Особенности фосфорилирования бета-амилоида при болезни Альцгеймера

Полный текст

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

БА – болезнь Альцгеймера; Аβ – бета-амилоидные пептиды; Aβ_1–42 – пептид из 42 аминокислотных остатков; ПТМ – посттрансляционные модификации; pSer8-Aβ – фосфорилированная по серину-8 протеоформа Aβ; СМЖ – спинномозговая жидкость; APP – белок-предшественник амилоида; ТФЭ – твердофазная экстракция; МК – муравьиная кислота; ИП – иммунопреципитация; ПСА – персульфат аммония; БСА – бычий сывороточный альбумин; ВЭЖХ-МС – высокоэффективная жидкостная хроматография-масс-спектрометрия; PASEF – параллельное накопление и последовательная фрагментация.

ВВЕДЕНИЕ

Болезнь Альцгеймера (БА) составляет 60–80% всех случаев деменции, а риск ее развития особенно высок у людей пожилого возраста [1]. Количество пациентов с БА существенно увеличивается с каждым годом и может достичь 115 млн к 2050 г. [2]. Патогенез БА тесно связан с гомеостазом бета-амилоидных пептидов (Aβ) в мозге [3], именно амилоидные отложения являются общепризнанными маркерами БА. Несмотря на более чем 30-летнюю историю исследований [4, 5], выяснение детальных аспектов молекулярных механизмов амилоидоза не теряет своей актуальности, поскольку влияние на амилоидоз представляется наиболее очевидной стратегией в поиске эффективных средств терапевтического воздействия при БА [6–8].

Полноразмерные формы Aβ-пептидов (Aβ_1–40 и Aβ_1–42) имеют важные физиологические функции, которые могут отличаться в разных тканях организма, где эти пептиды образуются из различных изоформ белка-предшественника амилоида (АРР) при участии β- и γ-секретаз [9, 10]. Эти пептиды играют важную роль в регуляции ангио- и нейрогенеза, а также снижают проницаемость гематоэнцефалического барьера (ГЭБ) и способствуют посттравматическому восстановлению мозга [11]. Важной особенностью Aβ-пептидов является их способность к агрегации с образованием кросс-β-структур [12]. Дисбаланс между образованием полноразмерных форм Аβ и их своевременной деградацией может способствовать образованию модифицированных протеоформ, формирующих нейротоксичные олигомеры и агрегаты [3, 13]. В частности, задержка деградации полноразмерных Аβ-пептидов ведет к накоплению усеченных протеоформ [14–17] и появлению посттрансляционных модификаций (ПТМ), которые стабилизируют агрегаты Аβ и способствуют их дальнейшему росту. Примечательно, что подавляющее большинство описанных модификаций сосредоточено в цинксвязывающем домене и относится к шести полярным аминокислотным остаткам в N-концевом участке 1–11 [17], а присутствие в амилоидных бляшках мозга характерных укороченных с N-конца пептидов согласуется с повышенной скоростью модификации этого участка [15].

В целом, pyro-Glu3, pyro-Glu11, isoAsp1 и isoAsp7 являются наиболее распространенными ПТМ Aβ-пептидов [14, 18–23], которые могут способствовать их повышенной агрегации и стабилизации сенильных бляшек при БА. В частности, оценка динамики накопления разных ПТМ в амилоидных отложениях в мозге мышей линии 5xFAD, моделирующих БА, показала, что накопление pyro-Glu3-Аβ у этих мышей начинается с самого раннего возраста и к 8 месяцам уже выходит на плато, тогда как изомеризация Asp7 в 7-месячном возрасте составляет лишь 8% и достигает своего максимума (~30%) к концу жизненного цикла, но так и не выходит на насыщение [24].

