переходам [27]. В свою очередь, две другие аминокислотные замены, I312M и V316T, оцениваются как значимые при формировании устойчивости к цефалоспоринам, особенно в сочетании с G545S [28]. На этом фоне особенностью аллеля penA у N. gonorrhoeae 19/15/005 было наличие только двух аминокислотных замен - F504L и P551S, способных снижать уровень ацилирования РВР2 почти в такой же степени, как и несколько других мутаций на С-концевом участке данного белка [29]. Еще одним геном, вовлеченным в развитие устойчивости N. gonorrhoeae к β-лактамным антибиотикам, стал penB (в настоящее время чаще обозначаемый как porB), кодирующий порин PorB1b наружной мембраны. Аминокислотные замены G120K и A121N в данном белке, ведущие к снижению проницаемости мембраны для гидрофильных антибиотиков [30], обнаружены у N. gonorrhoeae 20/15/004 и N. gonorrhoeae 41/15/003, в то время как штамм N. gonorrhoeae 19/15/005 содержал одиночную замену G120D. Другой анализируемый ген, также имеющий отношение к устойчивости N. gonorrhoeae к β-лактамам и другим гидрофильным антибиотикам - ген pilQ (ранее известный как penC), продукт которого формирует во внешней мембране дополнительные поры, обеспечивающие возможность диффузии антибиотиков в периплазматическое пространство бактериальной клетки. Мутация в триплете, кодирующем 666 аминокислоту (Gly), или полная делеция гена pilQ способны еще более повысить уровень антибиотикоустойчивости N. gonorrhoeae, особенно в тех случаях, когда она сочетается с детерминантами устойчивости в генах penA и penB [31], однако в анализируемых нами геномах этот ген имел последовательность дикого типа. Завершая анализ детерминант устойчивости N. gonorrhoeae к β-лактамам, следует отметить три сцепленных гена, представленных у всех проанализированных штаммов, которые входят в состав Mtr-локуса (multiple transferable resistance), контролируемого репрессором MtrR, и кодируют систему эффлюкса MtrC-MtrD-MtrE. При этом анализ промоторной области гена mtrR позволил выявить в нем делецию A35del, обуславливающую снятие подобной репрессии с увеличением резистентности к антибиотику [32]. Эта мутация обнаружена в штамме N. gonorrhoeae 20/15/004 (ST 1407) и близкого к нему по структуре гена porB N. gonorrhoeae 41/15/003 (ST 12556), что согласуется с представлениями о наличии обсуждаемого механизма антибиотикорезистентности у гонококков, относящихся к NG-MAST-типу 1407 [5]. Детерминанты устойчивости к тетрациклинам Во всех трех анализируемых геномах в хромосомном гене rpsJ обнаружена точечная мутация, ведущая к аминокислотной замене V57M в рибосомном белке S10 30S субчастицы рибосомы. Эта замена приводит к нарушению связывания рибосомы с антибиотиком, что позволяет рассматривать указанный механизм как базовый в определении устойчивости N. gonorrhoeae к тетрациклинам [33]. С другой стороны, голландский или американский варианты гена tetM [34], белковые продукты которых интерферируют с факторами элонгации EF-G и EFTu и делают рибосому недоступной для взаимодействия с антибиотиком, не обнаружены в геномах трех исследованных штаммов. В свою очередь, неспецифические механизмы устойчивости анализируемых штаммов к тетрациклинам (как и в случае β-лактамов) включали мутации в белке PorB1b и систему эффлюкса MtrC-MtrDMtrE, эффективно дополняющие специфический механизм устойчивости, определяемый мутацией в гене rpsJ [33]. Детерминанты устойчивости к спектиномицину Нуклеотидная последовательность гена rrs соответствовала последовательности гена дикого типа с сохранением остатка цитозина в положении 1186 (соответствует позиции 1192 у Escherichia coli), ключевого нуклеотида сайта связывания аминоциклитолов на спирали 34 16S РНК [35]. Другая проанализированная хромосомная детерминанта - ген rpsE, кодирующий рибосомный белок S5 30S субъединицы рибосомы, мутации в котором способны вести к устойчивости к спектиномицину при сохранении гена rrs дикого типа. Однако поиск возможных