Отправить статью по E-mail Предпочтительная конформация связывания канонических субстратов бутирилхолинэстеразы непродуктивна для экотиофата
- Авторы: Злобин A.С.1,2, Залевский A.O.1,2,3, Мокрушина Ю.A.2, Карцева O.В.2, Головин A.В.1,3, Смирнов И.В.2,4,5
-
Учреждения:
- Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, факультет биоинженерии и биоинформатики
- Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН
- Институт молекулярной медицины, Первый МГМУ им. И.М. Сеченова
- Национальный исследовательский университет «Высшая школа экономики»
- Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова
- Выпуск: Том 10, № 4 (2018)
- Страницы: 121-124
- Раздел: Краткие сообщения
- Дата подачи: 17.01.2020
- Дата публикации: 15.12.2018
- URL: https://actanaturae.ru/2075-8251/article/view/10329
- DOI: https://doi.org/10.32607/20758251-2018-10-4-121-124
- ID: 10329
Цитировать
Аннотация
Впервые на атомистическом уровне описано взаимодействие фермента бутирилхолинэстеразы с экотиофатом - популярным модельным соединением, аналогом боевых отравляющих веществ VX и VR. При помощи методов молекулярного моделирования обнаружена конкуренция между двумя конформациями экотиофата в активном центре. Первая, близкая к конформации для способа связывания субстратов холинового ряда - бутирилхолина и бутирилтиохолина, - является ингибирующей, так как не способна к реакции с ферментом; вторая, реакционноспособная, обладает существенно худшей оценкой энергии связывания. Таким образом, экотиофат совмещает черты ингибиторов двух типов: конкурентного и суицидального. Данное наблюдение поможет уточнить кинетическую схему реакции для аккуратной оценки кинетических констант, что особенно важно при дизайне новых вариантов бутирилхолинэстеразы, способных к полному циклу гидролиза фосфорорганических соединений.
Ключевые слова
Полный текст
ВВЕДЕНИЕ Бутирилхолинэстераза (БуХЭ) - фермент, который обладает широкой субстратной специфичностью, благодаря чему представляет значительный интерес в качестве объекта для создания антидотов против ядов на основе фосфорорганических соединений, например газов VX и VR [1, 2]. В то же время для холинэстераз характерна чрезвычайно сложная кинетическая схема реакции, обусловленная, в том числе, наличием дополнительного периферического анионного сайта связывания лиганда (PAS). Рассмотрение PAS для характеристического субстрата БуХЭ - бутирилтиохолина - увеличивает общее количество состояний до восьми [3]. Если же субстрат способен вызывать необратимую инактивацию фермента изза образования стабильного фосфорилированного комплекса, то кинетическая схема может усложниться еще больше. Одним из таких субстратов, сочетающих и холиновый фрагмент, и возможность инактивации, является экотиофат - менее токсичный аналог боевых отравляющих веществ V-серии, который используется в качестве модельного фосфорорганического соединения при изучении реакционной способности бутирилхолинэстеразы и ее модификаций, устойчивых к инактивации. В нашей работе взаимодействие экотиофата с БуХЭ изучено с целью оценки применимости для них кинетических схем, предложенных для бутирилтиохолина. Мы решили использовать методы молекулярного моделирования, так как они дают атомистическое понимание происходящих событий и ранее доказали свою эффективность для понимания механизмов реакции БуХЭ с некоторыми субстратами [4] и даже для рационального изменения БуХЭ и трансформации ее в кокаингидролизирующий фермент [5]. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ Моделирование молекулярного докинга было проведено в пакете Autodock Vina [6]. Для докинга была выбрана структура БуХЭ PDB ID 1XLW, ковалентно конъюгированная с продуктом фосфорилирования экотиофатом - диэтилфосфатным остатком (DEP). DEP был удален, а недостающие остатки V377-D378-D379-Q380 и C66 достроены на основе структуры PDB ID 2XMD, так как структуры достаточно похожи (среднеквадратичное отклонение (RMSD), оцененное по всем тяжелым атомам, составило 0.4 Å). Структура экотиофата создана в пакете Avogadro [7]. Подготовку входных файлов и обработку результатов проводили при помощи инструментов пакета AutoDock Tools [8]. Ячейка для докинга была отцентрирована так, чтобы включать весь карман связывания. Размер ячейки составил 20 Å по всем измерениям. Для эффективного сканирования параметр «exhaustiveness» был установлен в значение 64 и проведены 20 независимых повторностей. Во время докинга фермент оставался жестким, в то время как лиганд имел все степени свободы. Стартовые конфигурации БуХЭ c лигандом были взяты из процедуры докинга. Моделирование метадинамики и обработку результатов проводили как описано ранее [9]. В качестве коллективной переменной использовали расстояние O(Ser198)-P(ECH). Потенциал метадинамики величиной 2 кДж/моль и адаптивной шириной, рассчитанной на основании диффузионного критерия по предшествующим 220 шагам, накладывался каждые 220 шагов моделирования. Для каждого варианта связывания экотиофата сделано по три независимых реплики. