Пептид, имитирующий петлю II эпителиального белка человека SLURP-2, повышает жизнеспособность и стимулирует миграцию кератиноцитов кожи

Полный текст

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ α-Bgtx – α-бунгаротоксин; ACh – ацетилхолин; Atr – атропин; Dhβe – дигидро-β-эритроидина гидробромид; mAChR – мускариновый ацетилхолиновый рецептор; MII – α-конотоксин MII; MLA – метилликаконитин; mTOR – мишень рапамицина у млекопитающих; NF-kB – ядерный фактор kB; nAChR – никотиновый ацетилхолиновый рецептор; p38 MAPK – митоген-активируемая протеинкиназа р38; STAT3 – сигнальный белок и активатор транскрипции 3.

ВВЕДЕНИЕ

Белки семейства Ly6/uPAR экспрессируются во многих тканях и клетках человека [1]. Белки Ly6/uPAR обладают широким спектром функций и участвуют в контроле пролиферации клеток, миграции, межклеточном взаимодействии, созревании иммунных клеток, активации макрофагов и выработке цитокинов, а также в когнитивных процессах [1–3]. Некоторые из них являются лигандами никотиновых и мускариновых ацетилхолиновых рецепторов (nAChR и mAChR соответственно). Ацетилхолиновые рецепторы регулируют различные процессы, в том числе рост, миграцию и дифференцировку эпителиальных клеток [4, 5]. Лиганды ацетилхолиновых рецепторов могут быть использованы в качестве прообразов препаратов, эффективных при заболеваниях, связанных с нарушением регуляции работы этих рецепторов [6, 7]. Секретируемые белки Ly6/uPAR человека – SLURP-1 и SLURP-2, являются ауто/паракринными регуляторами гомеостаза эпителия и лигандами ацетилхолиновых рецепторов [8–11]. SLURP-1 ингибирует рост и миграцию нормальных и опухолевых клеток [12–15]. Ранее этот белок рассматривался в качестве прототипа противоопухолевых препаратов, направленных на таргетирование α7-nAChR [12, 16]. Белок SLURP-2 стимулирует пролиферацию и миграцию кератиноцитов полости рта Het-1A и может служить прообразом препаратов для ранозаживления [17, 18]. SLURP-2 может взаимодействовать с α3, α4, α5, α7, β2 и β4-субъединицами nAChR, а также с mAChR типа M1 и M3. SLURP-2 ингибирует ток через ионный канал α4β2- и α3β2-nAChR, в то время как при низких концентрациях потенцирует α7-nAChR [17]. При этом SLURP-2 усиливает миграцию кератиноцитов Het-1A, взаимодействуя с α7-nAChR [18], и стимулирует пролиферацию кератиноцитов, взаимодействуя с α3β2-nAChR и mAChR [17]. Замена аминокислотного остатка R20 на остаток аланина в «голове» молекулы SLURP-2 приводит к усилению ингибирования тока через α7-nAChR и повышению ускорения миграции кератиноцитов [18].

Функциональными эпитопами белков Ly6/uPAR (называемых также «трехпетельными» белками, благодаря их характерной «трехпетельной» организации, рис. 1А,Б) являются петлевые участки [19]. В данной работе получены синтетические фрагменты, соответствующие петлевым участкам и участку «головы» молекулы SLURP-2, и изучено их влияние на миграцию и жизнеспособность кератиноцитов кожи HaCaT. Показано, что пептид, соответствующий петле II, повышает жизнеспособность кератиноцитов, взаимодействуя с α7-nAChR, и стимулирует миграцию, взаимодействуя с α3β2-nAChR и ингибируя активацию p38 MAPK. Результаты работы указывают на перспективность использования пептида «петля II» в качестве ранозаживляющего препарата.

