Lynx1 предотвращает нарушение долговременной потенциации и экспрессии нейромодулятора, вызванные Aβ1-42 и активацией JNK

Полный текст

ВВЕДЕНИЕ Многие нейродегенеративные заболевания, например болезнь Альцгеймера (БА), характеризуются нарушениями когнитивных процессов, связанными с дисфункцией никотиновых ацетилхолиновых рецепторов (nAChR) [1]. При БА происходит формирование бляшек, состоящих из олигомеров β-амилоидного пептида (Аβ), самой токсичной формой которого является Аβ1-42 [1]. Аβ1-42 в концентрации 200 нМ ингибирует работу α7-nAChR - наиболее распространенного в головном мозге никотинового холинорецептора, а взаимодействие Аβ с этим рецептором при БА приводит к его интернализации [1]. Кроме того, Aβ ингибирует долговременную потенциацию (ДВП) [2], лежащую в основе памяти и обучения [3]. Ранее мы показали, что водорастворимый вариант белка человека Lynx1 (ws-Lynx1) [4], модулирующего работу α7-nAChR в мозге [5], конкурирует с Аβ1-42 за связывание с α7-nAChR [6]. На культуре нейронов коры головного мозга мыши показано, что предынкубация с ws-Lynx1 снижает цитотоксический эффект Аβ1-42 [6]. Кроме того, с помощью Вестерн-блотинга обнаружено, что экспрессия Lynx1 снижена в коре головного мозга трансгенных мышей, моделирующих БА (3×Tg-AD) по сравнению с мышами дикого типа [6]. Это позволило нам предположить, что Lynx1 играет важную роль при БА, и именно накопление Аβ1-42 приводит к снижению уровня этого нейромодулятора в мозге и влечет за собой нарушение баланса Аβ1-42/Lynx1, вызывая нарушение работы α7-nAChR. Нами изучено влияние Аβ1-42 на экспрессию гена Lynx1 в первичных нейронах коры и гиппокампа крысы, на срезах гиппокампа мыши оценено влияние ws-Lynx1 и Аβ1-42 на ДВП. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ Первичную культуру нейронов получали из коры и гиппокампа новорожденных крысят линии Wistar по описанной ранее методике [7]. На 14-й день к культуре нейронов добавляли либо Аβ1-42 (1 или 5 мкМ, Biopeptide Co), олигомеризованный по ранее описанному протоколу [8], либо 5 мкМ Аβ42-1 (обратный пептид использовали в качестве отрицательного контроля, Biopeptide Co), либо 10 мкМ ws-Lynx1 (получали согласно [4]), либо смесь (5 мкМ Аβ1-42 + 10 мкМ wsLynx1), либо 2.5 мкМ SP600125 (Tocris), либо смесь (5 мкМ Аβ1-42 + 2.5 мкМ SP600125) и инкубировали дополнительно в течение 24 ч. Для нокдауна JNK культуру кортикальных нейронов трансфицировали малыми интерферирующими РНК (siРНК) к JNK-1 и JNK-2. В качестве контроля использовали последовательность РНК, приведенную в табл. 1. Нейроны коры на 10-й день культивирования трансфицировали либо siРНК к генам JNK-1 и JNK-2, либо контрольной siРНК. После этого культуру нейронов инкубировали в течение 72 ч, добавляли 5 мкМ Аβ1-42 и инкубировали в течение еще 24 ч. Затем с помощью реактива ExtractRNA («Евроген») выделяли суммарную мРНК. мРНК обрабатывали ДНКазой I (Thermo Fisher Scientific, США), после чего синтезировали кДНК при помощи набора MMLV RT kit («Евроген»). ПЦР в реальном времени проводили при помощи готовой 5-кратной смеси qPCRmix-HS SYBR + HighROX («Евроген»), список праймеров приведен в табл. 2. Данные анализировали с помощью программы LinReg 2017.0. Уровень мРНК генов нормировали на уровень мРНК β-актина. Свежеприготовленные переживающие срезы гиппокампа мышей линии C57BL/6 восьмимесячного возраста перфузировали искусственным раствором цереброспинальной жидкости (ИЦЖ) следующего состава: 124 мM NaCl, 3 мM KCl, 2.5 мM CaCl2, 1.3 мM MgCl2, 26 мM NaHCO3, 1.27 мM NaH2 PO4 и 10 мM D-глюкозы, pH 7.4, непрерывно насыщаемого