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Поиск положения экотиофата в структуре бутирилхолинэстеразы человека (PBD ID 1XLW) проведен с помощью процедуры докинга. Особый интерес представляли положения экотиофата в активном центре, потенциально способные к прохождению реакции (состояние ES в кинетической схеме [3]). Поэтому для анализа мы выбрали две основные метрики: расстояние между кислородом каталитического Ser198 и атомом фосфора экотиофата и расстояние между центром масс оксианионного центра, образованного атомами азота остова остатков G116, G117, A199, и фосфорильным кислородом экотиофата. Вторая метрика выбрана, так как координация кислорода оксианионным центром является важной составляющей связывания и позиционирования в известных механизмах реакции [3]. Фильтрация по таким критериям позволила выделить три лучших кластера положений run6_2, run2_15, run11_16 (рис. 1). Согласно оценочной функции AutoDock Vina, положение run6_2 имеет энергию связывания на ~0.4 ккал/моль лучше, чем два других. Интересно, что такое же расположение холинового фрагмента наблюдается в случае гидролиза ацетилтиохолина [4] и, по-видимому, характерно для лигандов подобной химической природы. В данном случае ключевым является взаимодействие положительного заряда холиновой группы с ароматической π-системой Trp82 [10]. Остаток Glu197, участвующий в катализе, при этом оказывает меньший эффект [10]. В то же время такое расположение лиганда приводит к тому, что уходящая группа - тиохолин - расположен не на линии нуклеофильной атаки. В противоположность этому, в положении run11_16 тиохолин находится на одной линии с атакующим OG Ser198 (рис. 2), а расположение этильных заместителей похоже на расположение ковалентного интермедиата PDB ID 1XLW в кристаллической структуре [11]. Холиновая группа, в свою очередь, может электростатически взаимодействовать с отрицательно заряженным Asp70 и ароматической π-системой Tyr332, входящих в периферийный анионный сайт (PAS) [10]. Ранее предположили, что именно такое положение наиболее вероятно для гидролиза экотиофата, а важность контакта c остатком Asp70 подтверждена серией мутантов Asp70Gly и Asp70Lys [12]. При этом связывание второй молекулы субстрата в PAS невозможно. Положение run2_15 является промежуточным - положение фосфата соответствует таковому у run6_2, а холиновый хвост занимает переходное положение между run6_2 и run11_16 (рис. 2). Для оценки реакционной способности всех трех положений мы применили гибридное квантово-механическое/молекулярно-механическое (КМ/ММ) моделирование. В совокупности с методом, повышающим эффективность семплирования - метадинамикой, это позволило оценить энергетические барьеры реакций [9]. Значения, полученные для run6_2, run2_15, run11_16, составляют 15.9 ± 0.7, 15.9 ± 1.9, 5.7 ± 0.4 ккал/моль соответственно (рис. 3). Они находятся в рамках, характерных для ферментативных реакций в целом, и соотносятся со значениями, полученными при изучении данной реакции в БуХЭ с другими субстратами и с помощью других вычислительных методов [5]. Но при этом заметен более низкий барьер реакции в системе, где стартовое положение лиганда таково, что уходящая группа - тиохолин - находится на одной линии с атакующим кислородом OG Ser198, делает протекание реакции из подобного стартового положения приблизительно в 107 раз более вероятным. ЗАКЛЮЧЕНИЕ При помощи методов молекулярного моделирования мы обнаружили существование двух возможных конкурирующих конформаций экотиофата в активном центре бутирилхолинэстеразы. Существование первой, реакционноспособной, предсказано ранее. Вторая - близкая по режиму связывания к субстратам холиновой группы и обладающая лучшей оценкой энергии связывания, является ингибирующей. Учет обоих состояний позволит уточнить кинетическую схему реакции экотиофата с бутирилхолинэстеразой, что необходимо для корректной оценки кинетических констант при дизайне вариантов бутирилхолинэстеразы с фосфатазной активностью.
