Взаимодействие трансаминазы D-аминокислот из Haliscomenobacter hydrossis с 3-аминооксипропионовой кислотой: спектральный и структурный анализ

Обложка

Цитировать

Полный текст

Аннотация

Пиридоксаль-5’-фосфат-зависимые ферменты занимают ключевое место в азотистом обмене. Среди многочисленных и специфических ингибиторов этих ферментов, включая и практически значимые, важное место отводится карбонильным соединениям, в том числе и О-замещенным гидроксиламинам, которые реагируют в активном центре ферментов с пиридоксаль-5’-фосфатом с образованием стабильных оксимов. Использование эфиров гидроксиламина, имитирующих строение боковых групп субстратов аминокислот, позволяет получать высокоэффективные и специфические ингибиторы соответствующих ферментов. В настоящей работе этот подход применили к изучению свойств трансаминазы D-аминокислот из бактерии Haliscomenobacter hydrossis. Структурный и спектральный анализ комплекса этой трансаминазы с 3-аминооксипропионовой кислотой позволил уточнить особенности организации и функционирования ее активного центра и один из механизмов ингибирования специфическим субстратом D-глутаминовой кислотой.

Полный текст

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

NADH – восстановленная форма никотинамидадениндинуклеотида; ПЛФ – пиридоксаль-5’-фосфат; ТА – трансаминаза; TA_Halhy – трансаминаза D-аминокислот из Haliscomenobacter hydrossis.

ВВЕДЕНИЕ

Пиридоксаль-5’-фосфат (ПЛФ)-зависимые трансаминазы (аминотрансферазы, ТА, КФ [2.6.1.Х]) катализируют перенос аминогруппы с аминокислоты или амина на кетокислоту или кетон с образованием новой аминокислоты/амина и кетокислоты/кетона [1, 2]. Ферментативное трансаминирование – это реакция последовательного двойного замещения с промежуточным переносом аминогруппы на кофактор ПЛФ, в результате которой образуется пиридоксамин-5’-фосфат, служащий донором аминогруппы во второй полуреакции. Два субстрата (амино- и кетокислота) последовательно связываются в одной области активного центра, все стадии реакции обратимы [1, 3]. Трансаминазы как стереоселективные катализаторы переноса аминогруппы успешно применяются для асимметрического аминирования соединений с кетогруппой и разделения хиральных первичных аминов [4, 5]. Из семи типов укладки полипептидной цепи ПЛФ-зависимых ферментов для ТА характерны только два – I и IV. Подробно изучены механизм действия и структура фермента (S)-селективного трансаминирования – функционального димера ТА I типа укладки. Трансаминазы IV типа укладки охарактеризованы в меньшей степени. Интересно, что среди них обнаружены как (S)-селективные (это трансаминазы разветвленных L-аминокислот), так и (R)-селективные ферменты (трансаминазы D-аминокислот и (R)-амин:пируваттрансаминазы). Именно (R)-селективность определила интерес к изучению ТА IV типа укладки в последнее десятилетие.