Фосфорилирование Ser8 – это еще одна ПТМ N-концевого участка Aβ, которая может играть важную роль в патогенезе БА. В частности, образование pSer8-Aβ, происходящее при участии протеинкиназ во внеклеточном пространстве и на поверхности клеток мозга [25], коррелирует с проявлением симптомов БА и затрудняет деградацию Aβ при участии инсулиндеградирующих и ангиотензинпревращающих ферментов [26]. Иммуногистохимический анализ образцов неокортекса позволил выявить взаимосвязь между фосфорилированием Aβ по Ser8 и его агрегацией в диспергируемые олигомеры, протофибриллы и фибриллы при симптоматической БА, но не на доклинической стадии [27]. При использовании синтетических полноразмерных пептидов pSer8-Aβ_1-42 наблюдали стремительное образование стабильных фибриллярных агрегатов и нейротоксичных олигомеров в отсутствие ионов цинка [28, 29]. Кроме того, обнаружена возможность образования агрегатов с повышенной нейротоксичностью в результате взаимодействия pSer8-Aβ_1-42 с немодифицированными Aβ_1-42 [30]. Структурный ЯМР-анализ дополнительно выявил более высокую эффективность амилоидной амплификации и повышенную термодинамическую стабильность фибрилл pSer8-Aβ_1-40 в сравнении с фибриллами нефосфорилированного пептида [31]. С другой стороны, как полноразмерный pSer8-Aβ_1-42, так и его цинксвязывающий фрагмент pSer8-Aβ_1-16 существенно снижают in vitro агрегацию Aβ, индуцированную ионами цинка [32–34], а инъекции pSer8-Aβ_1-42 уменьшают образование амилоидных бляшек в гиппокампе мышей [34]. По всей видимости, возможна реализация обоих сценариев, когда pSer8-Aβ провоцирует образование фибрилл или, наоборот, препятствует металлзависимой агрегации. Реализация каждого сценария зависит от внешних факторов – наличия и концентрации ионов цинка, белков-партнеров Aβ и др. В связи с этим исследование динамики накопления pSer8-Aβ может способствовать прояснению его роли в формировании амилоидных отложений.

Оптимизация подходов, в том числе масс-спектрометрических (МС), к анализу фосфорилированных форм амилоида остается актуальной задачей [17, 35, 36]. В состав Aβ входят три потенциальных сайта фосфорилирования (Ser8, Ser26 и Tyr10), а также потенциальные сайты в смежных с Аβ областях АРР. На сегодняшний день получены данные о присутствии in vivo фосфоформ Aβ с модифицированными Ser8 и Ser26 [17, 24]. Дальнейшие МС-исследования этих форм могут привести к получению важной информации о роли путей фосфорилирования в амилоидозе, а также к пониманию роли фосфорилирования в патогенезе БА. В представленной работе методами масс-спектрометрии и Вестерн-блотинга исследованы особенности фосфорилирования Aβ по Ser8 (pSer8-Aβ) на модельных мышах 5хFAD, а также у пациента с БА.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Реагенты и Aβ-пептиды

Все химические вещества и растворители, использованные в данном исследовании, были класса ВЭЖХ. Синтетические пептиды Aβ (Aβ_1-16, pSer8-Aβ_1-16, Aβ_1-42 и pSer8-Aβ_1-42), полученные методом твердофазного синтеза и очищенные до чистоты более 99.5% с использованием ВЭЖХ (BioPeptide Inc., США), были растворены в 10% ацетонитриле до концентрации 0.5 мг/мл, поделены на аликвоты по 50 мкл и хранились при -80^оC. В качестве стандартов и контрольных образцов («спайков») использовали синтетические пептиды в известной концентрации. Для контрольных образцов в качестве матрицы использовали плазму крови человека, разведенную фосфатно-солевым буфером (pH 7.4) в соотношении 1 : 50.

Мыши 5xFAD

В работе использовали линию трансгенных мышей 5xFAD (лаборатория Jackson, США, инвентарный номер 006554) [37]. Мыши этой линии имеют пять тяжелых, связанных с БА, наследственных мутаций в генах белка-предшественника амилоида (APP) человека (SweK670N, M671L, LonV717I и FloI716V) и пресенилина 1 (PSEN1) (M146L и L286V), экспрессируемых под контролем промотора Thy1 мыши. Эти мыши экспрессируют трансгенный Aβ человека на значительно более высоком уровне, чем нативный мышиный Aβ, что приводит к ускоренному ухудшению когнитивных функций мозга. Первые поведенческие нарушения проявляются в возрасте ~6 месяцев и становятся наиболее выраженными к 9 месяцам [38].