аминокислотных замен T24P [36] и K28E, а также делеции кодона 27 (Val) [37] заставил констатировать соответствие rpsE гену дикого типа. Детерминанты устойчивости к макролидам Генетический кластер ermA/B/C/F, кодирующий рРНК-метилазы, модифицирующие сайты связывания макролидов с молекулой 23S рРНК, не обнаружен ни в одном из проанализированных геномов. Поиск мутаций A2059G и C2611T в гене rrl, нарушающих взаимодействие макролидных антибиотиков с мишенью - пептидилтрансферазным центром в домене V 23S рРНК [38], заставил отнести все три штамма к дикому типу. Дикому типу соответствовали также гены rplD и rplV, продукты которых - рибосомные белки L4 и L22 - первично связаны с доменом I 23S рРНК, однако имеют множественные сайты взаимодействия с другими доменами 23S рРНК. Мутации в белках L4 и L22 приводят к изменениям конформации доменов II, III и V, что, в свою очередь, может повлиять на чувствительность микроорганизмов к макролидам [39]. Анализ механизмов устойчивости N. gonorrhoeae к макролидам позволил выявить во всех трех геномах функциональные аллели генов macA и macB, кодирующих комплекс MacA-MacB, специфично распознающий и удаляющий антибиотик из периплазмы бактериальных клеток [40]. Однако анализ позиции -10 промоторов этих генов указывал на его соответствие дикому типу без дополнительного усиления эффлюкса. Дикому типу в исследуемых геномах соответствовал и ген mefA, кодирующий другой транспортный белок, обуславливающий устойчивость к макролидам [41]. Детерминанты устойчивости к фторхинолонам Поиск хромосомных мутаций, определяющих устойчивость N. gonorrhoeae к фторхинолонам, проводили путем анализа участков QRDR (quinolone resistancedetermining regions) в генах gyrA, parC и parE, кодирующих субъединицу А ДНК-гиразы, а также субъединицы C и E топоизомеразы IV - мишени фторхинолонов. Во всех трех штаммах в гене gyrA обнаружены однонуклеотидные полиморфизмы TCC → TTC и GAC → GGC, ведущие к аминокислотным заменам S91F и D95G, связанным с устойчивостью N. gonorrhoeae к фторхинолонам [42]. Ген parC у N. gonorrhoeae 20/15/004 и N. gonorrhoeae 41/15/003 содержал триплеты дикого типа (86(D) и 88(S)), что свидетельствовало о наличии двойной мутации, приводящей к заменам S87R и E91A. В сочетании с изменениями в ДНК-гиразе такая мутация существенно модифицировала структуру так называемого хинолонового кармана [43] и исключала возможность взаимодействия антимикробного препарата с мишенью. Анализ всех четырех аминокислотных замен показал, что геном N. gonorrhoeae 19/15/005 содержит ген parC дикого типа. В свою очередь, установлено, что во всех исследованных штаммах N. gonorrhoeae сохранен ген parE дикого типа. При характеристике неспецифического механизма устойчивости N. gonorrhoeae к фторхинолонам следует указать на присутствие в геноме каждого из исследованных штаммов по одной функциональной копии гена norM, кодирующего мембранный транспортер, удаляющий катионные антибактериальные препараты из бактериальной клетки [44]. В то же время анализ промоторной области в позиции -35 указывает на этот ген как на ген дикого типа, что не предполагает дополнительного усиления эффлюкса. Молекулярное типирование и филогенетический анализ N. gonorrhoeae Различия в детерминантах антибиотикорезистентности в геномах исследуемых штаммов N. gonorrhoeae потребовали ревизии представлений о степени их филогенетической близости. С этой целью использовали сочетание типирования NG-MAST и MLST (multi locus sequence typing), а также построение дендрограммы, основанной на сопоставлении всей совокупности генов домашнего хозяйства. Результаты анализа секвенированных геномов с использованием программы NGMASTER [16] выявили полное совпадение с исходными данными, согласно которым анализируемые штаммы относятся к типам ST 1407, ST 12556 и ST 12450 (табл. 4). В свою очередь, SRST2-анализ [17] нуклеотидных последовательностей консервативных генов abcZ, adk, aroE, fumC, gdh, pdhC и pgm [45] идентифицировал штаммы N. gonorrhoeae 20/15/004 и N. gonorrhoeae 41/15/003 как штаммы, относящиеся к MLST-типу 1901, который, согласно данным NGMAST-типирования, соответствует эпидемически значимому ST 1407 [5]. С другой стороны, характеристики нуклеотидных последовательностей четырех из семи аллелей N. gonorrhoeae 19/15/005 позволили отнести данный штамм к MLST-типу 6721, ранее не упоминаемому в публикациях по проблеме антибиотикорезистентности и не имеющему описания филогенетической общности с ST 1407. Филогенетические взаимоотношения между штаммами оценивали на основе сравнения всей совокупности 790 ортологических групп генов домашнего хозяйства у представителей семейства Neisseriaceae. Дополнительно использовали представленные в базе данных NCBI сведения о геномах N. meningitidis и 24 штаммов N. gonorrhoeae, в том числе референсного штамма FA 19, пяти ранее секвенированных штаммов ST 1407 и 18 штаммов других NG-MAST-типов. Филогенетическое дерево, построенное по методу максимального подобия с использованием программы RAxML [20] на основе модели замен Gamma в сочетании с матрицей весов BLOSUM62, представлено на рисунке. Для оценки взаимосвязи эволюции нейтральных кодирующих последовательностей и последовательностей, вовлеченных в развитие антибиотикорезистентности, данному дереву была противопоставлена дендрограмма, построенная для ортогрупп, связанных с устойчивостью к антимикробным препаратам. Полученные данные указывали на чрезвычайно высокую степень генотипического подобия штаммов 20/15/004 (ST 1407) и 41/15/003 (ST 12556) на основе совокупности генов домашнего хозяйства, объединяемых в единый кластер с другими ранее секвенированными представителями ST 1407, а также ST 6146 и ST 3520. Тем самым результаты проведенного исследования подтверждали версию о тесной генетической связи между анализирумыми штаммами, первый из которых появился в российской популяции N. gonorrhoeae при вероятной трансграничной миграции, а второй произошел от их общего предка в результате единичных мутационных событий. С другой стороны, на филогенетическом дереве генов домашнего хозяйства третий исследуемый штамм 19/15/005 (ST 12450) был достаточно удален от геногруппы ST 1407, не обладая выраженной генотипической близостью с какой-либо из сформированных геногрупп. Соответственно установлено выраженное расхождение между первичным молекулярным типированием и результатами полногеномного секвенирования данного штамма, что указывает на полифилетичность антибиотикорезистентных штаммов в современной российской популяции N. gonorrhoeae. Сопоставление конкатенированных множественных выравниваний нейтральных кодирующих последовательностей и последовательностей, связанных с развитием устойчивости к антимикробным препаратам, позволило выявить статистически значимую (p < 0.001) положительную корреляцию (коэффициент Пирсона 0.44) между ними. В частности, подобное соответствие показано для представителей геногруппы ST 1407 (в том числе штаммов 20/15/004 и 41/15/003), за исключением ST 3520, описываемого так же, как изолят с мозаичной структурой гена penA [46], но, вероятно, относительно независимо сформировавшим собственные механизмы антибиотикорезистентности. Анализ N. gonorrhoeae 19/15/005 (ST 12450) подтвердил его относительно независимое филогенетическое положение. ЗАКЛЮЧЕНИЕ Нами проведено полногеномное секвенирование трех штаммов N. gonorrhoeae, выделенных на территории Российской Федерации в 2015 году [10]. Эти штаммы обладают множественной устойчивостью к антимикробным препаратам и по результатам NG-MASTтипирования предварительно отнесены к эпидемически значимой геногруппе ST 1407, получившей в настоящее время глобальное распространение [6, 8]. Анализ геномов этих штаммов выявил их принципиальное соответствие референсному штамму N. gonorrhoeae FA1090 [21] и ранее секвенированным представителям ST 1407 [22]. Обнаруженное отсутствие генов ermA/B/C/F, а также сохранение