Genome Characterization of Two Novel  Lactococcus lactis  Phages vL_296 and vL_20A

T. A. Chuksina; Чуксина Т. А.; A. A. Fatkulin; Фаткулин А. А.; N. P. Sorokina; Сорокина Н. П.; I. T. Smykov; Смыков И. Т.; E. V. Kuraeva; Кураева Е. В.; E. S. Masezhnaya; Масежная Е. С.; K. A. Smagina; Смагина К. А.; M. Yu. Shkurnikov; Шкурников М. Ю.

doi:10.32607/actanaturae.27468

Характеристика генома двух новых фагов Lactococcus lactis phage vL_296 и vL_20A

Авторы: Чуксина Т.А.¹, Фаткулин А.А.¹, Сорокина Н.П.², Смыков И.Т.², Кураева Е.В.², Масежная Е.С.², Смагина К.А.², Шкурников М.Ю.¹
Учреждения:
1. Высшая школа экономики, факультет биологии и биотехнологии
2. ФНЦ пищевых систем им. В.М. Горбатова РАН
Выпуск: Том 16, № 3 (2024)
Страницы: 102-109
Раздел: Экспериментальные статьи
Дата подачи: 29.07.2024
Дата принятия к публикации: 17.09.2024
Дата публикации: 12.11.2024
URL: https://actanaturae.ru/2075-8251/article/view/27468
DOI: https://doi.org/10.32607/actanaturae.27468
ID: 27468

Цитировать

Полный текст

Аннотация
Полный текст
Об авторах
Список литературы
Дополнительные файлы
Статистика

Аннотация

Производство ферментированных молочных продуктов основано на использовании заквасочных культур, которые сквашивают молоко с образованием продукта с определенной текстурой, ароматом и вкусом. Однако используемые в производстве молочнокислые бактерии подвержены инфицированию бактериофагами. Изучали геномы двух бактериофагов, выделенных из подсырной сыворотки при производстве сыров. Определили видовую принадлежность и литический спектр этих бактериофагов. Фаги vL_20А и vL_296, выделенные с использованием индикаторных культур лактококков, обладают уникальными литическими спектрами: только четыре бактерии-хозяина из 21 возможной выявленной у них общие. Геномы vL_20A и vL_296 состоят из линейной ДНК длиной 21909 и 22667 п.н. соответственно. Наиболее похожим на фаги vL_20A и vL_296 оказался Lactococcus phage bIL67 (ANI 93.3 и 92.6 соответственно). Анализ спейсеров CRISPR в геномах заквасочных культур не выявил среди них специфичных к фагам vL_20A и vL_296. Это исследование подчеркивает биоразнообразие фагов L. lactis, а также широкое присутствие фагов на молочных заводах и их вирулентность. Однако вирулентность фагов уравновешивается наличием в ряде заквасочных культур значительного количества штаммов бактерий, обладающих благодаря системе CRISPR-Cas различной чувствительностью к фагам.

Ключевые слова

Бактериофаг, CRISPR-Cas, сыроделие, заквасочные культуры, единое здоровье

Полный текст

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

R-M – система рестрикции-модификации; Abi – система абортирования фаговой инфекции.

ВВЕДЕНИЕ

Производство ферментированных молочных продуктов, таких, как сыры и йогурты, основано на использовании заквасочных культур, которые сквашивают молоко, создавая продукт с определенной текстурой, ароматом и вкусом [1]. Однако молочнокислые бактерии, которые используются в производстве, подвержены инфицированию бактериофагами [2]. Молочные предприятия являются специфичной обособленной экологической нишей для бактериофагов молочнокислых бактерий, поскольку лактобактерии всегда присутствуют в сыром молоке и вносятся в пастеризованное молоко в виде бактериальных заквасок [3].

Высокий уровень молочнокислого брожения предотвращает размножение в молоке посторонних и патогенных микроорганизмов, не уничтоженных при пастеризации или попавших в молоко после пастеризации, а также определяет популяционные характеристики микробиома молочных продуктов за счет повышения кислотности и специфического антагонизма в отношении немолочнокислых бактерий. Развитие бактериофагов может негативно влиять на ферментацию и рост бактериальных культур [1]. Если фаги атакуют заквасочную культуру, то процесс сквашивания может замедлиться или даже остановиться. В результате возникает риск развития патогенной микрофлоры и появления пороков вкуса, аромата и текстуры [4].