Образцы мозга мышей были предоставлены Центром генетических коллекций лабораторных животных (Институт биологии и биомедицины ННГУ им. Н.И. Лобачевского). Когорта состояла из 6 особей в возрасте 3, 8, 12, 14, 17 и 23 месяцев. Животных содержали в колонии при свободном доступе к пище и воде в помещении с контролируемой температурой +20 ± 2^оС и влажностью 40–60% при 12-часовом цикле света/темноты. Эксперименты на мышах проводили в соответствии с методиками, утвержденными местным этическим комитетом и органами контроля за животными (Методические рекомендации по размещению и уходу за животными. Окружающая среда, содержание и управление, 2016).

Все мыши 5xFAD были генотипированы для подтверждения наличия всех мутаций. Для этого ДНК выделяли из части хвоста, помещали в 300 мкл лизирующего буфера (10 мМ Трис-HCl, рН 8.0, 100 мМ NaCl) с протеиназой К, инкубировали с ротацией 650 об/мин 16–20 ч при +55°С, перемешивали и центрифугировали при комнатной температуре (5 мин, 14000 об/мин). Верхнюю фракцию, содержащую ДНК, дополнительно промывали 1 раз изопропанолом и дважды 80% этанолом с последующим центрифугированием при +4°C (15 мин, 14000 об/мин). Наличие генов PSEN1 и APP человека проверяли с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) с использованием специфичных к вставкам праймеров 5′-AAT AGA GAA CGG CAG GAG CA-3′ и 5′-GCC AT G AGG GCACT AAT CAT-3′ для PSEN1 и 5′-AGG ACT GAC CACT CG ACC AG-3′ и 5′-CGG GGG T CT AGT T CT GCA T-3′ для APP [39]. Контрольными праймерами были 5′-CT A GGC CAC AGA AT T GAA AGA T CT-3′ и 5′-GT A GGT GGA AAT T CT AGC ATC C-3′.

Образцы СМЖ и мозга человека

Образец ткани мозга человека получен от 82-летнего пациента со спорадической формой БА во время аутопсии (post-mortem interval (PMI) – 15 ч). Образцы височной доли и гиппокампа были заморожены в жидком азоте для дальнейшего МС-анализа, а также зафиксированы в 10% забуференном формалине («БиоВитрум», Россия) для гистологического анализа. Для верификации диагноза были изготовлены гистологические срезы ткани головного мозга толщиной 4–5 мкм и окрашены Конго красным («БиоВитрум», Россия). Для иммуногистохимического (ИГХ) окрашивания использовали антитела к тау-белку и Aβ.

Образец СМЖ получен путем диагностической люмбальной пункции стерильной иглой от мужчины 79 лет с установленным диагнозом болезнь Альцгеймера. Объем спинномозговой жидкости составлял 1 мл. В течение 1 ч с момента забора образец центрифугировали (1500 об/мин, 15 мин), далее проводили отбор супернатанта. Образцы хранили при температуре -80^оС.

Все процедуры, связанные с получением биологического материала человека, проводили в соответствии с рекомендациями Хельсинкской декларации и после получения одобрения комиссии по этике (Протокол № 1 от 25 января 2022 года Этического комитета ПКБ № 1 им. Н.А. Алексеева ДЗМ). Было получено письменное информированное согласие от пациентов.