Об авторах
A. С. Злобин
Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, факультет биоинженерии и биоинформатики; Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН
Email: aozalevsky@fbb.msu.ru
Россия
A. O. Залевский
Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, факультет биоинженерии и биоинформатики; Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН; Институт молекулярной медицины, Первый МГМУ им. И.М. Сеченова
Автор, ответственный за переписку.
Email: aozalevsky@fbb.msu.ru
Россия
Ю. A. Мокрушина
Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН
Email: aozalevsky@fbb.msu.ru
Россия
O. В. Карцева
Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН
Email: aozalevsky@fbb.msu.ru
Россия
A. В. Головин
Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, факультет биоинженерии и биоинформатики; Институт молекулярной медицины, Первый МГМУ им. И.М. Сеченова
Email: aozalevsky@fbb.msu.ru
Россия
И. В. Смирнов
Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН; Национальный исследовательский университет «Высшая школа экономики»; Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова
Email: aozalevsky@fbb.msu.ru
Россия
Список литературы
- Ilyushin D.G., Smirnov I.V., Belogurov A.A. Jr., Dyachenko I.A., Zharmukhamedova T.I., Novozhilova T.I., Bychikhin E.A., Serebryakova M.V., Kharybin O.N., Murashev A.N. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2013, V.110, P.1243-1248
- Terekhov S.S., Smirnov I.V., Shamborant O.G., Bobik T.V., Ilyushin D.G., Murashev A.N., Dyachenko I.A., Palikov V.A., Knorre V.D., Belogurov A.A. // Acta Naturae. 2015, V.7, P.136-141
- Bevc S., Konc J., Stojan J., Hodošček M., Penca M., Praprotnik M., Janežič D. // PLoS One. 2011, V.6, e22265
- Chen X., Fang L., Liu J., Zhan C.G. // Biochemistry. 2012, V.51, P.1297-1305
- Zheng F., Xue L., Hou S., Liu J., Zhan M., Yang W., Zhan C.G. // Nature Comm. 2014, V.5, P.3457
- Trott O., Olson A.J. // J. Comp. Chem. 2010, V.31, P.455-461
- Hanwell M.D., Curtis D.E., Lonie D.C., Vandermeersch T., Zurek E., Hutchison G.R. // J. Cheminform. 2012, V.4, P.17
- Morris G.M., Huey R., Lindstrom W., Sanner M.F., Belew R.K., Goodsell D.S., Olson A.J. // J. Comp. Chem. 2009, V.30, P.2785-2791
- Zlobin A., Mokrushina Y., Terekhov S., Zalevsky A., Bobik T., Stepanova A., Aliseychik M., Kartseva O., Panteleev S., Golovin A. // Front. Pharmacol. 2018, V.9, P.834
- Nachon F., Ehret-Sabatier L., Loew D., Colas C., van Dorsselaer A., Goeldner M. // Biochemistry. 1998, V.37, P.10507-10513
- Nachon F., Asojo O.A., Borgstahl G.E.O., Masson P., Lockridge O. // Biochemistry. 2005, V.44, P.1154-1162
- Masson P., Froment M.T., Bartels C.F., Lockridge O. // Biochem. J. 1997, V.325, Pt1, P.53-61
Дополнительные файлы