 

Рис. 1. Структура белка SLURP-2 и пептидов, соответствующих петлям и «голове» белка. Остатки цистеина показаны желтым или оранжевым цветами, дисульфидные связи – скобками над аминокислотной последовательностью. А – аминокислотная последовательность белка SLURP-2. Б – пространственная структура белка SLURP-2 [17]. В – аминокислотная последовательность пептидов, соответствующих петлям и «голове» SLURP-2

 

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Культивирование клеток

Клетки HaCaT человека (иммортализованная линия кератиноцитов кожи человека) были получены из Американской коллекции типовых культур (ATCC, США). Клетки культивировали при 37°C и 5% CO₂ в среде DMEM («ПанЭко», Россия) c 2 мМ L-глутамина и 25 мМ глюкозы c добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки (Biosera, Франция), обозначенной ниже как «полноценная» среда. Клетки культивировали при 37°C и 5% CO₂, пересевали минимум 2 раза в неделю.

Получение SLURP-2 и его пептидных миметиков

Рекомбинантный препарат SLURP-2 получали в клетках E. coli как описано ранее [20]. Пептиды, имитирующие первую, вторую, третью петли и «голову» молекулы SLURP-2 (рис. 1В), получены с помощью химического синтеза согласно [15]. Чистоту и корректную пространственную структуру препаратов подтверждали с помощью масс-спектрометрии, высокоэффективной жидкостной хроматографии и ¹Н-ЯМР-спектроскопии.

Влияние SLURP-2, его пептидных миметиков и ингибиторов ацетилхолиновых рецепторов на жизнеспособность клеток HaCaT

Клетки высевали в 96-луночные планшеты (5 × 10³ клеток на лунку), через 24 ч к клеткам добавляли SLURP-2 или его пептидные миметики, разведенные в полноценной среде из 1 мМ стокового раствора в 100% ДМСО, в концентрации 100 нМ. Затем клетки инкубировали при 37°C и 5% CO₂ в течение 24 ч. Отсутствие влияния 0.01% ДМСО на жизнеспособность и миграцию клеток подтверждено в отдельном эксперименте.

Для изучения влияния ингибиторов ацетилхолиновых рецепторов на эффект SLURP-2 и петли II клетки HaCaT предварительно инкубировали с атропином (Atr (Sigma-Aldrich, США), неселективный ингибитор mAChR), α-конотоксином MII (MII (Tocris, Великобритания), селективный ингибитор α3β2-nAChR), дигидро-β-эритроидином (Dhβe (Sigma-Aldrich), селективный ингибитор α4β2-nAChR), метилликаконитином (MLA (Sigma-Aldrich), селективный ингибитор α7-nAChR), разведенными в полноценной среде, в течение 30 мин. Для всех ингибиторов использовали концентрацию 1 мкМ, определенную ранее [17]. После этого к клеткам добавляли SLURP-2 или петлю II в концентрации 100 нМ и соответствующие ингибиторы в концентрации 1 мкМ, и клетки инкубировали дополнительно в течение 24 ч.

Для оценки жизнеспособности к клеткам добавляли 5 мкл реагента CCK-8 (Servicebio, Китай) и инкубировали в течение 1 ч при 37°C и 5% CO₂, после этого измеряли оптическую плотность при 450 нм с выравниванием на фон при 655 нм на планшетном ридере Bio-Rad 680 (Bio-Rad, США). Результаты анализировали с помощью программы Graphpad Prism 9.5.0 (GraphPad Software, США).

Влияние SLURP-2, его пептидных миметиков и ингибиторов ацетилхолиновых рецепторов на миграцию клеток HaCaT