Экстракция Aβ-пептидов из тканей мозга

Для выделения Aβ-пептидов образцы мозга гомогенизировали на льду с использованием стеклянного гомогенизатора Поттера с добавлением 4 объемов лизирующего буфера (20 мМ Трис, 2.5 мМ EDТА, 137 мМ NaCl, pH 7.6), содержащего смесь ингибиторов протеаз (Roche, Франция). После добавления муравьиной кислоты (МК) до 70% (по объему) образцы обрабатывали ультразвуком (10 мин × 2), встряхивали и центрифугировали (30000 g, 1 ч, +4°C). МК из супернатанта выпаривали с помощью вакуумного концентратора (Eppendorf, Германия). Полученные кислые экстракты хранили при температуре –80°С. Далее Aβ выделяли твердофазной экстракцией (ТФЭ), используя картриджи Oasis MCX (Waters, США), согласно протоколу производителя [40] со следующими модификациями. Кислые экстракты растворяли в смеси 8 М/2 М мочевина/тиомочевина и добавляли до 2% H₃PO₄. Картриджи для ТФЭ предварительно кондиционировали 1 мл метанола и уравновешивали 1 мл 4% H₃PO₄. Образец (2 мл) загружали в картридж ТФЭ и промывали 2 мл 4% H₃PO₄ и 10% ацетонитрила (ACN). Фракцию, обогащенную Aβ, элюировали 1 мл раствора ACN/H₂O/NH₄OH 75 : 15 : 10 (по объему), образцы упаривали до 100 мкл, используя вакуумный концентратор (Eppendorf, Германия).

Выделение Aβ-пептидов из СМЖ человека

Aβ-пептиды из СМЖ и контрольных образцов («спайков») выделяли методом иммунопреципитации (ИП) с использованием высокоспецифичных к pSer8-Aβ моноклональных антител 1Е4Е11 (Merck KGaA, Германия), а также антител 6Е10 и 1Е8 (на три порядка более чувствительных к немодифицированному Aβ) и 4G8 (с одинаковой специфичностью к обеим формам Aβ). ИП проводили в течение 3 ч при +4°С с антителами, иммобилизованными на магнитные частицы Dynabeads (Thermo Scientific) в присутствии ингибиторов протеаз. Aβ элюировали с использованием 70% ACN с добавлением 10 мМ HCl либо двукратного денатурирующего буфера для образцов для последующего электрофореза пептидов и Вестерн-блотинга.

Пептидный электрофорез и Вестерн-блотинг

Полученные после ТФЭ образцы, обогащенные фракцией Aβ, смешивали в соотношении 1 : 1 с 2× буфером для образцов для пептидного электрофореза (100 мМ Трис-HCl рН 8.8, 1% SDS, 4% бета-меркаптоэтанол, 24% глицерин, 0.02% Кумасси бриллиантовый синий) и денатурировали в течение 5 мин при ~ +90°C [41]. Пептидный электрофорез проводили в ячейках Mini-PROTEAN (Bio-Rad, США) с использованием Трис-трициновой буферной системы (25 мМ Трис, 25 мМ Трицин, 0.05% SDS) в 12% полиакриламидном геле. На 10 мл разделяющего геля добавляли 4 мл 30% раствора акриламида/бисакриламида (АА/БА, 29/1), 5 мл 2.5 М Трис-HCl рН 8.8, 6 мкл TEMED и 100 мкл 10% персульфата аммония (ПСА). Для приготовления 5 мл 4% концентрирующего геля добавляли 0.66 мл АА/БА, 0.76 мл 2.5 М Трис-HCl рН 8.8, 5 мкл TEMED и 150 мкл ПСА. Электрофорез проводили в течение 1.5–2 ч при 60 мА с хорошим охлаждением, до начала выхода фронта краски из геля. Проводили полусухой перенос на нитроцеллюлозную мембрану с размером пор 0.2 мкм в течение 1 ч при 50 мА с использованием буфера, содержащего 47.9 мМ Трис, 38.6 мМ глицин, 0.0385% SDS и 20% метанол.

Для Вестерн-блотинга мембрану блокировали в течение 30 мин в 2.5% растворе молока в 0.01 М PBS и 0.1% Tween-20 с добавлением 10 мг/мл БСА и инкубировали с первичными антителами в течение ночи. Для детекции pSer8-Aβ использовали высокоспецифичные к этой ПТМ антитела 1E4E11 (1 : 4000, Merck KGaA, Германия). Немодифицированные Aβ выявляли с помощью антител 6Е10 (1 : 8000, эпитоп 3–8, Biolegend, США), а также антитела 4G8 (1 : 4000, эпитоп 18–23, Biolegend, США), способные детектировать как мономерные, так и олигомерные формы [42]. Инкубацию со вторичными антителами (1 : 5000, IgG, конъюгированные с пероксидазой хрена, Hy-test) проводили в течение 1 ч. Результаты визуализировали с применением усиленной хемилюминесценции (enhanced chemiluminescence, ECL) с реактивами SuperSignal (Thermo Fisher Scientific, США). Изображения получали с использованием гель-документирующей системы SYNGENE G:Box (Syngene, Великобритания). Изображения обрабатывали с использованием программы GeneTools.

