Лиганды протон-активируемых каналов ASIC1a: механизмы действия и сайты связывания

Полный текст

ЛОКАЛИЗАЦИЯ И ФУНКЦИЯ ASIC В ЦЕНТРАЛЬНОЙ НЕРВНОЙ СИСТЕМЕ Протон-вызванные ионные токи были открыты Крышталем и Пидопличко в 1980 году [1], которые предположили, что понижение pH внеклеточной среды активирует популяцию управляемых про тонами ионных каналов. Клонирование протон-ак тивируемых ионных каналов в середине 90-х годов определило их как новое семейство (ASIC - acidsensing ion channels), принадлежащее суперсемей ству дегенерин эпителиальных натриевых каналов (DEG/ENaC) [2]. Гены, кодирующие ASIC, иденти фицированы у многих видов позвоночных, начиная с круглоротых. На данный момент известны четыре гена accn1-4 млекопитающих, которые кодируют как минимум шесть различных субъединиц: ASIC1a, ASIC1b, ASIC2a, ASIC2b, ASIC3 и ASIC4. Эти субъ единицы могут формировать как гомо-, так и гетеро тримерные комплексы. Протон-вызванные токи можно обнаружить в ней ронах практически всех типов. Уровень экспрес сии разных субъединиц ASIC заметно различается в зависимости от локализации. Так, субъединицы ASIC1a, -2a и -2b преимущественно обнаруживаются в головном мозге [3-5], в то время как субъединицы ASIC1b и ASIC3 чаще можно встретить в сенсорных нейронах спинного мозга и спинальных ганглиях [6, 7]. На поверхности NG2-содержащих глиальных клеток гиппокампа обнаружена высокая плотность Са2+-проницаемых ASIC1a, сходных по своим функ циональным и фармакологическим свойствам с ASIC нейронов гиппокампа [8]. При этом в гиппокампе ASIC находятся главным образом в интернейронах, а в пирамидных клетках поля СА1 протон-вызван ные токи крайне малы [9]. В центральной нервной системе ASIC, предположительно, вовлечены в ме ханизмы синаптической передачи и синаптической пластичности, а также в такие системные функции, как память и обучение [10], страх и депрессия [3]. Их роль можно обнаружить при изучении механизмов наркотической зависимости [11] и патогенеза ряда психических заболеваний [12]. Вкусовые, слуховые и фоточувствительные рецеп торные клетки [13-15], клетки гладкой мускулатуры, выстилающие стенки сосудов [16], экспрессируют на своей поверхности ASIC, хотя и в гораздо меньшей степени. На периферии ASIC отвечают за восприя тие болевых стимулов, сопровождающих воспаление, переломы, опухоли, гематомы и послеоперационные раны, а также участвуют в механорецепции [17]. Процессы опухолевого роста также способствуют экспрессии ASIC [18]. Стоит отметить, что большинство сведений о фи зиологической роли протон-активируемых ионных каналов являются косвенными, поскольку основаны на экспериментальных данных, полученных на «но каутных» животных. Устранение отдельных субъе диниц ASIC позволило проследить их роль в возник новении определенных поведенческих фенотипов, а также вовлеченность ASIC в развитие разнообраз ных патологических процессов в нервной системе [19]. Лишь недавно появились прямые свидетель ства участия ASIC в синаптической передаче. Содержимое синаптических везикул имеет pH ~5.2- 5.7 [20]. Соответственно в момент освобождения со держимого везикул pH среды в синаптической щели может снижаться на короткий промежуток времени на 0.2-0.6 единиц и приводить к активации как пре- [21-23], так и постсинаптических ASIC. Однако вклад ASIC-опосредуемых постсинаптических токов ока зывается в 15-20 раз меньше вклада постсинаптиче ских токов, опосредованных глутаматом [11, 24, 25]. Среди экспрессируемых в ЦНС протон-активиру емых каналов наибольшей чувствительностью к за кислению среды обладают ASIC1a [26]. Кроме того, специфический ингибитор гомомеров ASIC1a PcTx1 убирает большую часть протон-вызванных токов в культурах гиппокампа и коры головного мозга [27, 28]. Таким образом, большинство протон-вызванных токов в