Влияние SLURP-2, его пептидных миметиков и ингибиторов ацетилхолиновых рецепторов (Atr, MII, Dhβe и MLA) на миграцию клеток HaCaT в модели «заживление раны» in vitro (scratch-тест) анализировали согласно методике, описанной ранее [15]. Клетки HaCaT высевали в 96-луночные планшеты (3 × 10⁴ клеток/лунку) и выращивали при 37°C и 5% CO₂ в течение 24 ч. Затем стерильным наконечником пипетки объемом 10 мкл процарапывали вертикальную полосу (насадка GenFollower, E-FTB10S, Китай), после чего клетки промывали PBS и добавляли SLURP-2 или его пептидные миметики в концентрации 100 нМ, или ингибиторы рецепторов в концентрации 1 мкМ (Atr, MII, Dhβe, MLA) отдельно или в смеси с SLURP-2 или пептидом, имитирующим петлю II, разведенных в среде без сыворотки из 1 мМ стокового раствора в 100% ДМСО. Снимки лунок с процарапанными полосами анализировали через 0 и 24 ч при увеличении 20×, используя систему анализа клеток CloneSelect Imager (Molecular Devices, США). Получали цифровые изображения, площадь царапин оценивали с помощью программ ImageJ (NIH, США) и MS Excel (Microsoft, США), вычисляя процент поверхности царапин, занятой мигрирующими клетками. Полученные результаты анализировали с помощью программы Graphpad Prism 9.5.0 (GraphPad Software).

ПЦР в реальном времени

Суммарную мРНК из культивируемых клеток экстрагировали с помощью HiPure Total RNA Plus Kit (Magen, Китай) по инструкции производителя. Суммарную кДНК синтезировали с использованием набора MINT Reverse Transcriptase («Евроген», Россия) в соответствии с протоколом производителя. После этого проводили ПЦР в реальном времени с праймерами, приведенными в табл. 1, и готовой к применению смесью для количественной ПЦР с флуоресцентным красителем SYBR Green I из набора 5X qPCRmix-HS SYBR («Евроген»).

 

Таблица 1. Олигонуклеотидные праймеры, использованные в работе

Ген	Нуклеотидная последовательность
	Прямой праймер	Обратный праймер
RPL13A	TCAAAGCCTTCGCTAGTCTCC	GGCTCTTTTTGCCCGTATGC
ITGA1	ATAAGTGGCCCAGCCAGAGA	CAGCAGCGTAGAACAACAGTG
ITGA2	CGGTTATTCAGGCTCACCGA	GCTGACCCAAAATGCCCTCT
ITGA3	CCTGCACCCCAAAAACATCA	AGGTCCTGCCACCCATCATT
ITGA5	GGGCTTCAACTTAGACGCGGA	CCCCAAGGACAGAGGTAGACA
ITGA6	GGTGGAGAGACTGAGCATGA	GTCAAAAACAGCAGGCCTAAGTA
ITGA9	GACCGCGATGATGAGTGGAT	GATGAGCACAGGCCAACACA
ITGAV	GACTCCTGCTACCTCTGTGC	GAAGAAACATCCGGGAAGACG
ITGB1	CCGCGCGGAAAAGATGAAT	CCACAATTTGGCCCTGCTTG
ITGB3	ATTGGAGACACGGTGAGCTT	ACTCAAAGGTCCCATTGCCA
SNAI1	GGTTCTTCTGCGCTACTGCT	TGCTGGAAGGTAAACTCTGGAT
SNAI2	ACTGGACACACATACAGTGATT	ACTCACTCGCCCCAAAGATG

 

Отрицательные контроли содержали все компоненты смеси для ПЦР, кроме кДНК, и не давали сигнала. Все реакции ПЦР проводили с использованием амплификатора Roche Light cycler 96 с детекцией в режиме реального времени. Данные анализировали с использованием программного обеспечения Light-Cycler 96 SW1.01. Уровень экспрессии генов нормировали по уровню экспрессии гена домашнего хозяйства RPL13A.

Анализ фосфорилирования белков

Фосфорилирование клеточных сигнальных белков анализировали с использованием магнитных частиц Bio-Plex (Bio-Rad, США). Клетки инкубировали в течение 24 ч с SLURP-2 или петлей II в концентрации 100 нМ, разведенными в полноценной среде из 1 мМ стокового раствора в 100% ДМСО, далее клетки лизировали с использованием буфера, предоставленного производителем. Анализ проводили с использованием проточного цитометра Bio-Rad 200 (Bio-Rad) согласно инструкциям производителя и с использованием программного обеспечения Bio-Plex Manager 6.2 (Bio-Rad).