Хромато-масс-спектрометрический анализ (ВЭЖХ-МС)

Все образцы для проведения ВЭЖХ-МС-анализа гидролизовали протеазой Lys-C (Promega, США) с получением гидрофильных фрагментов Aβ_1-16. Образцы после ТФЭ (20 мкл) смешивали (1 : 1) со 100 мМ бикарбоната аммония и 0.4 мкг Lys-C, затем инкубировали при 37°C в течение 4 ч.

Нецелевой ВЭЖХ-МС-анализ образцов-гидролизатов (Lys-C) проводили на ВЭЖХ-системе Dionex Ultimate 3000 (Thermo Fisher Scientific), соединенной с времяпролетным масс-спектрометром высокого разрешения TIMS TOF Pro (Bruker Daltonics, США), с использованием метода сбора данных с помощью параллельного накопления и последовательной фрагментации (PASEF) в режиме DDA. Настройки источника электроспрея (ESI) были следующими: напряжение на капилляре – 4500 В, потенциал смещения торцевой пластины – 500 В, расход сухого газа – 3.0 л/мин при температуре 180°С. Измерения проводили в диапазоне масса/заряд (m/z) от 100 до 1700. Диапазон подвижности ионов включал значения от 0.60 до 1.60 В·с/см² (1/k₀, где k₀ – подвижность ионов). Общее время цикла установлено равным 1.16 с, а количество сканирований PASEF MS/MS – 10. Для малых количеств образцов общее время цикла установлено равным 1.88 с.

Для ВЭЖХ загруженный объем образца составлял 1 мкл на инъекцию. ВЭЖХ проводили с использованием колонки-эмиттера Ion Optics (C18, 25 см × 75 мкм, 1.6 мкм; Parkville, Австралия) методом градиентного элюирования. Подвижная фаза А содержала 0.1% муравьиной кислоты в воде; подвижная фаза В содержала 0.1% МК в ацетонитриле. Разделение проводили при расходе 400 нл/мин с использованием 40-минутного градиента от 4 до 90% фазы В.

Данные нетаргетного ВЭЖХ-МС анализировали с использованием программы PEAKS Studio 8.5 (параметры: погрешность измерения массы родительского иона – 20 мд; погрешность массы фрагмента – 0.03 Да). Окисление метионина установлено как возможная вариабельная модификация. Поиск проводили с использованием базы данных Swissprot белков человека. Пороговые значения FDR для всех этапов установлены на уровне 1% или ниже.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Динамика накопления pSer8-Aβ в мозге мышей 5xFAD

Формирование фибриллярных Aβ-структур можно обнаружить уже в мозге 2-месячных мышей линии 5xFAD [37]. Динамика накопления некоторых протеоформ Aβ, исследованных ранее, показала, что в целом накопление протеоформ Aβ коррелирует с образованием амилоидных отложений [24]. Нами проведена серия экспериментов для оценки динамики накопления pSer8-Aβ методом Вестерн-блотинга.