мозге, вероятно, опосредуется гомомерами ASIC1a или ASIC1a-содержащими гетеромерами. Эти факты и объясняют повышенный интерес к свой ствам ASIC1a и их лигандам. Основная проблема, стоящая на сегодняшний день перед нейрофизиологами, изучающими ASIC, состоит в разрешении противоречия между оче видной ролью этих каналов в физиологических и патологических процессах и малыми значениями ASIC-опосредованных токов, наблюдаемых при си наптической передаче в эксперименте. Между тем, токи, вызываемые искусственным закислением вне клеточной среды в нейронах ЦНС in vitro, не уступа ют по амплитуде токам, вызываемым аппликацией глутамата, который является основным возбужда ющим медиатором. Вторая проблема состоит в том, что ASIC, экспрессируемые в ЦНС, быстро десенси тизируют даже при небольшом закислении, т.е. теря ют способность проводить ток. Так, при закислении всего до рН 7.0 равновесная десенситизация ASIC1a достигает 80% и фактически выключает функцию этих каналов [26]. Возможным решением этих проблем могло бы являться наличие эндогенных соединений, модули рующих работу ASIC в физиологических условиях. Классическим примером такой модуляции являет ся ионотропный рецептор глутамата NMDA-типа. Эффективная активация этих каналов возможна только в присутствии ко-агониста - глицина [29]. Именно поэтому поиск и изучение новых лигандов ASIC, в частности, способных существенно по тенцировать ASIC, представляют большой интерес не только с точки зрения традиционных задач фар макологии, но и с точки зрения нейрофизиологии. ЛИГАНДЫ ASIC1a Исследования связи между структурами и моле кулярными механизмами действия модуляторов ASIC1а важны как для выяснения их физиологи ческой роли, так и для появления нового класса лекарственных веществ. Cреди модуляторов ASIC1a встречаются синтетические соединения, эндогенные органические вещества и катионы, а также ряд пеп тидных токсинов из компонентов природных ядов. Структуры некоторых низкомолекулярных лигандов приведены на рис. 1. Амилорид K+-сберегающее диуретическое средство, назна чаемое при гипертонической болезни и сердечной недостаточности, было первым обнаруженным бло катором протон-активируемых ионных каналов [30, 31]. Амилорид действует как неселективный блокатор ASIC с низким сродством к сайту связывания (IC50 = 5-100 мкM), способный к тому же бло кировать другие ионные каналы и ионообменники [32]. Интересно, что при более высоких концентрациях амилорида его ингибирующее действие сме няется потенцирующим или даже активирующим. Аппликация амилорида (EC50 = 560 мкM) совместно с нейтральным физиологическим раствором (pH 7.4) активирует гомомерные ASIC3- и гетеромерные ASIC3/ASIC1b-каналы, а также синергически уси ливает токи через эти каналы в ответ на умеренное закисление внеклеточной среды [33]. Таким образом, очевидно, что существует двойное разнонаправлен ное действие амилорида на протон-активируемые ионные каналы. 2-Гуанидин-4-метилхиназолин (GMQ) Открытие необычного действия амилорида на про тон-активируемые ионные каналы вдохновило ис следователей на синтез похожих по структуре со единений, содержащих гуанидиновую группу и гетероциклическое кольцо [34, 35]. Среди всех этих соединений специфичностью своего активирующего действия выделяется 2-гуанидин-4-метилхиназолин (GMQ). GMQ был первым синтетическим активато ром ASIC3, отличным от протонов, что позволило предположить существование других синтетиче ских/эндогенных активаторов ASIC. В высоких кон центрациях (EC50 = 1 мM) GMQ способен вызывать стационарный недесенситизирующий ток через ASIC3-каналы, который во много раз превосходит по амплитуде недесенситизирующий ток, возника ющий под действием насыщающей концентрации естественного агониста - протонов. При этом дей ствие GMQ зависит от внеклеточной концентрации Ca2+ и увеличивается со снижением содержания этого иона в среде [36, 37]. Помимо активирующего действия на ASIC3, GMQ специфически взаимо действует и с ASIC1a. Воздействие состоит в том, что рН-зависимости активации и равновесной десен ситизации сдвигаются в сторону более кислых значе ний на величину порядка 0.2 единицы. Оба эффекта имеют конкурентно-подобный характер, т.