Статистическая обработка данных

Данные представляли как среднее ± стандартная ошибка среднего (SEM). Количество образцов (n) указано в подписях к рисункам. Статистический анализ проводили с использованием программного обеспечения GraphPad Prism 9.5.0. Нормальность распределения оценивали с помощью теста Шапиро–Уилка. Анализ проводили с использованием одновыборочного критерия Стьюдента (в случае сравнения с нормированным контролем, рис. 2–5) и однофакторного теста ANOVA с последующим тестом Даннета (в случае множественного сравнения, рис. 3). Различия между группами считали статистически значимыми при р < 0.05.

 

Рис. 2. Влияние SLURP-2 и пептидов на жизнеспособность кератиноцитов HaCaT. А – влияние SLURP-2 и пептидов в концентрации 100 нМ на жизнеспособность кератиноцитов HaCaT. Данные приведены в процентах от контроля ± стандартная ошибка среднего (n = 6–14), 100% жизнеспособных клеток соответствует необработанным клеткам. *p < 0.05, **p < 0.01 и ***p < 0.001 указывают на достоверное отличие от контроля (100%) по одновыборочному критерию Стьюдента. Б – влияние 100 нМ SLURP-2 и пептидов на миграцию кератиноцитов HaCaT. Данные приведены в процентах от контроля ± стандартная ошибка среднего (n = 12–24), 100% соответствует площади миграции необработанных клеток. ***p < 0.01 – достоверное отличие от контроля (100%) по одновыборочному критерию Стьюдента

 

Рис. 3. Влияние SLURP-2, пептидов и ингибиторов различных ацетилхолиновых рецепторов на жизнеспособность и миграцию кератиноцитов HaCaT. А – влияние петли II (100 нМ) и ингибиторов различных ацетилхолиновых рецепторов (1 мкМ) на миграцию кератиноцитов HaCaT. Данные приведены в процентах от контроля ± стандартная ошибка среднего (n = 11–40), 100% соответствует площади миграции необработанных клеток. *p < 0.05 и ***p < 0.001 – достоверное отличие от контроля (100%) по одновыборочному критерию Стьюдента. ####p < 0.001 указывает на отличие от группы «петля II» по однофакторному тесту ANOVA с последующим тестом Даннета. Б – влияние ингибиторов различных ацетилхолиновых рецепторов на эффект SLURP-2 и петли II на жизнеспособность. Данные приведены в процентах от контроля ± стандартная ошибка среднего (n = 4–14), 100% жизнеспособных клеток соответствует необработанным клеткам. *p < 0.05, **p < 0.01 и ***p < 0.001 – достоверное отличие от контроля (100%) по одновыборочному критерию Стьюдента. ### p < 0.001 указывает на отличие от группы «SLURP-2» по однофакторному тесту ANOVA с последующим тестом Даннета, &p < 0.05 указывает на отличие от группы «петля II» по однофакторному тесту ANOVA с последующим тестом Даннета

 

Рис. 4. Влияние SLURP-2 и петли II на экспрессию мРНК, кодирующих α1, α2, α3, α5, α6, α9, β1, β3-интегрины и факторы транскрипции SNAI1 и SNAI2. Использовали 100 нМ концентрацию SLURP-2 и петли II. Данные нормированы на среднее значение экспрессии необработанных клеток и приведены как lg ± стандартная ошибка среднего (n = 5–10). Экспрессия генов нормирована на экспрессию гена домашнего хозяйства RPL13A

 

Рис. 5. Влияние SLURP-2 и петли II на фосфорилирование сигнальных белков: Src (Tyr416), p38 MAPK (Thr180/Tyr182), mTOR (Ser2448), STAT3 (Tyr705) и NF-kB (Ser536). Использовали 100 нМ концентрацию SLURP-2 и петли II. Данные приведены в процентах от контроля ± стандартная ошибка среднего (n = 5–6), 100% соответствует уровню фосфорилирования белков в необработанных клетках. *p < 0.05 и ***p < 0.001 – достоверное отличие от контроля (100%) по одновыборочному критерию Стьюдента