Карбонильные реагенты, включая производные гидроксиламина, представляют собой типовые ингибиторы ПЛФ-зависимых ферментов. Один из алгоритмов создания высокоэффективных и избирательно действующих ингибиторов на основе эфиров гидроксиламина (R-ONH2) заключается в использовании производных, имитирующих строение боковых групп субстратов аминокислот. При этом функциональные группы в радикале О-замещенного гидроксиламина обеспечивают субстратоподобное связывание ингибитора в активном центре фермента, а реакционноспособная аминооксигруппа образует оксим с ПЛФ. Этот подход позволяет получать ингибиторы с константой связывания наномолярной величины не только для ТА, например, аспартатаминотрансферазы [6, 7], но и для декарбоксилаз, например, глутаминовой кислоты [8], орнитина [9] и аргинина [10]. Следует отметить, что использование гидроксиламинсодержащих аналогов путресцина и агматина позволяет избирательно ингибировать близкородственные декарбоксилазы орнитина и аргинина [10]. Структурное подобие внешнего альдимина, одного из промежуточных соединений в ПЛФ-катализируемых превращениях аминокислот, и оксима ПЛФ, образованного субстрато/продуктоподобными гидроксиламинами, впервые подтверждено рентгеноструктурным анализом фермент-ингибиторных комплексов аспартатаминотрансферазы [6, 7]. Позднее аналогичные исследования были выполнены для трансаминазы гамма-аминомасляной кислоты [11], орнитиндекарбоксилазы [12] и трансаминазы D-аминокислот [13]. Структуры комплексов ПЛФ-зависимых ферментов с такими производными гидроксиламина позволяют анализировать строение, особенности связывания субстрата и функционирования активного центра ферментов. В настоящей работе этот подход использовали в исследовании трансаминазы D-аминокислот из Haliscomenobacter hydrossis (ТА_Halhy). ТА_Halhy относится к ТА IV типа укладки, она эффективно катализирует реакции трансаминирования между D-аминокислотами и α-кетокислотами, удельная активность в реакции между D-глутаматом и пируватом в 50-мМ К-фосфатном буфере рН 8.0, достигает рекордно высоких для ТА значений – 380 ± 10 мкмоль/мин на 1 мг белка при 40°C [14, 15]. Определена структура этого фермента, функциональной единицей которого является димер (рис. 1А). Как и у изученных ТА IV типа укладки, активный центр ТА_Halhy можно поделить на две части (О- и P-карманы), аминокислотные остатки этих карманов участвуют в связывании субстратов и тем самым определяют стереоспецифичность каталитического превращения (рис. 1Б). TA_Halhy выделяется среди известных ТА IV типа укладки четырьмя положительно заряженными функциональными группами в активном центре (боковыми группами аминокислотных остатков Arg28*, Arg90, Arg179 и Lys241) [14, 16] (рис. 1Б).

 

Рис. 1. Пространственная структура ТА_Halhy. А – гомодимер ТА_Halhy; Б – активный центр ТА_Halhy. Аминокислотные остатки, образующие O-карман, окрашены оранжевым, аминокислотные остатки, образующие P-карман, окрашены зеленым. Молекула ПЛФ показана фиолетовым. * – остаток соседней субъединицы функционального димера

 

Результаты анализа структуры комплекса ТА_Halhy с ингибитором D-циклосерином позволили предположить участие боковых групп остатков Arg28* и Arg179 в связывании субстрата [17]. Поскольку структуру комплекса TA_Halhy с субстратами получить не удалось (из-за высокой эффективности превращения аминокислот в катализируемых TA_Halhy реакциях, кристаллизация с субстратами приводит к получению апофермента), исследование строения активного центра TA_Halhy было продолжено путем анализа взаимодействия фермента с 3-аминооксипропионовой кислотой (аналог субстрата D-глутаминовой кислоты) методами UV/Vis-спектрофотометрии и рентгеноструктурного анализа. 3-Аминооксипропионовая кислота взаимодействует в активном центре TА_Halhy с ПЛФ с образованием оксима, который имитирует внешний альдимин между ПЛФ и D-глутаминовой кислотой (рис. 2), поэтому успешная кристаллизация и решение структуры комплекса позволяют определить функциональные группы, задействованные в связывании этого специфического субстрата.

 

Рис. 2. Взаимодействие внутреннего альдимина TА_Halhy (холофермент) с 3-аминооксипропионовой кислотой (образуется оксим) и D-глутаминовой кислотой (образуется внешний альдимин)

 

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Получение рекомбинантной ТА_Halhy

Очищенный активный рекомбинантный препарат ТА_Halhy получали как описано ранее [14]. Чистоту и гомогенность препарата контролировали методом электрофореза в денатурирующем полиакриламидном геле (ДДС-ПААГ). Концентрацию TA_Halhy определяли спектрофотометрически по поглощению при 280 нм.

Спектральный анализ

ПЛФ-форму ТА_Halhy (холофермент) получали путем инкубации фермента (2.5 мг/мл, или 74 мкМ) в 50-мМ К-фосфатном буфере (рН 8.0) с избытком ПЛФ (700 мкМ) в присутствии 10 мМ α-кетоглутарата в течение 30 мин. Холофермент очищали от низкомолекулярных компонентов переводом в 50-мМ K-фосфатный буфер pH 8.0, используя колонку HiTrap Desalting (Cytiva, США), уравновешенную в том же буфере.