В состав заквасок для большого числа кисломолочных продуктов и сыров входят лактококки (Lactococcus lactis sps., L. cremoris). Поэтому в молочной промышленности широко распространены бактериофаги, лизирующие лактококки. Наиболее уязвимым для фаговых атак является сыроделие. Это обусловлено тем, что при производстве сыров используется самый мягкий режим пастеризации молока (72–76^оС, 20–25 с) и часть популяции бактериофагов, находящихся в сыром молоке, не уничтожается. Кроме того, сыворотка, образующаяся в производстве сыров, практически всегда содержит значительные количества вирионов и служит источником распространения бактериофагов, которые обнаруживаются на различных объектах, в том числе в производственной закваске, на оборудовании, санитарной одежде и открытых частях тела работников [5]. После сообщения о лактококковых бактериофагах в 1930-е годы [6] и дальнейших многочисленных исследований этого явления фаголизис считается одной из постоянных и трудно устранимых проблем с молочнокислым брожением в молочной отрасли.

Для защиты молочнокислых бактерий от бактериофагов используют фагоустойчивые штаммы молочнокислых бактерий и систематически меняют партии заквасок [7]. Это обуславливает целесообразность изучения фагоустойчивости и фаготипа коллекционных культур лактококков. Эффективность отбора фагоустойчивых культур лактококков в значительной степени зависит от набора используемых фагов и спектра их литического действия. Это свидетельствует о необходимости систематического определения фагового фона на предприятиях молочной промышленности. Рассмотрение проблемы бактериофагии интересно также с позиции концепции «Единое здоровье», подразумевающей комплексный единый подход, направленный на устойчивое балансирование и оптимизацию здоровья людей, животных и экосистем, в том числе экосистемы молочных предприятий.

Бактериофаги – это самые распространенные вирусы на Земле. Считается, что большинство свободноживущих бактерий заражено фагами. Об этом свидетельствует присутствие профагов в подавляющем большинстве геномов бактерий [8, 9]. Бактерии выработали множество механизмов защиты от бактериофагов, которые можно назвать «прокариотической иммунной системой» [10]. Эти системы можно разделить на врожденную и адаптивную «прокариотическую иммунную систему» [11]. Классическими примерами врожденного иммунитета являются системы рестрикции-модификации (R-M) [12] или абортирования фаговой инфекции (Abi) [13]. Однако недавно было открыто множество дополнительных врожденных иммунных механизмов, подчеркивающих сильное избирательное давление, оказываемое фагами на микробные сообщества [14, 15].

Единственной «адаптивной» иммунной системой, известной на сегодняшний день, является система CRISPR-Cas. Она позволяет бактериям включать короткие фрагменты фаговой ДНК в специальные матрицы CRISPR. При встрече с фагом транскрибированные спейсеры связываются с ДНК фага и направляют ее на деградацию с помощью белков Cas [16].

Мы изучали геномы двух новых видов бактериофагов, выделенных при производстве сыров. Определена видовая принадлежность и литический спектр этих фагов, проанализированы возможные механизмы вирулентности и их чувствительность к системе CRISPR-Cas основных заквасочных культур.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Выделение и очистка бактериофагов

В работе использовали бактериальные штаммы и бактериофаги из Коллекции молочнокислых бактерий для производства сыров и бактериофагов к ним (ВНИИМС – филиал ФГБНУ «ФНЦ пищевых систем им. В.М. Горбатова» РАН).

Бактериофаги были выделены из образцов подсырной сыворотки. Бактериофаг vL_20А выделен из сыворотки, полученной при изготовлении полутвердого сыра на Переславском сыродельном заводе (Ярославская область) 01.06.1985 года, и размножен на чувствительной культуре L. lactis subsp. lactis 393-8. Бактериофаг vL_296 выделен из сыворотки, полученной при изготовлении полутвердого сыра на Юговском комбинате молочных продуктов (Пермский край) 07.06.2022 года, и размножен на чувствительной культуре L. lactis subsp. lactis 345-8.