е. и рав новесная десенситизация, и активация развиваются полностью, хотя и при более низких значениях рН [38]. 4-Аминопиридин Еще одной небольшой молекулой, способной блоки ровать гомомерные ASIC1a-каналы (IC50 ~ 760 мкM) и гетеромеры, содержащие субъединицы ASIC1a, ASIC1b и ASIC2a, является известный блокатор ка лиевых каналов 4-аминопиридин. Место связывания 4-аминопиридина в ASIC и других дегенерин эпи телиальных каналах, как и в случае с калиевыми каналами, находится в области поры, поскольку его действие отличается выраженной потенциалзависи мостью [39]. Ионы металлов ASIC ингибируются различными ионами металлов [40-42]. Показано, что сродство H+ к каналу напря мую зависит от концентрации кальция в среде [43, 44] - чем меньше Ca2+, тем больше сродство протонов и соответственно больше ответы. Спермин Эндогенный полиамин, усиливающий протон-вы званные токи через каналы ASIC1a и ASIC1a/2a [45]. Механизм потенциации ASIC1a-каналов со стоит из нескольких компонентов и включает в себя замедление инактивации, т.е. активированный ка нал остается открытым более продолжительное время; снижение сродства протонов к рецептору и, следовательно, увеличения их ответов в услови ях пониженного фонового pH; сокращение времени восстановления канала в условиях повторяющей ся стимуляции. Все эти изменения приводят к уве личению входа Ca2+ внутрь нейрона через ASIC1a в условиях ишемического воздействия и, как след ствие, к гибели клетки. Показано, что как блокада эндогенного синтеза спермина, так и выключение ASIC1a-каналов, значительно увеличивали процент выживших нейронов в in vivo и in vitro моделях ишемии на мышах [45]. FMRF-амиды FMRF-амиды (Phe-Met-Arg-Phe-NH2), преобладаю щие в нервной системе беспозвоночных, и родствен ные им пептиды, обнаруженные в нервной системе млекопитающих, являются активаторами некоторых представителей семейства дегенерин эпителиальных Na+-каналов [46]. Они не способны сами активировать ASICs, однако могут значительно потенцировать от веты ASIC1a- и ASIC3-каналов на закисление сре ды [47, 48]. Эти пептиды действуют непосредственно на канал и замедляют десенситизацию рецептора, увеличивая время пребывания канала в открытом состоянии [49, 50]. Существенное влияние эти пептиды оказывают и на равновесную десенситизацию, смещая ее в сторону более сильных закислений [48]. Эндогенные опиатные нейропептиды - динорфин А и большой динорфин, также смещают равновесную инактивацию, усиливая ответы ASIC1a при слабом закислении [51]. Псалмотоксин-1 (PcTx1) Полипептидный токсин, выделенный из яда южно американского тарантула Psalmopoeus cambridgei, является первым описанным специфическим инги битором ASIC1a-каналов (IC50 ~ 1 нM) [52]. PcTx1 со стоит из 40 аминокислот, он образован тремя антипараллельными β-листами, скрученными в три петли,в центре которых лежит компактное ядро из трех дисульфидных мостиков [53]. Псалмотоксин-1 ин гибирует ASIC1a-каналы, увеличивая чувствитель ность рецептора к протонам, но при этом сдвигая кривую инактивации рецептора к менее кислым значениям pH [54]. Поскольку ASIC1a активируются в ответ на незначительное повышение концентрации протонов, даже небольшое увеличение сродства H+ к протонсвязывающим сайтам оказывается доста точным для перевода большинства рецепторов в де сенситизированное состояние. В результате в при сутствии PcTx1 при pH 7.4 основное количество ASIC1a становится неактивным