карбогеном (95% О2 + 5% СО2 ) при 34°С в течение 1 ч. Затем одну часть срезов перфузировали ИЦЖ, содержащей 200 нМ Aβ1-42, а другую - ИЦЖ, содержащей 200 нМ Aβ1-42 + 2 мкМ ws-Lynx1 в течение 1 ч. Контрольные срезы перфузировали ИЦЖ, не содержащей ни Aβ1-42, ни ws-Lynx1. После инкубации срезы мозга помещали в камеры установки SliceMaster (Scientifica, Великобритания), предназначенные для регистрации фокальных возбуждающих постсинаптических потенциалов (фВПСП). На протяжении всей регистрации поддерживали температуру 32-34°C. С помощью стеклянного микроэлектрода, заполненного ИЦЖ (сопротивление 1-3 МОм), в пирамидном слое поля СА1 регистрировали фокальный ответ, вызываемый стимуляцией радиального слоя, используя протокол парной стимуляции (межстимульный интервал 50 мс, частота 0.033 Гц). После 20-минутной записи тестовых ответов подавался протокол высокочастотной стимуляции (ВЧС) для индукции ДВП: 10 серий с частотой 100 Гц (пять стимулов в одной серии) с интервалом между сериями 200 мс, четыре повтора с интервалом 30 с. После индукции ДВП запись фВПСП производили в течение 1.5 ч. Полученные данные записывали, отфильтровывали и анализировали с помощью программы Spike2 (Cambridge Electronic Design Limited, Великобритания) и SigmaPlot 11.0 (Systat Software Inc., США). Посттетанический тангенс угла наклона фВПСП нормировали на усредненный тангенс угла наклона всех фВПСП, записанных за 20 мин до индукции ДВП. Статистический анализ данных записи ДВП и данных о влиянии Аβ1-42, ws-Lynx1, SP600125 и siРНК на экспрессию генов в первичных нейронах проводили в программе GraphPad Prism 6.0 (GraphPad Software Inc.). Значение р < 0.05 считали статистически значимым. Обращение с животными и экспериментальные процедуры с ними были выполнены в соответствии с директивами совета Европейского сообщества 86/609/ЕЕС об использовании животных для экспериментальных исследований и одобрены Этическими комиссиями МГУ и ИБХ РАН. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Снижение экспрессии Lynx1 в нейронах под действием Аβ1-42 обусловлено активацией JNK Для проверки гипотезы о влиянии амилоидного пептида на экспрессию Lynx1 мы инкубировали первичные нейроны коры и гиппокампа крысы с 1 мкМ олигомерного Аβ1-42 и анализировали уровень мРНК Lynx1 (рис. 1А). В нейронах гиппокампа не было замечено значимого снижения экспрессии нейромодулятора, в то время как наблюдалось значительное снижение уровня мРНК Lynx1 (до 78.4 ± 4.4% от контрольного уровня) в нейронах коры. Это согласуется с отмеченным ранее снижением экспрессии белка Lynx1 в коре головного мозга мышей, моделирующих БА [5]. Напротив, ни в гиппокампальных, ни в кортикальных нейронах не наблюдали снижения уровня мРНК α7 субъединицы nAChR под действием Аβ1-42 (рис. 1Б). Увеличение концентрации Аβ1-42 до 5 мкМ приводило к дальнейшему снижению экспрессии гена Lynx1 в кортикальных нейронах (до 65.8 ± 4.9% от контрольного уровня, рис. 2А). Известно, что активация α7-nAChR никотином регулирует транскрипцию генов посредством фосфорилирования CREB и активации сигнальных путей MAP/ERK, при этом увеличивается количество транскрипционного фактора раннего ответа c-Fos [9]. С другой стороны, связывание олигомерного Аβ1-42 с α7-nAChR приводит к активации N-концевой киназы c-Jun (JNK) [10], которая играет ключевую роль в регуляции генной экспрессии и других жизненно важных процессах, в том числе в процессинге предшественника β-амилоидного пептида и образовании нейрофибриллярных клубков при БА [10]. В свою очередь, активация JNK может приводить к ингибированию