Чувствительную культуру выращивали на среде М17 c лактозой (HiMedia, Индия). Образцы сыворотки фильтровали через стерильный фильтр с размером пор 0.45 мкм.

Бактериофаги выделяли с использованием метода поверхностного посева: на чашки Петри с подсушенной твердой средой М17 (1.5% агара) наносили 0.1 мл культуры L. lactis subsp. lactis в фазе логарифмического роста, растирали стеклянным шпателем и оставляли на 10–15 мин для впитывания влаги в агар. Затем на чашку наносили каплю отфильтрованной сыворотки, закрывали крышкой и оставляли на 10–15 мин при комнатной температуре. После чего чашки переворачивали и термостатировали в течение 16–18 ч при температуре 30 ± 1°С. При наличии зон лизиса в месте нанесения сыворотки кусочек агара из зоны лизиса помещали в пробирку с 3 мл среды М17, тщательно взбалтывали и выдерживали в течение 24 ч при температуре 4 ± 2°С для более полного выхода частиц фага из агара. Затем каплю среды из пробирки наносили на свежий газон культуры и термостатировали в течение 16–18 ч. Для получения чистого бактериофага выделенные смеси бактериофагов титровали методом двухслойного агара: по 0.1 мл культуры и 0.1 мл десятикратных разведений смеси фагов вносили в пробирки с 3 см³ полужидкого агара М17 (0.6% агара) и выливали суспензию в чашку с плотной средой. Инкубировали в течение 18–24 ч при температуре 30 ± 1°С. Кусочки агара из отдельных негативных колоний (бляшек) использовали для накопления фагов в жидкой среде с чувствительной культурой. Полученные культуры бактериофагов фильтровали через стерильный фильтр с размером пор 0.22 мкм и хранили при температуре 4 ± 2°С.

Определение литического спектра

Спектр литической активности фагов в отношении 35 штаммов L. lactis subsp. lactis, 35 штаммов L. cremoris и 35 штаммов L. lactis subsp. lactis biovar. diacetylactis определяли методом культивирования на двухслойном агаре в культуральных планшетах [17]. О чувствительности лактококков к бактериофагам судили по наличию или отсутствию зоны просветления в месте нанесения фага.

Электронная микроскопия

Отобранные образцы фагов фиксировали при комнатной температуре 1.5% раствором глутаральдегида в 0.1 М фосфатном буфере Sorenson, рН 7.2, в течение 20 мин. После чего 5 мкл образца переносили на поддерживающую медную сетку (mesh-400), покрытую пленкой нитроцеллюлозы (parlodium), и выдерживали в течение 2 мин для осаждения дисперсных частиц на поверхность пленки. Контрастность образца повышали с помощью негативного контрастирования [18, 19]. Для этого пипеткой переносили каплю (2 мкл) 2% раствора уранилацетата на каплю зафиксированного образца, находящуюся на сетке, и выдерживали в течение 4 мин. После этого излишки раствора убирали с поверхности сетки фильтровальной бумагой и помещали в вакуумную камеру для окончательной сушки при комнатной температуре.

Морфологию бактериофагов изучали с помощью трансмиссионного электронного микроскопа EM-410 (Philips, Нидерланды) при напряжении 40 кВ. Изображения получены на пленке Fujicolor C-200 (FUJIFILM Corporation, TOKYO 106-8620, Япония).

Выделение ДНК-фагов и секвенирование

К образцам лизата бактерий добавляли раствор для осаждения (4% PEG-6000, 1 моль/л NaCl). Инкубировали при температуре 4°C в течение 3 ч. После инкубации пробирки центрифугировали в течение 15 мин при 12 000 g при 4°C. Супернатант отбирали, а осадок ресуспендировали в 180 мкл PBS. Затем к образцам добавляли 1.25 мкл протеиназы К (20 мг/мл) и инкубировали при 56°C в течение 1.5 ч, избегая встряхивания. ДНК выделяли с помощью набора QiaAmp Viral DNA (Qiagen, ФРГ) по протоколу производителя. Концентрацию и качество ДНК оценивали с использованием Nanodrop и Qubit.