 

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Петли I, II, III белка SLURP-2 важны для повышения жизнеспособности кератиноцитов кожи

Петли Ly6/uPAR белков рассматриваются как функциональные эпитопы, отвечающие за активность «трехпетельных» белков [19]. Ранее мы показали, что пептид, имитирующий петлю I белка SLURP-1, воспроизводит противоопухолевую активность полноразмерного белка [15, 16]. В данной работе мы решили выяснить, какие участки молекулы SLURP-2 отвечают за активность белка, а именно за повышение жизнеспособности и стимуляцию миграции кератиноцитов, показанные ранее [17, 18, 21]. Для этого с помощью химического синтеза были получены пептиды, содержащие петлевые участки молекулы SLURP-2 и имитирующие его первую, вторую и третью петли, а также «голову» молекулы (рис. 1).

Исследование влияния SLURP-2 и этих пептидов на жизнеспособность кератиноцитов кожи линии HaCaT показало, что SLURP-2 повышал жизнеспособность кератиноцитов (рис. 2А). При этом пептид «голова» не влиял на жизнеспособность кератиноцитов, в то время как пептиды, имитирующие петли I, II и III, стимулировали жизнеспособность кератиноцитов подобно полноразмерному SLURP-2 (рис. 2А).

Таким образом, петли I, II и III являются важными участками молекулы белка SLURP-2, необходимыми для повышения жизнеспособности и, возможно, пролиферации кератиноцитов. Отсутствие какой-либо активности у пептида, соответствующего «голове» SLURP-2, указывает на то, что этот участок молекулы полноразмерного белка не участвует во взаимодействии с мишенью, отвечающей за стимуляцию жизнеспособности кератиноцитов. Возможно, неактивная «голова» компенсирует повышенную активность петли II, в то время как активность петель I и III схожа с активностью полноразмерного белка. В пользу этого предположения говорит то, что замена аминокислотного остатка R20 на остаток аланина в «голове» молекулы SLURP-2 приводит к стимуляции миграции кератиноцитов [18].

Ранее была предсказана возможность одновременного взаимодействия белка SLURP-1 с разными мишенями: α7-nAChR и рецептором эпидермального фактора роста [15]. Причем взаимодействие со второй мишенью осуществлялось именно с помощью «головы» молекулы SLURP-1. Возможно, похожую ситуацию мы имеем и в случае SLURP-2, когда петля II и «голова» взаимодействуют с разными мишенями, компенсирующими свое влияние на жизнеспособность кератиноцитов. Примечательно, что, в отличие от SLURP-2, эпителиальный белок SLURP-1 не повышает, а понижает жизнеспособность кератиноцитов полости рта Het-1A, а его функциональным участком является петля I [22].

Петля II активирует миграцию кератиноцитов кожи, взаимодействуя с α3β2-nAChR

Ранее было показано, что SLURP-2 усиливает миграцию кератиноцитов Het-1A, взаимодействуя с α7-nAChR [18]. В данной работе мы изучили влияние SLURP-2 и его пептидных миметиков на миграцию кератиноцитов кожи HaCaT. Оказалось, что SLURP-2, петли I, III и «голова» не оказывают заметного влияния на миграцию кератиноцитов HaCaT (рис. 2Б) в модели зарастания «царапины». При этом петля II ускоряла миграцию кератиноцитов на ~30% (рис. 2Б). Вероятно, SLURP-2, взаимодействуя с разными подтипами ацетилхолиновых рецепторов, может как повышать, так и понижать миграцию клеток, и от экспрессии тех или иных рецепторов в конкретных клетках зависит суммарный эффект.