К холоферменту (0.85 мг/мл, или 25 мкМ) в 50-мМ K-фосфатном буфере, pH 8.0, добавляли 3-аминооксипропионовую кислоту (10 мМ) и выдерживали смесь в течение 60 мин. Белковую фракцию отделяли от низкомолекулярных компонентов, используя колонку HiTrap Desalting. Дополнительно фракцию низкомолекулярных компонентов получали ультрафильтрацией с использованием центрифужного концентратора (30 кДа MWCO, Millipore, США). Спектры поглощения регистрировали в 50-мМ K-фосфатном буфере, pH 8.0, с помощью спектрофотометра Evolution 300 UV-Vis (Thermo Scientific, США).

Ингибирование субстратом

Реакцию трансаминирования, катализируемую ТА_Halhy, проводили в 50-мМ K-фосфатном буфере, pH 8.0, при 40°C с субстратами D-аланином (40 мМ) и α-кетоглутаратом или D-глутаматом и пируватом (2.5 мМ) с добавлением 30 мкМ ПЛФ, 0.33 мМ NADH, 5 мкг/мл лактатдегидрогеназы (удельная активность препарата составляет 200 мкмоль/мин на 1 мг белка). В условиях реакции трансаминирования препарат лактатдегидрогеназы был стабилен. Температурной инактивации ТА_Halhy при 40°С не наблюдалось [14].

Получение кристаллов комплекса ТА_Halhy с оксимом ПЛФ и 3-аминооксипропионовой кислоты

Кристаллы комплекса получены сокристаллизацией препарата холофермента ТА_Halhy с 12 мМ 3-аминооксипропионовой кислоты в присутствии избытка ПЛФ (6 мМ) в условиях: 0.1 M бис-Трис-пропан pH 5.5, 0.2 M MgCl2, 25% PEG 3350.

Сбор и обработка дифракционных данных. Решение и уточнение структуры

 

Таблица 1. Статистика сбора, обработки и кристаллографического уточнения структуры комплекса TA_Halhy с оксимом ПЛФ и 3-аминооксипропионовой кислоты

Объект исследования

Комплекс TA_Halhy

Источник рентгеновского излучения

НИЦ «Курчатовский институт»

Длина волны, Å

0.74503

Tемпература, K

100

Обработка

Пространственная группа

C2

Параметры элементарной ячейки

a = 88.77 Å, b = 71.23 Å, c = 52.55 Å;

α = γ = 90°, β = 101.26°

Разрешение, Å

35.34–1.70 (1.73–1.70)

Число независимых рефлексов

32789 (1795)

Полнота, %

94.9 (98.6)

Rmeas, %

10.1 (54.6)

Среднее I/σ(I)

11.4 (1.9)

CC1/2, %

99.1 (60.2)

Уточнение

Rwork, %

16.6

Rfree, %

21.0

Общий средний B-фактор

17.9

Средний B-фактор по белку

16.8

Средний B-фактор по лигандам

16.5

Средний B-фактор по растворителю

26.2

Число неводородных атомов

Всего

2607

Белок

2275

Лиганды

23

Растворитель

309

Среднеквадратичные отклонения

Длины связей, Å

0.01

Валентные углы, °

1.67

График Рамачандрана

Наиболее благоприятные, %

98.2

Допустимые, %

1.8

PDB ID

8YRV

 

Непосредственно перед рентгеноструктурным экспериментом кристаллы ТА_Halhy помещали в криораствор, содержащий помимо компонентов противораствора 25% (v/v) глицерин, после чего кристалл в петле замораживали в парах азота. Дифракционные данные, собранные при температуре 100 K на станции «Белок» синхротронного источника НИЦ «Курчатовский институт», обрабатывали с использованием программы Dials [18] из пакета CCP4 [19]. Статистика собранного набора данных приведена в табл. 1. Решение структуры проведено методом молекулярного замещения при помощи программы MOLREP [20]. Уточнение проведено в программе REFMAC5 [21]. В качестве стартовой модели использовали структуру холоформы трансаминазы D-аминокислот из H. hydrossis (PDB код 7P7X). Визуальный анализ структурных данных проводили с использованием программ Coot [22] и PyMOL Molecular Graphics System, Version 4.6 (Schrödinger, США).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Спектральный анализ взаимодействия TA_Halhy с 3-аминооксипропионовой кислотой