вследствие десен ситизации. Токсин наилучшим образом связывается с десенситизированным каналом и стабилизирует его в этом состоянии [55]. MitTx Был выделен в 2011 году из яда техасского аспи да Micrurus tener tener [56]. Токсин, напоминающий по своей структуре β-бунгаротоксин, состоит из двух нековалентно связанных субъединиц. MitTx не инги бирует ASICs, но активирует как гомо-, так и гетеро тримерные каналы [56, 57]. Наиболее чувствительны к его действию гомомеры ASIC1a и ASIC1b (EC50 ~ 9 и 23 нM соответственно), ASIC3 гораздо менее чув ствительны (EC50 ~ 830 нМ). При совместной аппли кации с нейтральным раствором MitTx практически не оказывает действия на ASIC2a-каналы, однако сильно потенцирует протон-вызванные токи через эти каналы за счет сдвига кривой активации в сторо ну менее кислых значений. Мамбалгины Это группа из трех токсинов длиной 57 аминокис лот. Два из них, мамбалгины-1 и -2, отличающиеся только одной аминокислотой в положении 4, выде лены в 2012 году из яда африканской черной мамбы Dendroaspis polylepis polylepis [58]. Мамбалгин-3 был выделен из яда зеленой мамбы D. angusticeps и назван так, поскольку от двух предыдущих его отличает только один аминокислотный остаток в положении 23 [59]. Все три белка по структуре относятся к семейству трехпальцевых токсинов, имеют сходные фармакологические характеристи ки и ингибируют ASIC1a [59]. Мамбалгин-1 ингиби рует ASIC1a по следующему механизму: он пред почтительнее связывается с закрытым каналом и сильно сдвигает кривую pH-зависимости актива ции в сторону более кислых значений pH. В то же время токсин умеренно сдвигает кривую инактива ции в щелочную сторону, стабилизируя тем самым десенситизированное состояние канала и усиливая ингибирование [58]. Гидрофобные моноамины Недавно в лаборатории биофизики синаптических процессов ИЭФБ РАН было обнаружено, что со единения с простой химической структурой, содер жащие гидрофобное/ароматическое ядро и ами ногруппу (гидрофобные моноамины), являются модуляторами нативных и рекомбинантных ASIC [60, 61]. Из четырех соединений, протестированных на первом этапе, только ИЭМ-1921 не проявил ак тивности в отношении гомомерных ASIC1a-каналов даже в концентрации 1000 мкМ. Три других - 9АА, ИЭМ-2117 и мемантин вызывали концентрационно зависимый ингибирующий эффект разной степени выраженности [60]. Наиболее активным ингибито ром оказался 9-аминоакридин. В концентрации 1000 мкМ это соединение вызывало 67 ± 8% (n = 6) инги бирования при совместной аппликации с активиру ющим раствором с рН 6. Действие 9-аминоакридина оказалось рН-зависимым: 300 мкМ ингибировали ответ, вызванный слабым (рН 6.8) закислением, на 80%, а при активации сильным закислением (pH 5.0) ингибирующий эффект сокращался до 12%. Таким образом, ингибирующее действие 9-аминоакридина обусловлено смещением кривой активации ASIC1a. Особенностью действия мемантина было резкое ускорение десенситизации ответа. Подобный эффект мемантин оказывал и на ASIC1b [61]. Более подроб ное исследование механизма действия мемантина по зволило установить, что в этом случае ингибирующее действие обусловлено блокадой открытого канала. Данный вывод основан на том, что эффект мемантина оказался потенциалзависимым, но не зависел от кон кретной величины активирующего рН [62]. Проведенный в дальнейшем структурно-функ циональный анализ [63] позволил обнаружить и по тенциаторы ASIC1a. Оказалось, что встраивание метиленовой группы между фенилциклогексиловым кольцом и аминогруппой ИЭМ-1921 приводило к по явлению слабой потенцирующей активности у этого соединения, а введение второй группы усиливало по тенциацию (соединение ИЭМ-2044). Обнаружение потенцирующей активности у ИЭМ- 2044 позволило расширить поиск новых потенциально активных препаратов. Химическая структура этого