фосфорилирования транскрипционного фактора CREB и, как следствие, к снижению уровня экспрессии транскрипционного фактора c-Fos [11]. Чтобы выяснить, связано ли падение уровня экспрессии Lynx1 в нейронах коры, инкубированных с олигомерным Аβ1-42, с активацией JNK, мы инкубировали кортикальные нейроны с Аβ1-42 и SP600125, - селективным ингибитором JNK-1, -2 и -3, который рассматривается в настоящее время как один из возможных препаратов для лечения БА [10]. Действительно, совместная инкубация нейронов с Аβ1-42 и SP600125 отменяла снижение экспрессии Lynx1, что указывает на возможную связь этого снижения с активацией JNK (pис. 2Б). Для подтверждения роли JNK в регуляции транскрипции Lynx1 использовали технологию нокдауна генов JNK-1 и JNK-2 при помощи малых интерферирующих РНК. Действительно, инкубация нейронов с заблокированной экспрессией JNK-1 и JNK-2 в присутствии Аβ1-42 приводила к восстановлению уровня экспрессии мРНК Lynx1 (рис. 2Б). При этом трансфекция культуры нейронов контрольной siРНК, не ингибирующей транскрипцию генов, не влияла на снижение экспрессии мРНК Lynx1, вызванное Аβ1-42 (данные не показаны). Нокдаун JNK-1 и JNK-2 в отсутствие Аβ1-42 не вызывал значимых изменений в уровне экспрессии гена Lynx1 (рис. 2Б), что подтверждает связь амилоидного пептида, активации JNK и снижения транскрипции нейромодулятора. Анализ промотора гена LYNX1 человека в браузере генома человека (chr8: 143841246 - chr8: 143879640) и промотора гена мыши Lynx1 (chr15: 74573409 - chr15: 74603409) выявил два потенциальных сайта связывания транскрипционного комплекса АР-1, образующегося из транскрипционных факторов c-Jun и c-Fos (рис. 2В). Так как в результате активации JNK под действием Aβ1-42 одновременно происходит активация c-Jun [10] и снижение экспрессии c-Fos [11], то дисбаланс, возникающий между c-Jun и c-Fos, возможно, является причиной нарушения формирования транскрипционного комплекса АР-1, и, как следствие, снижения транскрипции гена Lynx1. В согласии с этим предположением при инкубации кортикальных нейронов совместно с препаратом ws-Lynx1 и Аβ1-42 наблюдалось восстановление уровня мРНК Lynx1 (рис. 2Б). По-видимому, ws-Lynx1, конкурируя с Аβ1-42 за связывание с α7 nAChR [6], подобно никотину активирует α7-nAChR, что приводит к повышению уровня с-Fos [9] и восстановлению транскрипции гена Lynx1. Lynx1 предотвращает нарушение ДВП, вызванное Аβ1-42 C использованием SP600125 pанее было показано, что нарушение ДВП, наблюдаемое при инкубации срезов гиппокампа с олигомерным Аβ1-42, рующей транскрипцию генов, не влияла на снижение экспрессии мРНК Lynx1, вызванное Аβ1-42 (данные не показаны). Нокдаун JNK-1 и JNK-2 в отсутствие Аβ1-42 не вызывал значимых изменений в уровне экспрессии гена Lynx1 (рис. 2Б), что подтверждает связь амилоидного пептида, активации JNK и снижения транскрипции нейромодулятора. Анализ промотора гена LYNX1 человека в браузере генома человека (chr8: 143841246 - chr8: 143879640) и промотора гена мыши Lynx1 (chr15: 74573409 - chr15: 74603409) выявил два потенциальных сайта связывания транскрипционного комплекса АР-1, образующегося из транскрипционных факторов c-Jun и c-Fos (рис. 2В). Так как в результате активации JNK под действием Aβ1-42 одновременно происходит активация c-Jun [10] и снижение экспрессии c-Fos [11], то дисбаланс, возникающий между c-Jun и c-Fos, возможно, является причиной нарушения формирования транскрипционного комплекса АР-1, и, как следствие, снижения транскрипции гена Lynx1. В согласии с этим предположением при инкубации кортикальных нейронов совместно