На рис. 3 представлены спектры холофермента ТА_Halhy (25 мкМ) в 50-мМ К-фосфатном буфере, pH 8.0, сразу после добавления 10 мМ 3-аминооксипропионовой кислоты и инкубации при 25°С в течение 1 ч. Наблюдаемые изменения указывают на образование оксима ПЛФ и 3-аминооксипропионовой кислоты в активном центре TA_Halhy (спектр с λmax = 380 нм) и выход оксима из активного центра в раствор (спектр с λmax = 333 нм соответствует спектру оксима ПЛФ и H2NOR в растворе [23]). Из рис. 3Б видно, что спектр TA_Halhy после перевода в новый буфер через 1 ч инкубирования соответствует апоферменту (без ПЛФ и его аддуктов). Добавление ПЛФ в полученный раствор апофермента приводит к образованию холофермента и полному восстановлению активности TA_Halhy.

 

Рис. 3. Взаимодействие холофермента ТА_Halhy (25 мкМ) с 3-аминооксипропионовой кислотой (10 мМ) при 25°С в 50-мМ К-фосфатном буфере, pH 8.0. А – спектр поглощения холофермента TA_Halhy до (черный), после смешения (красный) и после инкубирования в течение 1 ч (синий) с 3-аминооксипропионовой кислотой; Б – спектр поглощения холофермента ТА_Halhy после 1 ч инкубации с 3-аминооксипропионовой кислотой (синий), после перевода в 50-мМ К-фосфатный буфер, pH 8.0 (зеленый), спектр поглощения низкомолекулярной фракции (розовый), собранной ультрафильтрацией

 

Быстрое образование оксима ПЛФ с 3-аминооксипропионовой кислотой в активном центре ТА_Halhy (рис. 3А, спектр с λmax = 380 нм) хорошо согласуется с известными данными о том, что основания Шиффа, в данном случае внутренний альдимин, реагируют с О-замещенными гидроксиламинами намного быстрее чем соответствующий альдегид [24]. При этом эффективность ингибирования ТА О-замещенными гидроксиламинами определяется структурным подобием радикала О-замещенного гидроксиламина и боковой группы субстрата аминокислоты, а также прочностью связывания ПЛФ с активным центром фермента [8–10, 25, 26]. Так, аспартатаминотрансфераза образует прочные оксимы с аминооксиуксусной и 3-аминооксипропионовой кислотами, моделирующими внешние альдимины с субстратами, аспарагиновой и глутаминовой кислотами. При этом карбоксильные группы ингибиторов выполняют якорные функции, обеспечивая дополнительное связывание оксимов в активном центре фермента. Удаление избытка этих гидроксиламинов не приводит к выходу оксимов ПЛФ из активного центра фермента, равно как и добавление избытка ПЛФ не восстанавливает активность [6]. Напротив, TA_Halhy имеет низкое сродство к ПЛФ (Кдис = 1.9 ± 0.3 мкМ [16]) и оксим ПЛФ легко выходит из активного центра (рис. 3). Аналогичная диссоциация наблюдалась при взаимодействии TA_Halhy c D-циклосерином [17] и фенилгидразином [16], что указывает на открытый активный центр TA_Halhy, который, по-видимому, сохраняет открытую конформацию в ходе каталитических превращений [14, 16]. Диссоциация комплекса с оксимом приводит к накоплению апофермента (рис. 3Б). Добавление ПЛФ к комплексу TA_Halhy с оксимом приводит к реактивации фермента, активный холофермент образуется в результате диссоциации комплекса и выхода оксима из активного центра с образованием апофермента и последующего взаимодействия апофермента с добавленным ПЛФ. Таким образом, ингибирование 3-аминооксипропионовой кислотой обратимо. Реактивация TA_Halhy при добавлении ПЛФ согласуется с ранее показанной стабильностью апофермента [15].