 

Рис. 1. Анализ динамики накопления pSer8-Aβ в сравнении с общим пулом пептидов Aβ методом Вестерн-блотинга в мозге мышей 5xFAD. А – накопление немодифицированных и pSer8-мономерных форм Aβ в мозге мыши в возрасте 12 месяцев; количество нанесенного образца соответствует 0.3 мг ткани мозга для Aβ и 1 мг ткани – для pSer8-Aβ. Б – сравнительный анализ накопления общего пула пептидов Aβ и pSer8-Aβ-форм в мозге мышей разного возраста; количество нанесенного образца соответствует 3 мг ткани мозга. В – графики, отображающие динамику накопления мономерных и олигомерных форм Aβ, по результатам обработки изображений в программе GeneTools. Г – анализ распределения интенсивности окрашивания полос в каждой дорожке при помощи GeneTools

 

Предварительно приблизительно оценили долю фосфорилированных Aβ у мыши среднего возраста (12 месяцев). С этой целью сравнивали содержание пептидов в одинаковых навесках ткани одного и того же животного с линейкой соответствующих синтетических стандартов Aβ_1-42 и pSer8-Aβ_1-42 (рис. 1А). Для идентификации немодифицированных Aβ использовали антитела 6E10, выявляющие преимущественно мономерные пептиды (эпитоп 3–8); для идентификации pSer8 использовали высокоспецифичные антитела 1E4E11. Полученные результаты указывают на то, что суммарное количество мономерных немодифицированных по Ser8 форм Aβ к 12 месяцам может достигать 2 нг на 1 мг ткани мозга, а доля мономерных pSer8-Aβ может быть в 10–100 раз меньше. Необходимо отметить, что Вестерн-блотинг все-таки не относится к количественным методам и позволяет проводить лишь приблизительные относительные количественные оценки. Кроме того, как общее количество Aβ, так и количество его модифицированных форм может варьироваться у разных животных [24].

Динамику накопления общего и модифицированного Aβ определяли с использованием экстрактов, полученных из препаратов мозга 3-, 8-, 14-, 17- и 23-месячных мышей (рис. 1Б–Г). Для минимизации технических ошибок и с учетом того, что предварительный эксперимент подтвердил возможность присутствия pSer8-Aβ в значительно меньших количествах по отношению к немодифицированным Aβ, одну и ту же мембрану последовательно проявляли сначала антителами к pSer8-Aβ (1Е4Е11) и лишь затем антителами 4G8, которые, в отличие от 6E10, совсем не конкурируют за эпитоп с 1E4E11 и проявляют все формы Aβ, не имеющие модификаций в участке 18–23 (в том числе и pSer8-Aβ), включая их олигомеры [42]. Визуальная оценка результатов Вестерн-блотинга (рис. 1Б) позволяет заключить, что пептиды pSer8-Aβ выявляются уже в 3-месячном возрасте и в мономерной форме могут достигать максимума к 14 месяцам. Результаты дополнительной оценки интенсивности полос на полученных изображениях (рис. 1В) указывают на схожесть динамики накопления pSer8-Aβ и общего пула мономерных и димерных форм Aβ, что может косвенно указывать на взаимосвязь фосфорилирования Ser8 и стимуляции олигомеризации. Тем не менее полученный результат не позволяет сделать прямых выводов о возможном присутствии pSer8-Aβ в олигомерных формах: аналогично антителам 6E10, перекрывающиеся с ними по эпитопу в N-конце антитела 1E4E11, также могут плохо идентифицировать димерные и олигомерные формы из-за сниженной доступности специфичного участка.

Дополнительный анализ распределения интенсивности окрашивания полос в каждом из образцов (рис. 1Г) еще более отчетливо подчеркнул присутствие димеров, тримеров и тетрамеров Aβ в отдельных образцах, а также выявил гетерогенность и наличие, как минимум, двух пиков в пятнах, соответствующих мономерным формам, начиная с 8-месячного возраста. Это может указывать на присутствие усеченных мономеров, наряду с полноразмерными пептидами. Примечательно, что при совмещении изображений на рис. 1Б расположение фосфорилированных форм скорее можно отнести к верхней части мономерного пятна и, в целом, пятна, соответствующие pSer8-Aβ, имеют более четкие границы по сравнению с общим пятном. Таким образом, можно предположить, что в нижней части общего пятна могут находиться пептиды, усеченные с N-конца и не содержащие участок с Ser8. Это может указывать на то, что фосфорилирование Ser8 может облегчать отщепление соответствующего N-концевого фрагмента.