Библиотеки ДНК готовили с помощью NEBNext® Ultra™ II DNA Library Prep Kit for Illumina® (New England BioLabs, США) согласно протоколу производителя. Секвенирование полученных библиотек осуществляли на секвенаторе NovaSeq 6000 (Illumina, США) в режиме парных прочтений 2 × 150 п.н.

Анализ результатов секвенирования

Качество сырых прочтений оценивали с использованием программы FastQC 0.12.1. Затем прочтения предобрабатывали с помощью fastp 0.23.2. Дополнительно проводили таксономическую классификацию прочтений с использованием стандартной базы данных Kraken 2. Сборку геномов выполняли с использованием SPAdes 4.0.0. Бактериальные геномы получены с применением флага «-- isolate», в то время как для сборки вирусных геномов использовали опцию «--metaviral». Качество сборок оценивали с помощью программы QUAST 5.2.0.

Вирусные геномы затем были валидированы с использованием CheckV 1.0.1. Предварительная таксономическая идентификация фагов выполнена с помощью BLAST. Полные геномы вирусов, относящихся к виду Lactococcus phage, получены из базы данных Nucleotide NCBI, после чего pyANI 0.2.12 использовали для оценки средней идентичности нуклеотидов (ANI) методом ANIb. Геномы бактериофагов были переориентированы с помощью dnaapler 0.7.0 и далее аннотированы с использованием Pharokka 1.7.3. clinker 0.0.29 для построения сравнительной визуализации геномов.

При анализе спейсеров CRISPR изучили 562 генома заквасочных культур родов Lacticaseibacillus casei, Lacticaseibacillus paracasei, Lacticaseibacillus rhamnosus, Lactiplantibacillus plantarum, Lactobacillus helveticus, Propionibacterium freudenreichii из базы данных NCBI GenBank [20]. Наличие систем иммунитета в бактериальных геномах определяли с помощью MinCED 0.4.2 и PADLOC 2.0.0.

Размещение данных

Полногеномные последовательности фагов vL_20A и vL_296 размещены в репозитории GenBank под номерами PQ062249 и PQ062250.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Выделение и морфологическая характеристика фагов

Рис. 1. Микрофотографии фагов L. lactis phage vL_20A (А) и L. lactis phage vL_296 (Б)

Фаги vL_20А и vL_296 были выделены из подсырной сыворотки с использованием индикаторных культур лактококков L. lactis subsp. lactis 393-8 и L. lactis subsp. lactis 345-8 в качестве бактерий-хозяев. Просвечивающая электронная микроскопия (рис. 1) показала, что фаг vL_20А имеет икосаэдрическую головку диаметром 39 ± 3 нм, хвост длиной 107 ± 6 нм. В свою очередь фаг vL_296 имеет икосаэдрическую головку диаметром 45 ± 4 нм и хвост длиной 125 ± 8 нм. Данная морфология указывает на сходство с каудовиридами (Caudoviricetes). Согласно Международному кодексу классификации и номенклатуры вирусов [21], эти фаги обозначены как L. lactis phage vL_20A и L. lactis phage vL_296 (Viruses; Duplodnaviria; Heunggongvirae; Uroviricota; Caudoviricetes; Ceduovirus; Ceduovirus vL_20A and vL_296).

Литический спектр

Литический спектр фагов определяли в зависимости от наличия или отсутствия образования зоны просветления (рис. 2). Четыре штамма L. cremoris были лизированы фагом vL_20A и восемь – vL_296. Литическая активность в отношении L. cremoris составила 11.8% (4/34) для vL_20A и 22.9% (8/35) для vL_296. Литичеcкая активность в отношении L. lactis subsp. lactis составила 5.7% (2/35) и 14.3% (5/35) соответственно.

Рис. 2. Литический спектр фагов vL_20A и vL_296. Синий – наличие негативных колоний, белый – отсутствие негативных колоний, серый – не анализировали

Литическая активность фагов vL_20A и vL_296 в отношении L. lactis subsp. lactis biovar. diacetylactis находилась на уровне 5.7% (2/35) и 14.3% (4/28) соответственно. Можно отметить, что фаги vL_20A и vL_296 обладают уникальными литическими спектрами. Из 21 выявленной бактерии-хозяине общими были только четыре (L. cremoris Т4-39, L. cremoris 591-4-7, L. cremoris T5-1, L. lactis subsp. lactis 85-10).