 

Рис. 4. Активный центр ТА_Halhy в комплексе с оксимом ПЛФ и 3-аминооксипропионовой кислоты. А – наложение структур комплекса ТА_Halhy (зеленый; PDB код 8YRV) и холофермента ТА_Halhy (фиолетовый; PDB код 7P7X), расстояния показаны пунктирной линией и указаны в ангстремах; Б – разностная omit-карта электронной плотности (Fo-Fc) для оксима ПЛФ и 3-аминооксипропионовой кислоты. Электронная плотность показана серой сетчатой моделью на срезке 3σ; В – наложение положений кофактора в структурах холофермента (фиолетовый) и комплекса с оксимом (зеленый)

 

Мы успешно закристаллизовали комплекс TA_Halhy с оксимом ПЛФ и 3-аминооксипропионовой кислоты в активном центре. В результате рентгеноструктурного эксперимента собран набор дифракционных данных, структура комплекса TA_Halhy решена и уточнена. Структуры холофермента и комплекса с оксимом хорошо накладываются (RMSD по Сα-атомам составляет 0.31). Отличия наблюдаются в основном в положении петель. Важно отметить, что карбоксильная группа оксима ПЛФ с 3-аминооксипропионовой кислотой располагается в О-кармане, хотя у трансаминаз D-аминокислот IV типа укладки боковая группа субстрата связывается в Р-кармане, а в О-кармане располагается α-карбоксильная группа субстратов (D-аминокислоты или кетокислоты), которая образует водородные связи с функциональными группами активного центра [27, 28]. В полученной структуре карбоксильная группа оксима образует водородные связи с гуанидиновыми группами остатков Arg28* и Arg179. Остатки Arg90 и Lys241 не задействованы в связывании карбоксильной группы, боковые группы всех перечисленных остатков не изменили своего положения, геометрия активного центра холофермента сохраняется в структуре комплекса с оксимом (рис. 4А).

Наблюдаемое положение аддукта в активном центре TA_Halhy имитирует скорее не образование внешнего альдимина со специфическим субстратом D-глутаминовой кислотой, а ингибирование субстратом. Известно, что ингибирование субстратом сопутствует катализу трансаминазами из-за сходного связывания субстратов (аминокислоты и кетокислоты). Ингибирование TA_Halhy D-глутаминовой кислотой и α-кетоглутаратом наблюдается уже при миллимолярных концентрациях субстратов (рис. 5).

 

Рис. 5. Ингибирование TA_Halhy в реакции трансаминирования субстратом D-глутаминовой кислотой в присутствии 2.5 мМ пирувата (●) и субстратом α-кетоглутаратом в присутствии 40 мМ D-аланина (▲) в 50-мМ К-фосфатном буфере, рН 8.0, при 40оС. Отрезками обозначено стандартное отклонение

 

Известно, как минимум, два механизма ингибирования: (1) D-глутаминовая кислота связывается вместо кетосубстрата в активном центре, содержащем кофактор в форме пиридоксамин-5’-фосфата; (2) место α-карбоксильной группы занимает γ-карбоксильная группа D-глутаминовой кислоты или α-кетоглутарата. Именно такое связывание и наблюдается в комплексе (рис. 4А). Такое непродуктивное ингибирующее связывание согласуется с высоким значением наблюдаемой константы диссоциации комплекса TA_Halhy с D-глутаминовой кислотой, определенной методом полуреакций (Kd = 1.8 ± 0.4 мМ [29]).

 

Стоит также отметить, что в структуре комплекса изменилось положение молекулы ПЛФ: в форме оксима молекула ПЛФ отклонилась ко входу в активный центр на 18° вдоль оси N1-C6 (рис. 4Б,В). Такое изменение положения кофактора наблюдается при переходе из внутреннего альдимина во внешний (рис. 2) [13, 27]. Полученные данные подтверждают гипотезу о том, что в форме внутреннего альдимина кофактор находится в напряжении, которое снимается при образовании внешнего альдимина (разрыва ковалентной связи с боковой группой остатка каталитического лизина) [30] или оксима в случае 3-аминооксипропионовой кислоты. Интересно отметить, что активный центр ТА_Halhy остается открытым после образования оксима, что подтверждается выходом оксима в раствор после 1 ч инкубации фермента с избытком 3-аминооксипропионовой кислоты (см. выше). Открытый активный центр наблюдался ранее у TA_Halhy в комплексе с фенилгидразином и в комплексе с D-циклосерином; открытый активный центр наблюдался у гомологичной трансаминазы D-аминокислот из Aminobacterium colombience в комплексах с D-глутаминовой кислотой и 3-аминооксипропионовой кислотой [13] и у канонической трансаминазы D-аминокислот из Bacillus sp. YM-1 в комплексе с D-аланином [27]. Другими словами, стереоселективное трансаминирование у трансаминаз D-аминокислот, по-видимому, происходит без закрытия активного центра (отделения от растворителя), как, например, в случае трансаминаз I типа укладки [7].