с препаратом ws-Lynx1 и Аβ1-42 наблюдалось восстановление уровня мРНК Lynx1 (рис. 2Б). По-видимому, ws-Lynx1, конкурируя с Аβ1-42 за связывание с α7 nAChR [6], подобно никотину активирует α7-nAChR, что приводит к повышению уровня с-Fos [9] и восстановлению транскрипции гена Lynx1. Lynx1 предотвращает нарушение ДВП, вызванное Аβ1-42 C использованием SP600125 pанее было показано, что нарушение ДВП, наблюдаемое при инкубации срезов гиппокампа с олигомерным Аβ1-42, связано с активацией JNK [12]. Для изучения возможности восстановления с помощью Lynx1 синаптической пластичности, нарушенной в результате взаимодействия олигомерного Аβ1-42 с α7-nAChR и активации JNK, мы исследовали влияние 200 нМ Аβ1-42 на ДВП на переживающих срезах гиппокампа мыши в присутствии и в отсутствие 2 мкМ ws-Lynx1. Предварительная перфузия срезов в течение 1 ч в растворе, содержащем Аβ1-42, приводила к значительному падению посттетанического фВПСП, заметному уже на первых минутах после индукции ДВП. Наклон фВПСП, усредненный за первые 10 мин записи, в этом случае падал почти в 1.5 раза по сравнению с контрольным значением наклона фВПСП (рис. 3Б). Значительное снижение наклона фВПСП под действием Аβ1-42, приближающееся к значениям непотенциированных фВПСП, наблюдалось в течение всего времени после индукции ДВП. Однако совместная инкубация срезов гиппокампа в среде, содержащей и Aβ1-42, и ws-Lynx1, восстанавливала уровень ДВП практически до контрольных значений (рис. 3). Усредненное значение наклона фВПСП при совместной аппликации Aβ1-42 и ws-Lynx1 было значительно больше, чем у фВПСП, наблюдаемого при инкубации только с Aβ1-42, и статистически не отличалось от усредненного значения наклона фВПСП в контроле в течение всего времени регистрации после ВЧС (рис. 3Б). Следовательно, ws-Lynx1 отменяет ингибирующее действие Aβ1-42, полностью восстанавливая ДВП. ЗАКЛЮЧЕНИЕ Таким образом, присутствие олигомерного Aβ1-42 в окружении нейронов приводит к значительному снижению экспрессии гена нейромодулятора Lynx1, регулирующего функционирование α7-nAChR в мозге. Мы впервые показываем, что это снижение связано с активацией JNK и может быть предотвращено инкубацией с водорастворимым аналогом Lynx1. Кроме того, ws-Lynx1 способен корректировать нарушения синаптической пластичности в гиппокампе, вызванные Aβ1-42 и лежащие в основе нарушения памяти и других когнитивных функций при БА.

Об авторах

M. Л. Бычков

Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова; Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН

Email: ekaterina-lyukmanova@yandex.ru
Россия

Н. A. Васильева

Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова; Институт высшей нервной деятельности и нейрофизиологии человека РАН

Email: ekaterina-lyukmanova@yandex.ru
Россия

M. A. Шулепко

Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова; Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН

Email: ekaterina-lyukmanova@yandex.ru
Россия

П. M. Балабан

Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова; Институт высшей нервной деятельности и нейрофизиологии человека РАН

Email: ekaterina-lyukmanova@yandex.ru
Россия

M. П. Кирпичников

Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова; Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН

Email: ekaterina-lyukmanova@yandex.ru
Россия

E. Н. Люкманова

Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова; Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН

Автор, ответственный за переписку.
Email: ekaterina-lyukmanova@yandex.ru
Россия

Список литературы

Дополнительные файлы