Известно, что SLURP-2 может взаимодействовать с α3, α4, α5, α7, β2 и β4-субъединицами nAChR, а также с mAChR типа M1 и M3 [17]. Чтобы понять, взаимодействием с каким именно рецептором обусловлено стимулирующее действие петли II белка SLURP-2 на миграцию кератиноцитов, был изучен эффект петли II в присутствии ингибиторов различных подтипов ацетилхолиновых рецепторов: неселективного ингибитора mAChR – атропина (Atr), селективного ингибитора α3β2-nAChR – α-конотоксина MII (MII), селективного ингибитора α2β4-nAChR – дигидро-β-эритроидина гидробромида (Dhβe) и селективного ингибитора α7-nAChR – метилликаконитина (MLA). Нами показано, что ингибирование α3β2-nAChR с помощью MII приводит к отмене влияния петли II на миграцию кератиноцитов HaCaT. Совместное применение атропина и Dhβe с петлей II не влияло значимо на миграцию, при этом полученные значения не отличались значимо от эффекта петли II. Полученные данные не позволяют утверждать, вовлечены ли mAChR и α2β4-nAChR в эффект петли II на миграцию (рис. 3А). Таким образом, петля II стимулирует миграцию кератиноцитов кожи, взаимодействуя с α3β2-nAChR и, возможно, с mAChR и α2β4-nAChR. Стоит отметить, что в ранее построенной модели взаимодействия SLURP-2 с α3β2-nAChR петля II была основным участком молекулы SLURP-2, взаимодействующим с этим рецептором и формирующим наибольшее число контактов в комплексе [17]. При этом не наблюдалось значимого влияния ингибиторов других ацетилхолиновых рецепторов на эффект петли II.

Влияние SLURP-2 и петли II на жизнеспособность кератиноцитов кожи обусловлено взаимодействием с α7-nAChR

В данной работе мы также изучили влияние ингибиторов различных подтипов ацетилхолиновых рецепторов (атропин, α-конотоксин MII, Dhβe и MLA) на эффект SLURP-2 и петли II на жизнеспособность кератиноцитов. Показано, что предынкубация клеток с MLA полностью отменяла стимулирующий эффект SLURP-2 и петли II на жизнеспособность клеток HaCaT (рис. 3Б). В то же время ни один из ингибиторов, кроме MLA, не оказывал значимого эффекта на активность SLURP-2 и петли II. При этом атропин, α-конотоксин MII, Dhβe совместно со SLURP-2 и петлей II не приводили к значимому увеличению жизнеспособности относительно контроля, поэтому вовлеченность mAChR, α3β2-nAChR и α2β4-nAChR во влияние SLURP-2 и петли II на жизнеспособность нуждается в дополнительном изучении. Таким образом, способность белка SLURP-2 и пептида «петля II» повышать жизнеспособность кератиноцитов обусловлена взаимодействием с α7-nAChR и, вероятно, с mAChR, α3β2-nAChR и α2β4-nAChR.

Однако ранее было показано, что SLURP-2 повышает жизнеспособность кератиноцитов полости рта Het-1A, взаимодействуя с α3β2-nAChR, но не с α7-nAChR [17]. Участие различных рецепторов в регуляции активности SLURP-2 в кератиноцитах полости рта и кожи может быть связано с различным профилем экспрессии тех или иных рецепторов в различных клетках и тканях организма и лежит в рамках «полигамной» активности эпителиального белка, способного взаимодействовать с различными ацетилхолиновыми рецепторами [17].

Влияние SLURP-2 и петли II на жизнеспособность и миграцию кератиноцитов кожи не связано с изменением экспрессии интегринов и транскрипционных факторов SNAI1 и SNAI2

Известно, что интегрины регулируют процессы адгезии, миграции и пролиферации клеток эпителия, в том числе кератиноцитов кожи [23, 24]. Также в число факторов, регулирующих миграцию и дифференцировку кератиноцитов, входят факторы транскрипции SNAI1 и SNAI2 [25]. Мы предположили, что влияние SLURP-2 и петли II на жизнеспособность и миграцию может быть обусловлено влиянием на экспрессию интегринов или факторов транскрипции SNAI. Однако мы не обнаружили какого-либо значимого изменения в экспрессии генов ITGA1, ITGA2, ITGΑ3, ITGA5, ITGA6, ITGA9, ITGB1, ITGB3 и SNAI1 и SNAI2 в кератиноцитах HaCaT после инкубации с SLURP-2 или петлей II в течение 24 ч относительно контроля (необработанные клетки, рис. 4). Таким образом, эффекты SLURP-2 и петли II на жизнеспособность и миграцию кератиноцитов HaCaT не связаны с изменением экспрессии генов, кодирующих интегрины и факторы транскрипции SNAI1 и SNAI2.