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Изучение взаимодействия холофермента трансаминазы D-аминокислот из H. hydrossis с 3-аминооксипропионовой кислотой позволило сделать следующие выводы: (1) ингибирование 3-аминооксипропионовой кислотой обратимо; (2) активный центр трансаминазы остается открытым после связывания субстратов/ингибиторов; (3) координация карбоксильной группы оксима в О-кармане подтверждает участие остатков Arg28* и Arg179 в связывании субстратов, однако, наблюдаемое положение оксима соответствует ингибированию субстратом, когда субстрат (α-кетоглутарат и D-глутаминовая кислота) связываются непродуктивно (γ-карбоксильной группой в О-кармане активного центра), и реакционная аминогруппа субстрата направлена в сторону от ПЛФ и боковой группы каталитического остатка лизина.

Работа поддержана Российским научным фондом, грант № 23-74-30004, в части проведения спектральных и кинетических исследований. Работа выполнена при поддержке Министерства науки и высшего образования Российской Федерации в части кристаллизации комплекса, рентгеноструктурного эксперимента, решения и уточнения структуры.

×

Об авторах

А. К. Бакунова

Институт биохимии имени А.Н. Баха, Федеральный исследовательский центр «Фундаментальные основы биотехнологии» РАН

Email: eubez@inbi.ras.ru
Россия, Москва, 119071

И. О. Матюта

Институт биохимии имени А.Н. Баха, Федеральный исследовательский центр «Фундаментальные основы биотехнологии» РАН

Email: eubez@inbi.ras.ru
Россия, Москва, 119071

А. Ю. Николаева

Институт биохимии имени А.Н. Баха, Федеральный исследовательский центр «Фундаментальные основы биотехнологии» РАН; Национальный исследовательский центр «Курчатовский институт»

Email: eubez@inbi.ras.ru
Россия, Москва, 119071; Москва, 123182

К. М. Бойко

Институт биохимии имени А.Н. Баха, Федеральный исследовательский центр «Фундаментальные основы биотехнологии» РАН

Email: eubez@inbi.ras.ru
Россия, Москва, 119071 Россия

А. Р. Хомутов

Институт молекулярной биологии имени В.А. Энгельгардта РАН

Email: eubez@inbi.ras.ru
Россия, Москва, 119991

Е. Ю. Безсуднова

Институт биохимии имени А.Н. Баха, Федеральный исследовательский центр «Фундаментальные основы биотехнологии» РАН

Автор, ответственный за переписку.
Email: eubez@inbi.ras.ru
ORCID iD: 0000-0002-4954-7547

 

 

Россия, Москва, 119071

В. О. Попов

Институт биохимии имени А.Н. Баха, Федеральный исследовательский центр «Фундаментальные основы биотехнологии» РАН; Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова, биологический факультет

Email: eubez@inbi.ras.ru
ORCID iD: 0000-0002-0133-7962
Россия, Москва, 119071; Москва, 119234