Анализ pSer8-Aβ в СМЖ

Вестерн-блот-анализ Aβ из СМЖ пациента с БА выявил присутствие существенного количества pSer8-Aβ (рис. 2). Последовательное окрашивание мембраны высокоспецифичными антителами к pSer8-Aβ и антителами к немодифицированным формам позволило установить, что доля pSer8-Aβ-форм в СМЖ может составлять порядка 1–10% от немодифицированных полноразмерных форм пептида. Эта величина хорошо согласуется с результатами количественного определения доли фосфорилированных амилоидных мономеров, полученных с использованием электрохимического подхода [43].

 

Рис. 2. Оценка содержания pSer8-Aβ в СМЖ пациента с БА методом Вестерн-блотинга. Иммунопреципитацию (ИП) проводили в СМЖ пациента, а также в контрольных образцах Aβ («спайки»). Зеленые стрелки – белок-предшественник (APP), синие – мономер и димер Aβ

 

Кроме того, в образце СМЖ антитела к немодифицированной форме Aβ идентифицируют две высокомолекулярные полосы, соответствующие белку АРР (рис. 2), вероятно, его гликозилированной и негликозилированной формам.

Масс-спектрометрический анализ фосфоформ Aβ из тканей мозга

Фосфорилирование Aβ ранее не удавалось подтвердить методами масс-спектрометрии. В настоящей работе при проведении ВЭЖХ-МС-анализа образцов-фракций Aβ из тканей мозга мышей 5xFAD рассмотрена возможность фосфорилирования Ser, Thr и Tyr (рис. 3). Идентифицированы Aβ-пептиды, фосфорилированные по остаткам Ser8 и Tyr10, но строгое рассмотрение спектров фрагментации не позволило однозначно определить положение ПТМ. Кроме того, обнаружен пептид с двойным фосфорилированием. Это обстоятельство указывает на возможность фосфорилирования не только серина (Ser8), но и тирозина (Tyr10) в составе амилоида.

 

Рис. 3. Покрытие последовательностей протеоформ Aβ (отмечено серым цветом), выделенных из мозга мышей 5хFAD, с локализацией возможных посттрансляционных модификаций, включая фосфорилирование (Ser (S), Thr (T) и Tyr (Y)). А – масс-спектры столкновительной фрагментации (отмечены характерные у- и b-серии ионов-фрагментов пептида) фосфорилированного пептида Aβ16 с разной локализацией фосфогруппы: спектр для Ser8(s) – Б; спектр для Tyr10(y) – В

 

Фосфорилирование Tyr10 не было показано ранее не только МС, но и другими методами. Хотя было установлено, что в данной позиции могут происходить нитрирование и образование дитирозина, а фосфорилирование может быть промежуточной реакцией, которую сложно детектировать. Помимо Ser8 и Tyr10, некоторые спектры фрагментации указывали на возможность фосфорилирования Ser26. Тем не менее общее качество спектров, полученных для Ser8, Tyr10 и Ser26, нельзя признать достаточным для уверенных выводов, поэтому данный вопрос требует дальнейших исследований.

Кроме того, по данным ВЭЖХ-МС-анализа Aβ-пептидов из мозга человека обнаружен фосфосайт Thr (T719), фосфорилирование которого было близко к 100% и не вызывало сомнений. Этот сайт представлен в составе только удлиненных форм Aβ (Х-Т48), которые, скорее всего, являются продуктами альтернативного процессинга АРР или его деградации, не связанной с амилоидозом. Другие возможные позиции фосфорилирования в АРР – 729, 730 и 743 – не имели достоверного покрытия при МС-анализе, что не позволяет сделать каких-либо заключений. Сайт Tyr757 имел хорошее покрытие, однако его фосфорилирования не выявлено.

В целом, хотя результаты МС-анализа указывают на присутствие определенных сайтов фосфорилирования в Aβ и смежных с ним областях APP, тема продолжения МС-исследований фосфоформ Aβ остается актуальной. Решение данной задачи в существенной степени может зависеть от оптимизации процедуры выделения фосфоформ Aβ, поскольку часто используемая солюбилизация МК легко гидролизует этерифицированные фосфатные группы [20, 22]. Кроме того, определенные надежды связаны с последними достижениями в исследовании синтетических фосфоформ Aβ мeтодом MALDI-TOF и с использованием матричных добавок, минимизирующих потерю фосфатных групп в процессе ионизации, а также усиливающих ионизацию именно фосфопептидов [35, 36].