соединения имеет сходство со структурой гистами на, ряда лигандов рецепторов гистамина и иных эн догенных аминов, например тирамина и триптамина. Гистамин [64] и его производные, альфа-метилги стамин и 1-метилгистамин [65] оказались сильны ми и избирательными потенциаторами ASIC1a. Потенцирование осуществляется за счет смещения кривой активации, так как ответ на глубокое закис ление не увеличивается. Среди лигандов рецепторов гистамина подобным действием обладали тиоперамид и димаприт. А вот соединение A943931 вызывало ин гибирование, зависевшее от величины потенциала, но не от величины активирующего рН, что говорит о каналоблокирующем механизме действия [65]. Первоначальное исследование [64] не выяви ло влияния гистамина на десенситизацию ASIC1a. Однако более подробный анализ показал, что при ис ходных значениях рН (рН 7.1, т.е. в условиях частич ной десенситизации) эффект гистамина усиливается (рис. 2). Подобный эффект оказывали также тира мин и триптамин, которые не вызывали смещения кривой активации [66]. Даже мемантин - ингибитор открытых ASIC1a-каналов, проявлял потенцирую щую активность при аппликации между активация ми канала при подкислении рН до 7.1, т.е. в условиях взаимодействия только с закрытыми и десенситизи рованными каналами [65]. Таким образом, различные моноамины вызывают сдвиг кривой равновесной де сенситизации ASIC1a в стороны более сильных за кислений. Обобщение данных по механизмам модуляции ASIC1a Соотнести разнообразные данные и гипотезы о дей ствии конкретных лигандов достаточно сложно. Однако накопление большого числа эксперименталь ных данных позволяет выявить некоторые законо мерности. По совокупности признаков ряд соединений мож но отнести к блокаторам поры ASIC1a. К лигандам этого типа относятся амилорид, мемантин, 4-амино пиридин. Связывание этих соединений в поре приво дит к ингибированию транспорта ионов независимо от степени активации и десенситизации рецепто ра. Блокаторы пор катионных каналов являются, как правило, катионами, и в этом случае их действие зависит от потенциала на мембране. Второй распространенный тип действия лиган дов - смещение кривой активации, которое приво дит к ингибированию или потенцированию токов (рис. 2Б). Пептидный токсин мамбалгин и низкомо лекулярные соединения GMQ и 9АА сдвигают кри вую в сторону более сильных закислений, а гистамин, наоборот, позволяет каналу активироваться при бо лее высоких значениях рН. Особенностью этого ме ханизма является выраженность действия лигандов при низких уровнях закисления, когда активация ASIC1а невелика. Смещение кривой активации мо жет реализовываться за счет аллостерического вли яния на сродство рецептора к протонам или за счет прямого взаимодействия с протонсвязывающим сай том. В последнем случае лиганды этого типа высту пают как агонисты или как конкурентные антагони сты в зависимости от направленности действия. Третий тип действия - изменение равновесной десенситизации ASIC1a (рис. 2Б). В качестве наибо лее известного примера соединения, усиливающе го десенситизацию можно привести псалмотоксин. Спермин и моноамины ослабляют десенситизацию, позволяя ASIC1a функционировать в условиях дли тельного закисления среды. Ряд лигандов, например GMQ и гистамин, одновременно влияет на активацию и десенситизацию. При этом не наблюдается корре ляции между этими эффектами. Так, GMQ смещает обе кривые в сторону более глубокого закисления, а гистамин смещает кривую активации в сторону меньших закислений (рис. 2А). Псалмотоксин, хоро шо известный как промотор десенситизации, может приводить к активации канала при щелочных значе ниях рН. Вопрос о сайтах связывания еще более сложен. Традиционным методом выявления сайта связыва ния лиганда считается направленный мутагенез ре цептора. Однако этот подход не