аллелей дикого типа генов rpsE, rrs, rrl, rplD, rplV, macAB и mefA, мутации в которых связаны с формированием устойчивости к аминоциклитолам (спектиномицин) и макролидам (азитромицин), объясняет чувствительность исследуемых штаммов к названным группам антимикробных препаратов. С другой стороны, на фоне отсутствия детерминант резистентности с конъюгативным механизмом передачи (blaTEM, tetM) и аллелей дикого типа penC/pilQ, parE и norM в ряде генов, кодирующих мишени антимикробных препаратов, выявлены одиночные или множественные полиморфизмы. Эти полиморфизмы, обуславливающие устойчивость к β-лактамам (ponA, pеnA), тетрациклинам (rpsJ) и фторхинолонам (gyrA, parC), дополняют мутации в гене porB и промоторе гена mtrR, неспецифически повышающие устойчивость к антибиотикам за счет нарушения их поступления в бактериальную клетку или усиления эффлюкса. Таким образом, результаты полногеномного секвенирования достаточно хорошо согласуются с предварительно полученными данными фенотипического анализа. Одновременно следует отметить, что анализ генетических детерминант резистентности позволил лишь прогнозировать чувствительность или устойчивость к определенным группам антимикробных препаратов, не позволяя конвертировать полученные данные в значения их МПК. В частности, при высоком сходстве генотипов N. gonorrhoeae 20/15/004 (ST 1407) и 41/15/003 (ST 12556) необъясненным остается 2-4-кратный рост устойчивости последнего к пенициллину, цефтриаксону, тетрациклину и азитромицину. С другой стороны, на фоне различий в спектрах мутаций в генах, вовлеченных в формирование антибиотикорезистентности у N. gonorrhoeae 20/15/004 (ST 1407) и 19/15/005 (ST 12450), параметры их устойчивости к антимикробным препаратам оказались достаточно близкими. Указанное обстоятельство определяет актуальность поиска дополнительных механизмов антибиотикорезистентности N. gonorrhoeae, а также значимость разработки компьютерных алгоритмов, призванных обеспечить достаточную сходимость результатов генотипического и фенотипического анализа [47]. Другим важным результатом стала ревизия представлений о степени филогенетической близости исследуемых клинических изолятов, изначально сформированных на основе данных NGMAST-типирования. Проведенное исследование подтвердило высокую степень гомологии геномов N. gonorrhoeae 20/15/004 (ST 1407) и N. gonorrhoeae 41/15/003 (ST 12556), последний из которых, вероятно, сформировался в Российской Федерации вследствие дивергенции от представителя глобально распространенного клона ST 1407. С другой стороны, штамм N. gonorrhoeae 19/15/005 (ST 12450) можно рассматривать как пример фено- и генотипической конвергенции с названной выше геногруппой, у которого независимо выработались собственные, хотя и частично сходные, механизмы антибиотикорезистентности. Полученный результат свидетельствует о полифилетичности антибиотикорезистентных штаммов в российской популяции N. gonorrhoeae, что определяет необходимость выявления и учета расширенного перечня эпидемически значимых генотипов.

Об авторах

A. A. Кубанов

Государственный научный центр дерматовенерологии и косметологии Минздрава России

Email: dgderyabin@yandex.ru
Россия

A. В. Рунина

Государственный научный центр дерматовенерологии и косметологии Минздрава России

Email: dgderyabin@yandex.ru
Россия

A. В. Честков

Государственный научный центр дерматовенерологии и косметологии Минздрава России

Email: dgderyabin@yandex.ru
Россия

A. В. Кудрявцева

Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН

Email: dgderyabin@yandex.ru
Россия

Ю. A. Пеков

Студия анализа данных «Ксивелью»

Email: dgderyabin@yandex.ru
Россия

И. O. Корвиго

Студия анализа данных «Ксивелью»

Email: dgderyabin@yandex.ru
Россия

Д. Г. Дерябин

Государственный научный центр дерматовенерологии и косметологии Минздрава России

Автор, ответственный за переписку.
Email: dgderyabin@yandex.ru
Россия

Список литературы

Дополнительные файлы