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Согласно полученным результатам, накопление pSer8-Aβ-пептидов в мозге мышей линии 5xFAD схоже с динамикой накопления мономерных и димерных форм общего пула пептидов Аβ. К концу жизненного цикла суммарное количество накопленных Aβ-пептидов может достигать ~10 нг на 1 мг ткани мозга, а доля pSer8-Aβ может составлять 1–10%.

Также показано, что доля pSer8-Aβ-форм в СМЖ человека может составлять порядка 1–10% от немодифицированных полноразмерных форм Aβ. При использовании масс-спектрометрии высокого разрешения получены указания на возможность фосфорилирования Aβ по остаткам Ser8 и Ser26, а также фосфорилирования АРР по остатку Thr719. Впервые получены указания на возможность фосфорилирования Tyr10. Дальнейшая оптимизация МС-методик для эффективного анализа фосфоформ Aβ остается крайне актуальной.

 

Работа выполнена при финансовой поддержке Российского научного фонда (грант № 19-74-30007).

Об авторах

П. А. Стрельникова

Сколковский институт науки и технологий; Институт биохимической физики им. Н.М. Эмануэля РАН

Email: a.kononikhin@skoltech.ru
Россия, Москва, 121205; Москва, 119334

А. Е. Бугрова

Сколковский институт науки и технологий; Институт биохимической физики им. Н.М. Эмануэля РАН

Email: a.kononikhin@skoltech.ru
Россия, Москва, 121205; Москва, 119334

Н. В. Захарова

Сколковский институт науки и технологий; Институт биохимической физики им. Н.М. Эмануэля РАН

Email: a.kononikhin@skoltech.ru
Россия, Москва, 121205; Москва, 119334

К. В. Даничкина

Сколковский институт науки и технологий

Email: a.kononikhin@skoltech.ru
Россия, Москва, 121205

М. И. Индейкина

Сколковский институт науки и технологий; Институт биохимической физики им. Н.М. Эмануэля РАН

Email: mariind@yandex.ru
Россия, Москва, 121205; Москва, 119334

М. С. Гавриш

Научно-исследовательский институт нейронаук, Нижегородский государственный университет имени Н.И. Лобачевского

Email: a.kononikhin@skoltech.ru
Россия, Нижний Новгород, 603022

В. Г. Круть

Российский национальный исследовательский медицинский университет имени Н.И. Пирогова

Email: a.kononikhin@skoltech.ru
Россия, Москва, 117997

А. А. Бабаев

Научно-исследовательский институт нейронаук, Нижегородский государственный университет имени Н.И. Лобачевского

Email: a.kononikhin@skoltech.ru
Россия, Нижний Новгород, 603022

А. Ю. Морозова

Национальный медицинский исследовательский центр психиатрии и наркологии имени В.П. Сербского; Психиатрическая клиническая больница № 1 им. Н.А. Алексеева Департамента здравоохранения г. Москвы

Email: a.kononikhin@skoltech.ru
Россия, Москва, 119034; Москва, 117152

А. С. Кононихин

Сколковский институт науки и технологий; Институт энергетических проблем химической физики имени В.Л. Тальрозе Федерального исследовательского центра химической физики имени Н.Н. Семёнова РАН

Автор, ответственный за переписку.
Email: a.kononikhin@skoltech.ru
Россия, Москва, 121205; Москва, 119334

В. А. Митькевич

Институт молекулярной биологии имени В.А. Энгельгардта РАН

Email: mitkevich@eimb.ru
Россия, Москва, 119991

А. А. Макаров

Институт молекулярной биологии имени В.А. Энгельгардта РАН

Email: mitkevich@gmail.com
Россия, Москва, 119991

Е. Н. Николаев

Сколковский институт науки и технологий

Email: a.kononikhin@skoltech.ru
Россия, Москва, 121205

Список литературы

Дополнительные файлы