Эффекты SLURP-2 и петли II в кератиноцитах кожи обусловлены подавлением активности сигнальных путей p38 MAPK и mTOR

Ранее было показано, что белок SLURP-1 ингибирует в опухолевых клетках активность внутриклеточных сигнальных каскадов, связанных с AKT, фосфатазой PTEN и протеинкиназой mTOR [15]. Мы предположили, что эффекты SLURP-2 и петли II также могут быть связаны с регуляцией внутриклеточных сигнальных каскадов, связанных с пролиферацией и миграцией. Кроме того, мы исследовали влияние SLURP-2 и петли II на активность транскрипционных факторов STAT3 и NF-kB, участвующих в контроле генной экспрессии в эпителиальных клетках и связанных с активацией α7-nAChR [26–29]. С помощью анализа на магнитных частицах Bioplex мы показали, что и SLURP-2, и пептид «петля II» подавляют фосфорилирование и, следовательно, активацию киназы p38 MAPK в кератиноцитах HaCaT после 24-часовой инкубации (рис. 5). Кроме того, SLURP-2, но не петля II, снижал фосфорилирование киназы mTOR в кератиноцитах HaCaT (рис. 5).

Известно, что активация p38 MAPK может приводить к апоптозу кератиноцитов и, как следствие, к снижению числа жизнеспособных клеток [30, 31]. В то же время активация α7-nAChR ингибирует фосфорилирование и активацию p38 MAPK [32]. Ранее было показано, что SLURP-2 в концентрации 100 нМ потенцирует α7-nAChR в присутствии ацетилхолина [17]. Таким образом, мы можем предположить, что в кератиноцитах HaCaT в присутствии 100 нМ SLURP-2 происходит потенцирование α7-nAChR, что в свою очередь приводит к подавлению сигнального пути p38 MAPK и увеличению числа жизнеспособных клеток. С этим предположением согласуется предложенная ранее модель взаимодействия SLURP-2 с α7-nAChR, в которой петля II молекулы SLURP-2 взаимодействует именно с открытым (активным) состоянием α7-nAChR [17]. Это также указывает на связь активации этого рецептора с подавлением сигнального пути p38 MAPK с препятствием апоптозу кератиноцитов HaCaT и увеличением числа жизнеспособных клеток в присутствии петли II.

Стоит заметить, что ингибирование фосфорилирования mTOR может приводить к подавлению миграции кератиноцитов [33]. Однако мы не обнаружили какого-либо значимого эффекта SLURP-2 на миграцию (рис. 2Б). При этом петля II стимулирует миграцию, взаимодействуя с α3β2-nAChR (рис. 3), и не ингибирует сигнальный внутриклеточный каскад, ассоциированный с mTOR (рис. 5). Возможно, в ингибировании фосфорилирования mTOR участвуют другие участки молекулы SLURP-2 (не петля II), при этом вносящие отрицательный вклад в стимуляцию миграции полноразмерным белком.