Список литературы

  1. 1.Eliot A.C., Kirsch J.F. // Annu. Rev. Biochem. 2004. V. 73. P. 383–415.
  2. 2.Steffen-Munsberg F., Vickers C., Kohls H., Land H., Mallin H., Nobili A., Skalden L., van den Bergh T., Joosten H.-J., Berglund P., Höhne M., Bornscheuer U.T. // Biotechnol. Adv. 2015. V. 33. P. 566–604.
  3. 3.Braunstein A.E. Amino Group Transfer. The Enzymes / Ed. Boyer P.D. London: Acad. Press, 1973. V. 9. P. 379–481.
  4. Winkler C.K., Schrittwieser J.H., Kroutil W. // ACS Cent. Sci. 2021. V. 7. P. 55–71.
  5. Madsen J.Ø., Woodley J.M. // ChemCatChem. 2023. V. 15. № 13. e202300560.
  6. Delbaere L.T.J., Kallen J., Markovic-Housley Z., Khomutov A.R., Khomutov R.M., Karpeisky M.Y., Jansonius J.N. // Biochimie. 1989. V. 71. P. 449–459.
  7. Markovic-Housley Z., Schirmer T., Hohenester E., Khomutov A.R., Khomutov R.M., Karpeisky M.Y., Sandmeier E., Christen P., Jansonius J.N. // Eur. J. Biochem. 1996. V. 236. P. 1025–1032.
  8. Сащенко Л.П., Северин Е.С., Хомутов Р.М. // Биохимия. 1968. Т. 33. № 1. С. 142–147.
  9. Хомутов Р.М., Денисова Г.Ф., Хомутов А.Р., Белостоцкая К.М., Шлосман Р.Б., Артамонова Е.Ю. // Биоорган. химия. 1985. Т. 11. № 11. С. 1574–1576.
  10. Hyvönen M.T., Keinänen T.A., Nuraeva G.K., Yanvarev D. V., Khomutov M., Khurs E.N., Kochetkov S.N., Vepsäläinen J., Zhgun A.A., Khomutov A.R. // Biomolecules. 2020. V. 10. P. 406.
  11. Liu W., Peterson P.E., Carter R.J., Zhou X., Langston J.A., Fisher A.J., Toney M.D. // Biochemistry. 2004. V. 43. P. 10896–10905.
  12. Zhou X.E., Suino-Powell K., Schultz C.R., Aleiwi B., Brunzelle J.S., Lamp J., Vega I.E., Ellsworth E., Bachmann A.S., Melcher K. // Biochem. J. 2021. V. 478. P. 4137–4149.
  13. Shilova S.A., Matyuta I.O., Khrenova M.G., Nikolaeva A.Y., Klyachko N.L., Minyaev M.E., Khomutov A.R., Boyko K.M., Popov V.O., Bezsudnova E.Y. // Biochem. J. 2023. V. 480. P. 1267–1284.
  14. Bakunova A.K., Nikolaeva A.Y., Rakitina T.V., Isaikina T.Y., Khrenova M.G., Boyko K.M., Popov V.O., Bezsudnova E.Y. // Molecules. 2021. V. 26. P. 5053.
  15. Bakunova A.K., Isaikina T.Y., Popov V.O., Bezsudnova E.Y. // Catalysts. 2022. V. 12. P. 1551.
  16. Bakunova A.K., Matyuta I.O., Minyaev M.E., Isaikina T.Y., Boyko K.M., Popov V.O., Bezsudnova E.Y. // Arch. Biochem. Biophys. 2024. V. 756. P. 110011.
  17. Bakunova A.K., Matyuta I.O., Nikolaeva A.Y., Boyko K.M., Popov V.O., Bezsudnova E.Yu. // Biochem. 2023. V. 88. P. 687–697.
  18. Winter G., Waterman D.G., Parkhurst J.M., Brewster A.S., Gildea R.J., Gerstel M., Fuentes-Montero L., Vollmar M., Michels-Clark T., Young I.D., et al. // Acta Crystallogr. Sect. D Struct. Biol. 2018. V. 74. P. 85–97.
  19. Collaborative Computational Project, Number 4 // Acta Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 1994. V. 50. P. 760–763.
  20. 20.Vagin A., Teplyakov A. // J. Appl. Crystallogr. 1997. V. 30. P. 1022–1025.
  21. Murshudov G.N., Skubák P., Lebedev A.A., Pannu N.S., Steiner R.A., Nicholls R.A., Winn M.D., Long F., Vagin A.A. // Acta Crystallogr. Sect. D Biol. Crystallogr. 2011. V. 67. P. 355–367.
  22. Emsley P., Lohkamp B., Scott W.G., Cowtan K. // Acta Crystallogr. Sect. D Biol. Crystallogr. 2010. V. 66. P. 486–501.
  23. Morozov V.Y. Vitamin B – pyridoxal phosphate. Part A. / Eds Dolphin D., Poulson R., Avramovic O. New York: John Wiley & Sons, 1986. P. 131–222.
  24. Dirksen A., Dawson P.E. // Bioconjug. Chem. 2008. V. 19. P. 2543–2548.
  25. Castro-Oropeza R., Pino-Ángeles A., Khomutov M.A., Urdiales J.L., Moya-García A.A., Vepsäläinen J., Persson L., Sarabia F., Khomutov A., Sánchez-Jiménez F. // Amino Acids. 2014. V. 46. P. 621–631.
  26. Khomutov A.R., Gabibov A.G., Khurs E.N., Tolosa E.A., Shuster A.M., Goryachenkova E.V., Khomutov R.M. Biochemistry of Vitamin B6 / Eds Christen P., Korpela T. Basel: Birkhauser, 1987. P. 317–321.
  27. Peisach D., Chipman D.M., van Ophem P.W., Manning J.M., Ringe D. // Biochemistry. 1998. V. 37. P. 4958–4967.
  28. Shilova S.A., Khrenova M.G., Matyuta I.O., Nikolaeva A.Y., Rakitina T.V., Klyachko N.L., Minyaev M.E., Boyko K.M., Popov V.O., Bezsudnova E.Y. // Molecules. 2023. V. 28. P. 2109.
  29. Bakunova A.K., Kostyukov A.A., Kuzmin V.A., Popov V.O., Bezsudnova E.Y. // Biochim. Biophys. Acta – Proteins Proteomics. 2023. V. 1871. P. 140886.
  30. Hayashi H., Mizuguchi H., Miyahara I., Islam M.M., Ikushiro H., Nakajima Y., Hirotsu K., Kagamiyama H. // Biochim. Biophys. Acta – Proteins Proteomics. 2003. V. 1647. P. 103–109.