позволяет получить однозначно интерпретируемые результаты. Мутации могут влиять непосредственно на сайт связывания лиганда, если мутируемые аминокислоты входят в его состав, или аллостерически, меняя сродство рецептора к лиганду путем изменения его конфор мации. Кроме того, мутации могут существенно вли ять на работу самого канала, его активацию и десен ситизацию, что также затрудняет интерпретацию данных. В некоторых случаях мутации приводят к полной потере функциональности канала, и тогда не представляется возможным выяснить эффект мутации на связывание лиганда. Таким образом, не смотря на высокую ценность данных, полученных с помощью направленных мутаций, к их структурной интерпретации надо подходить с большой осторож ностью. Эту проблему можно решать только с учетом данных о строении ASIC и о молекулярных механиз мах их активации и десенситизации. СТРОЕНИЕ ASIC В 2007 году впервые был проведен рентгенострук турный анализ канала ASIC1a курицы [67], что по зволило установить основные элементы его строения (рис. 3). Позже с более низким разрешением (3 Å) по лучили кристаллическую структуру функционирую щего мутанта, у которого отсутствовала C-концевая область, но сохранилась N-концевая область и входя щий в нее участок, необходимый для открытия кана ла [68]. Оба белка были кристаллизованы при низких значениях pH. В таких условиях канал ASIC1a на ходится в десенситизированном состоянии. Позднее были получены структуры ASIC1a в открытом и за крытом состояниях [69], что позволило установить механизмы активации и десенситизации. ASIC представляют собой тримеры, субъеди ницы которых симметрично расположены вокруг центральной поры канала. Экстраклеточный домен (ЭКД) каждой субъединицы напоминает сжатую че ловеческую руку, которая крепится к мембранным сегментам посредством подвижного «запястья» [67]. Видимо, учитывая такое сходство, авторы статьи о первой кристаллической структуре описали ЭКД в терминах человеческой кисти, держащей мяч. Впоследствии эта терминология стала общепри нятой, поскольку оказалась довольно удобной. ЭКД можно разделить на пять субдоменов: «ладонь» - palm-домен, «палец» - finger-домен, «большой па лец» - thumb-домен, «сустав» - knuckle и домен под названием «бета-болл» (β-ball) (рис. 3). Важная особенность структуры ЭКД - нали чие так называемого «кислотного кармана» (acidic pocket) - скопление кислых аминокислот в одном небольшом участке. Он располагается на расстоя нии 45 Å от трансмембранного участка и образован взаимодействиями между thumb-, β-ball- и finger-доменами одной субъединицы и частью palm домена соседней субъединицы. Внутри этого кар мана три пары кислых аминокислотных остатков (Асп238-Асп350, Глу239-Асп346 и Глу220-Асп408) находятся на близком расстоянии. Электростатическое оттал кивание между отрицательными зарядами боковых цепей этих пар аминокислотных остатков удержи вает кислотный карман в развернутом состоянии, канал при этом закрыт. При закислении внешней среды происходит связывание протонов между па рами карбоксилов, что приводит к стягиванию кар мана в более компактную структуру. Это вызывает конформационные изменения в thumb-домене, что, в свою очередь, приводит к изменениям в «запястье» и далее в трансмембранном домене. Таким образом, кислотный карман является местом связывания про тонов, необходимых для активации канала [69]. Однако, помимо «карманных» аминокислот, в ниж ней части palm-домена есть еще несколько аспара гиновых, глутаминовых и гистидиновых остатков, pKa которых находится также в пределах pH, акти вирующих ASIC1-каналы [70]. Кроме того, полное удаление всех трех пар «карманных» аминокислот резко снижает чувствительность рецептора к прото нам, но не устраняет его способность активироваться в ответ на сильное закисление внеклеточной среды [71]. В связи с этим считается, что в пределах одной субъединицы существует несколько участков, от ветственных за связывание протонов и дальнейшую активацию канала. Трансмембранный домен ASIC образован шестью α-спиралями - по две (ТМ1 и ТМ2) от каждой из трех субъединиц, входящих в состав функционального ASIC. Трансмембранные сегменты каждой субъеди ницы участвуют в формировании поры канала. ТМ2 непосредственно выстилает просвет ионной поры, в то время как ТМ1 выполняет опорную роль, кон тактируя с липидным бислоем и образуя множество связей с ТМ2 той же молекулы и сегментами ТМ2 и ТМ1 соседней субъединицы. Только небольшая часть С-концевого участка ТМ1-сегмента непосред ственно выстилает пору канала [72]. САЙТЫ СВЯЗЫВАНИЯ МОДУЛЯТОРОВ ASIC Наиболее точные данные о местах связывания ли гандов получены с помощью рентгеноструктурного анализа и криоэлектронной микроскопии. В настоя щее время имеется несколько структур ASIC высо кого разрешения в комплексе с такими лигандами, как псалмотоксин, MitTx и амилорид [73, 74]. С помощью активирующего токсина MitTx была получена структура ASIC1a в открытом состоянии. Каждый гетеродимер токсина связывается с субъе диницей канала, т.е. всего связываются три молеку лы токсина, формирующие множественные контакты по всей длине thumb-домена от поверхности мембра ны до knuckle-домена (рис. 4А). Хотя молекула ток сина обнаруживается вблизи «кислотного кармана», непосредственно в него MitTx не проникает. Таким образом, токсин механически стабилизирует открытое состояние канала, не влияя напрямую на про тонсвязывающий центр. Помимо пептидного токсина в той же структуре разрешен комплекс ASIC1a с амилоридом. Три мо лекулы амилорида расположены в верхней части ка нала, в интерфейсах между субъединицами (рис. 4В). Их заряженные группы выставлены в пору. С другой стороны, данные мутагенеза свидетельствуют о бо лее глубоком залегании места связывания амилори да в поре [75]. Авторы предполагают, что место свя зывания, обнаруженное в рентгеновской структуре, отражает промежуточное положение амилорида, и одна молекула может проходить глубже, стериче ски блокируя канал. Второе место связывания ами лорида расположено в кислотном кармане (рис. 4Г). Две молекулы образуют димер, стабилизируемый посредством стекинг-взаимодействия ароматических группировок и противоположно ориентированных гуанидиновых групп. В настоящий момент не извест но, какую функциональную нагрузку несет это место связывания, но представляется вероятным, что оно имеет отношение к способности амилорида активи ровать ASIC [33]. Сайт связывания псалмотоксина, выявленный Baconguis и соавт. [73], в значительной степени пе рекрывается с регионом связывания MitTx. Однако средняя петля молекулы псалмотоксина заходит в кислотный карман, где положительно заряженные остатки токсина напрямую взаимодействуют с кис лотными остатками рецептора (рис. 4Б), т.е. меха низмы стабилизации открытого состояния токсином MitTx и десенситизированного состояния псалмоток сином принципиально различны: псалмотоксин воз действует на рецептор протонов, а MitTx - на испол нительный механизм активации. Вероятные места связывания других лигандов ASIC можно установить по косвенным свидетель ствам, анализируя совокупность механизмов их дей ствия, влияние точечных мутаций и данные о кон куренции с лигандами, места связывания которых известны. Например, сведения о совпадении регионов связывания MitTx и псалмотоксина хорошо согла суются с данными о взаимоисключающем действии этих токсинов [56]. Согласно последним данным [76], мамбалгины также связываются вблизи кислотного кармана, как и псалмотоксин. К псалмотоксину можно «привязать» еще не сколько типов лигандов. Так, согласно [45], анализ совместного действия спермина и псалмотоксина по