Анализ генома

Полные последовательности геномов vL_20A и vL_296 получены с использованием платформы Illumina NovaSeq 6000. Их геномы состояли из линейной ДНК длиной 21 909 п.н. (GC 35.75%) и 22667 п.н. (GC 35.89%) соответственно. Предсказано 47 открытых рамок считывания (ORF) у vL_20A и 43 ORF у vL_296, из которых 11 были похожи на гены, кодирующие известные функциональные белки (рис. 3), в то время как остальные ORF кодируют предполагаемые белки.

Рис. 3. Визуализация известных функциональных белков, кодируемых в геноме фагов L. lactis phage vL_20A (А) и L. lactis phage vL_296 (Б)

По функциональной активности все предсказанные белки были разделены на четыре группы (рис. 3): белки метаболизма ДНК (по две ORF), белки упаковки и формирования головки (по пять ORF), белки лизиса (по две ORF) и белки хвоста (по две ORF). Остальные ORF предположительно кодируют белки с неизвестной функцией. Поиск в базах данных VFDB и CARD не выявил генов вирулентности или устойчивости к антибиотикам.

Сравнительный анализ генома

Основным критерием при определении вида вируса была идентичность последовательности генома менее чем на 95% с остальными представителями рода [21]. Чтобы определить геномное сходство vL_20A и vL_296 с другими фагами, сначала провели BLASTn-поиск в NCBI. Геномы вирусов семейства L. phage получили из базы данных Nucleotide NCBI и оценили среднюю идентичность нуклеотидов (ANI).

Рис. 4. Тепловая диаграмма ANI L. lactis phage vL_20A и L. lactis phage vL_296 и восьми наиболее гомологичных фагов L. lactis

Рис. 5. Схема строения и гомологии геномов фагов L. phage bIL67, L. lactis phage vL_20A и L. lactis phage vL_296

На рис. 4 представлены результаты оценки ANI геномов 10 наиболее генетически близких фагов из 254 проанализированных. Наиболее сходным с фагами vL_20A и vL_296 был L. phage bIL67 (ANI 93.3 и 92.6 соответственно). Необходимо отметить, что значение ANI при сравнении vL_20A и vL_296 было меньше, чем для вида L. phage bIL67 и составляет 92.5 (рис. 5). Можно предположить, что vL_20A и vL_296 являются представителями отдельных видов, не описанных ранее.

Рис. 6. Выравнивание аминокислотных последовательностей главного белка хвоста в геномах vL_20A и vL_296

ANI между двумя фагами составляет лишь 92.5. Сравнение геномов vL_20A и vL_296 выявило большое количество полиморфизмов в главном белке хвоста (major tail protein), который участвует в связывании фага с клеткой-хозяином (рис. 6). Кроме того, различия в нуклеотидной последовательности фагов предположительно могут отразиться на эффективности механизмов защиты бактериальной клетки, направленных на деградацию генома вируса.

Анализ CRISPR-спейсеров молочнокислых бактерий

Бактерии обладают средствами защиты от чужеродных захватчиков, включая широко распространенную систему CRISPR-Cas. Спейсеры CRISPR участвуют в адаптивном иммунитете, обеспечивая комплементарное связывание РНК с нуклеиновыми кислотами чужеродных элементов и последующее разрушение их белками Cas. Эту систему содержит подавляющее большинство заквасочных культур бактерий (рис. 7).

Рис. 7. Системы иммунитета молочнокислых бактерий. В ячейках указана частота встречаемости механизма иммунитета у представителей заквасочных культур. В названии рода указано число проанализированных геномов

Мы проанализировали наличие спейсеров, специфичных к фагам vL_20A и vL_296, в геномах заквасочных культур. Среди 562 проанализированных геномов заквасочных бактерий не удалось выявить ни одного спейсера, специфичного к фагам vL_20A и vL_296. Можно предположить, что выявленные нами новые виды фагов не контактировали длительное время с проанализированными заквасочными культурами.