Дополнительные файлы

Доп. файлы
Действие
1. JATS XML
Скачать
2. Рис. 1. Пространственная структура ТА_Halhy. А – гомодимер ТА_Halhy; Б – активный центр ТА_Halhy. Аминокислотные остатки, образующие O-карман, окрашены оранжевым, аминокислотные остатки, образующие P-карман, окрашены зеленым. Молекула ПЛФ показана фиолетовым. * – остаток соседней субъединицы функционального димера

Скачать (522KB)
Метаданные
3. Рис. 2. Взаимодействие внутреннего альдимина TА_Halhy (холофермент) с 3-аминооксипропионовой кислотой (образуется оксим) и D-глутаминовой кислотой (образуется внешний альдимин)

Скачать (186KB)
Метаданные
4. Рис. 3. Взаимодействие холофермента ТА_Halhy (25 мкМ) с 3-аминооксипропионовой кислотой (10 мМ) при 25°С в 50-мМ К-фосфатном буфере, pH 8.0. А – спектр поглощения холофермента TA_Halhy до (черный), после смешения (красный) и после инкубирования в течение 1 ч (синий) с 3-аминооксипропионовой кислотой; Б – спектр поглощения холофермента ТА_Halhy после 1 ч инкубации с 3-аминооксипропионовой кислотой (синий), после перевода в 50-мМ К-фосфатный буфер, pH 8.0 (зеленый), спектр поглощения низкомолекулярной фракции (розовый), собранной ультрафильтрацией

Скачать (260KB)
Метаданные
5. Рис. 4. Активный центр ТА_Halhy в комплексе с оксимом ПЛФ и 3-аминооксипропионовой кислоты. А – наложение структур комплекса ТА_Halhy (зеленый; PDB код 8YRV) и холофермента ТА_Halhy (фиолетовый; PDB код 7P7X), расстояния показаны пунктирной линией и указаны в ангстремах; Б – разностная omit-карта электронной плотности (Fo-Fc) для оксима ПЛФ и 3-аминооксипропионовой кислоты. Электронная плотность показана серой сетчатой моделью на срезке 3σ; В – наложение положений кофактора в структурах холофермента (фиолетовый) и комплекса с оксимом (зеленый)

Скачать (570KB)
Метаданные
6. Рис. 5. Ингибирование TA_Halhy в реакции трансаминирования субстратом D-глутаминовой кислотой в присутствии 2.5 мМ пирувата (●) и субстратом α-кетоглутаратом в присутствии 40 мМ D-аланина (▲) в 50-мМ К-фосфатном буфере, рН 8.0, при 40оС. Отрезками обозначено стандартное отклонение

Скачать (140KB)
Метаданные

© Бакунова А.К., Матюта И.О., Николаева А.Ю., Бойко К.М., Хомутов А.Р., Безсуднова Е.Ю., Попов В.О., 2024

Creative Commons License
Эта статья доступна по лицензии Creative Commons Attribution 4.0 International License.

Данный сайт использует cookie-файлы

Продолжая использовать наш сайт, вы даете согласие на обработку файлов cookie, которые обеспечивают правильную работу сайта.

О куки-файлах