зволяет предполагать, что эти два соединения мо гут конкурировать за общий сайт связывания, хотя модулируют функцию ASIC1a в противоположных направлениях. Псалмотоксин и кальций также на ходятся в конкурентных отношениях [54], при этом известно, что кальций конкурирует с протонами [43, 77]. Конкуренция с псалмотоксином показана также для динорфина [51]. Исходя из изложенного мож но предположить, что лиганды, влияющие на рН зависимость активации и равновесной десенсити зации ASIC1a, связываются в области кислотного кармана рецептора и непосредственно влияют на его функциональные компоненты. Поскольку кислотный карман содержит несколько отрицательно заряжен ных аминокислотных остатков, различия в характе ре взаимодействия разных лигандов с этой областью могут определять конкретную моду действия каж дого лиганда. Однако ряд данных не вполне согласуется с этой концепцией. Во-первых, как отмечено выше, кис лотный карман не является единственной областью связывания протонов, необходимых для активации канала [70, 71]. Замены аминокислотных остатков в palm-домене влияют на десенситизацию и действие ряда лигандов. В недавней работе [78] было система тически изучено взаимное влияние эффектов GMQ, амилорида, псалмотоксина и мамбалгина. Оказалось, что влияние GMQ и мамбалгина на кривую актива ции ASIC1a полностью аддитивно, что предполага ет независимость механизмов действия. Напротив, влияние GMQ и псалмотоксина на равновесную инактивацию взаимосвязано, поскольку между ними существует отрицательная кооперативность. Таким образом, вопрос о точных местах связывания ли гандов, влияющих на активацию и десенситизацию ASIC1a, остается открытым и требует дальнейшего изучения. ЗАКЛЮЧЕНИЕ Данные о влиянии разнообразных лигандов на ASIC1a выявляют три основные моды действия: блокада поры канала, смещение рН-зависимости активации и смещение рН-зависимости десенситизации канала. Многие лиганды одновременно влияют на две последние характеристики. Вероятно, влияния такого типа определяются связыванием лиган дов с внеклеточным сайтом, управляющим активационными и инактивационными характеристиками ASIC1a. Хотя величины сдвигов этих кривых обычно не превосходят 0.2-0.5 единицы рН, они оказывают сильное влияние на функционирование канала по скольку активация ASIC1a происходит в диапазоне между рН 7.0 и 5.0, а равновесная десенситизация развивается между рН 7.5 и 7.0. Такие характеристики существенно ограничивают возможности активации ASIC1a в физиологических условиях. В частности, даже небольшое общее закисление вы зывает десенситизацию и потерю функциональности канала. С этой точки зрения перспективным пред ставляется поиск эндогенных лигандов, смещающих десенситизацию в сторону более кислых значений рН, а активацию - наоборот, в сторону меньших закислений. В присутствии таких лигандов ASIC1a могли бы активироваться небольшими закислениями внешней среды, имеющими место при синаптической передаче. В этом случае умеренное закисление среды не приводило бы к десенситизации, а, наоборот, усиливало ответ и, таким образом, вклад ASIC1a в возбудимость нейрона. Если принять во внимание, что усиление активации ASIC1а способно оказывать благоприятное влияние на течение ряда патологиче ских процессов, то обнаружение лигандов, потенци рующих ASIC1а, обретает клинический смысл.

Об авторах

Д. Б. Тихонов

Институт эволюционной физиологии и биохимии им. И.М. Сеченова РАН

Автор, ответственный за переписку.
Email: denistikhonov2002@yahoo.com
Россия

Л. Г. Магазаник

Институт эволюционной физиологии и биохимии им. И.М. Сеченова РАН

Email: denistikhonov2002@yahoo.com
Россия

E. И. Нагаева

Институт эволюционной физиологии и биохимии им. И.М. Сеченова РАН

Email: denistikhonov2002@yahoo.com
Россия

Список литературы

Дополнительные файлы