ОБСУЖДЕНИЕ

Фаговые атаки на кислотообразующую микрофлору сыров чрезвычайно опасны с точки зрения безопасности продукции, поскольку представляют угрозу интенсивного развития остаточной постпастеризационной микрофлоры. Для снижения риска выпуска недоброкачественной и опасной для здоровья потребителей продукции большое значение имеет ограничение репродукции бактериофагов путем использования многоштаммовых заквасок, их систематической ротации и включением в состав заквасочной микрофлоры фагорезистентных культур.

Подбор фагорезистентных штаммов, входящих в состав заквасок, требует изучения разнообразия и свойств фагов, способных заражать заквасочные культуры. В частности, описанные нами фаги были выделены из подсырной сыворотки с интервалом в 37 лет и вызывали проблемы ферментации сырья. Это свидетельствует о том, что фаги и чувствительные к ним штаммы бактерий сохраняются в заквасочных культурах как показано ранее [22]. Учитывая, что уровень сходства ANI у вновь выделенных фагов был значительно ниже 95, можно предположить, что нами впервые описаны два новых вида фагов.

Наиболее генетически близким к этим фагам является вид L. phage biL67 [23]. Нами установлено, что геномы новых фагов L. lactis phage vL_20A и L. lactis phage vL_296 представляют собой линейную ДНК длиной 21 909 и 22 667 п.н. соответственно. В геномах vL_20A и vL_296 можно выделить 47 и 43 ORF, из которых 11 похожи на гены белков с известной функциональной активностью.

Литический спектр фагов довольно узкий и практически не перекрывается. Можно выделить только четыре общих штамма бактерий-хозяев: L. cremoris Т4-39, L. cremoris 591-4-7, L. cremoris T5-1 и L. lactis subsp. lactis 85-10. Эти данные отличаются от результатов, полученных Stuer-Lauridsen и соавт., где большинство изученных фагов L. lactis были способны лизировать 10–90% штаммов [24]. Это можно объяснить различиями в источниках молочных продуктов, из которых были выделены фаги.

В CRISPR-кассетах заквасочных бактерий не удалось выявить ни одного спейсера, специфичного для фагов vL_20A и vL_296. Можно предположить, что выявленные нами новые виды фагов не контактировали длительное время с проанализированными заквасочными культурами. Тем не менее в геномах многих культур обнаружены системы CRISPR/Cas типа 1 и 2, что позволяет ожидать формирование у них иммунитета при встрече с данными фагами.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В текущих условиях мировой обстановки необходимо переходить к устойчивым, инклюзивным и независимым от внешних факторов агропродовольственным системам. Этого можно достичь, рассматривая пищевую систему как непрерывную и взаимосвязанную цепочку, в которой отслеживаются и контролируются риски на каждом этапе: от выращивания сырья до производства продукции, от состояния производственной среды до качества и безопасности готового продукта. В этой цепочке «фаговое здоровье производства» можно рассматривать как основную причину нарушений устойчивости при производстве кисломолочных продуктов.

Это исследование подчеркивает биоразнообразие фагов L. lactis, выделенных из подсырной сыворотки. Оно также подтвердило, что фаги широко распространены на молочных заводах и их вирулентность. Однако присутствие в заквасках штаммов бактерий с различной степенью чувствительности к фагам уравновешивает эту опасность за счет систем бактериального иммунитета.

Высокий уровень устойчивости заквасочных штаммов к фаговой инфекции может препятствовать массовому размножению фагов в многокомпонентных заквасочных культурах и объяснять то, почему фаги обнаруживаются в ферментированных молочных продуктах без проблем с подкислением. Однако иногда одновременное присутствие различных фагов, активных против большей части штаммов в пределах одной заквасочной культуры, может привести к получению дефектного продукта [7]. Необходимы дополнительные исследования для лучшего понимания экологической роли фагов и оценки их влияния на процесс ферментации. Обилие бактериофагов на молочных предприятиях, инфицирующих закваски, еще раз подчеркивает важность разработки стратегий борьбы с фагами в молочной промышленности.

Исследование выполнено за счет гранта Министерства науки и высшего образования Российской Федерации на проведение крупных научных проектов по приоритетным направлениям научно-технологического развития (проект № 075-15-2024-483).

Об авторах

Т. А. Чуксина

Высшая школа экономики, факультет биологии и биотехнологии

Email: mshkurnikov@hse.ru
Россия, Москва, 101000