Ранее было показано, что инкубация кератиноцитов полости рта Het-1A в присутствии SLURP-1 приводила к активации транскрипционного фактора NF-kB [34]. При этом известно, что SLURP-1 является негативным модулятором α7-nAChR [35]. Таким образом, отсутствие потенцирующего эффекта на фосфорилирование NF-kB в присутствии как SLURP-2, так и петли II поддерживает наше предположение, что обе эти молекулы потенцируют α7-nAChR в исследуемой концентрации в кератиноцитах HaCaT, и находится в согласии с подавлением сигнального пути p38 MAPK (рис. 5).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В данной работе получены синтетические пептиды, соответствующие петлевым фрагментам белка SLURP-2: пептиды «голова», «петля I», «петля II» и «петля III», изучено их влияние на жизнеспособность и миграцию кератиноцитов кожи. Пептид «голова» не влиял ни на жизнеспособность, ни на миграцию кератиноцитов. Пептиды «петля I» и «петля III» повышали жизнеспособность и не влияли на миграцию кератиноцитов. Наиболее активным оказался пептид, соответствующий петле II. Он стимулировал как жизнеспособность кератиноцитов, взаимодействуя с α7-nAChR, так и их миграцию, взаимодействуя с α3β2-nAChR. При этом сам белок SLURP-2 повышал только жизнеспособность кератиноцитов и не влиял на их миграцию. Различия во влиянии SLURP-2 и петли II на жизнеспособность и миграцию кератиноцитов HaCaT, вероятно, связаны с возможностью полноразмерного белка взаимодействовать одновременно с несколькими мишенями и ингибированием фосфорилирования mTOR, что не наблюдается в случае петли II. Таким образом, получены новые знания о регуляции гомеостаза эпителиальных клеток эпителиальным белком SLURP-2 человека. Полученные данные указывают на перспективность дальнейших исследований свойств петли II и рассмотрения ее в качестве прототипа для разработки новых ранозаживляющих препаратов.

Работа выполнена при финансовой поддержке Российского научного фонда (проект № 23-24-00636).

Авторы благодарят Ирину Чулину за помощь с химическим синтезом исследованных пептидов. М.П. Кирпичников и Е.Н. Люкманова входят в состав инновационной группы по разработке лекарственных препаратов на основе структурной биологии и биоинформатики в Шэньчжэньском университете МГУ-ППИ (#2022KCXTD034).

Об авторах

О. В. Шлепова

Государственный научный центр Российской Федерации Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН

Email: lyukmanova_ekaterina@smbu.edu.cn
Россия, Москва, 117997

Т. Я. Горностаева

Государственный научный центр Российской Федерации Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН; Московский центр перспективных исследований

Email: lyukmanova_ekaterina@smbu.edu.cn
Россия, Москва, 117997; Москва, 123592

И. Д. Кукушкин

Государственный научный центр Российской Федерации Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН; Московский центр перспективных исследований

Email: lyukmanova_ekaterina@smbu.edu.cn
Россия, Москва, 117997; Москва, 123592

В. Н. Азев

Филиал Института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН

Email: lyukmanova_ekaterina@smbu.edu.cn
Россия, Пущино, 142290

М. Л. Бычков

Государственный научный центр Российской Федерации Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН

Email: lyukmanova_ekaterina@smbu.edu.cn
Россия, Москва, 117997

З. О. Шенкарев

Государственный научный центр Российской Федерации Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН; Московский центр перспективных исследований

Email: lyukmanova_ekaterina@smbu.edu.cn
Россия, Москва, 117997; Москва, 123592

М. П. Кирпичников

Государственный научный центр Российской Федерации Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН; Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова

Email: lyukmanova_ekaterina@smbu.edu.cn

Междисциплинарная научно-образовательная школа «Молекулярные технологии живых систем и синтетическая биология», биологический факультет

Россия, Москва, 117997; Москва, 119234

Е. Н. Люкманова

Государственный научный центр Российской Федерации Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН; Московский центр перспективных исследований; Шеньчжэньский МГУ-ППИ университет; Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова

Автор, ответственный за переписку.
Email: lyukmanova_ekaterina@smbu.edu.cn

Междисциплинарная научно-образовательная школа «Молекулярные технологии живых систем и синтетическая биология», биологический факультет

Россия, Москва, 117997; Москва, 123592; провинция Гуандун, Шэньчжэнь, р-он Лунган, Даюньсиньчэн, 518172 Китай; Москва, 119234

Список литературы

Дополнительные файлы