7-Метилгуанин подавляет рост аденокарциномы толстой кишки in vivo

Обложка

Цитировать

Полный текст

Аннотация

7-Метилгуанин (7-МГ) является природным ингибитором поли(ADP-рибозо)полимеразы 1 и тРНК-гуанинтрансгликозилазы, ферментативная активность которых важна для пролиферации опухолевых клеток. Недавно в ряде доклинических тестов была продемонстрирована безопасность 7-МГ и подобрана доза для внутрижелудочного введения мышам. В представленной работе исследована фармакологическая активность 7-МГ на мышах BALB/c и BALB/c nude с перевитой опухолью. Показано, что 7-МГ эффективно проникает в опухолевую ткань и подавляет рост аденокарциномы толстой кишки в модели Акатол, а также в ксенографтной модели с использованием клеток человека HCT116.

Полный текст

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

в/б – внутрибрюшинное введение; в/ж – внутрижелудочное введение; 7-МГ – 7-метилгуанин; ПАРП-1 – поли(ADP-рибозо)полимераза 1; ТГТ – тРНК-гуанинтрансгликозилаза.

ВВЕДЕНИЕ

7-Метилгуанин (7-МГ) является метаболитом нуклеиновых кислот, который в малом количестве обнаруживается в крови и моче человека [1]. Изучение 7-МГ как потенциального противоопухолевого ингибитора началось с работы по компьютерному скринингу природных азотистых оснований и их производных в отношении поли(ADP-рибозо)полимеразы 1 (ПАРП-1) – ключевого фермента репарации ДНК [2]. Моделирование продемонстрировало комплементарность 7-МГ к активному центру ПАРП-1, дальнейшие in vitro исследования подтвердили предположение о конкурентном характере ингибирования [3–5]. 7-МГ также является ингибитором тРНК-гуанинтрансгликозилазы (ТГТ) – фермента, участвующего в механизме трансляции [6]. Показано, что при нокауте/нокдауне гена ТГТ снижается пролиферация и миграция опухолевых клеток [7].

Синтетические ингибиторы ПАРП-1 олапариб, рукапариб и нирапариб используются в медицине в качестве инновационных противоопухолевых препаратов, однако обладают серьезными побочными эффектами (в частности, миелодиспластический синдром/острый миелоидный лейкоз) [8, 9]. В то же время природный ингибитор 7-МГ продемонстрировал безопасность в проведенном нами токсикологическом исследовании; была подобрана доза для его введения мышам – 50 мг/кг внутрижелудочно (в/ж), 3 раза в неделю [10]. Наличие нескольких релевантных мишеней (ПАРП-1, ТГТ) и безопасность 7-МГ обуславливают перспективность дальнейших in vivo исследований. В представленной работе впервые описано противоопухолевое действие 7-МГ на моделях аденокарциномы толстой кишки.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Мыши BALB/c (самцы, возраст 4 недели) были получены из разведения НМИЦ онкологии им. Н.Н. Блохина. Образец мышиной аденокарциномы Акатол [11] был получен из коллекции опухолей НМИЦ онкологии им. Н.Н. Блохина. Суспензию опухолевых клеток (0.5 мл, 0.1 г/мл) вводили подкожно в надлопаточную область. Введение тестируемых веществ начинали на 5-й день после перевивки. Мышей разбивали на группы по 9 животных в каждой: контрольная группа I, вода (в/ж, 3 раза в неделю); группа II, цисплатин (2.5 мг/кг в/б, 2 раза в неделю в течение 1 недели); группа III, 7-МГ (50 мг/кг в/ж, 3 раза в неделю); группа IV, 7-МГ + цисплатин. Для приготовления суспензии 7-МГ (5 мг/мл) навеску вещества смешивали с дистиллированной водой, встряхивали на вортексе, после чего оставляли на 5 мин в ультразвуковой бане при температуре 45оС. Полученную суспензию 7-МГ вводили с помощью гастрального зонда. При комбинированном лечении 7-МГ вводили за 3 ч до цисплатина. После развития опухолевых узлов измеряли их объем по формуле: V = 1/2×длина×ширина2. Анализ результатов проводили по достижении среднего значения объема опухоли в контрольной группе 4000 мм3.

Фармакокинетический эксперимент проводили на самцах мышей BALB/c на 15-й день после перевивки опухоли Акатол. За 18 ч до проведения эксперимента мышей лишали доступа к корму. Животным однократно вводили 7-МГ (50 мг/кг в/ж) и затем производили забор крови и опухолевой ткани через 15 мин (2 мыши), 60 мин (2 мыши) и 180 мин (3 мыши). Полученные образцы замораживали и подвергали лиофилизации, механическому измельчению и последовательной экстракции растворителями (90% водным раствором ацетонитрила, содержащим 2% трифторуксусной кислоты, ацетоном и 0.1% водным раствором гептафтормасляной кислоты). Количественный анализ 7-МГ проводили с помощью хромато-масс-спектрометрического анализа на приборе LCQ Advantage MAX (Thermo Electron Co., США), оснащенного хроматографом Surveyor Plus и источником ионизации ESI. В качестве внутреннего стандарта использовали дейтерированный 7-МГ, полученный методом твердофазного изотопного обмена [12].

Иммунодефицитные мыши BALB/c nude (самки, возраст 6–7 недель) были получены из разведения лаборатории биохимических основ фармакологии и опухолевых моделей НМИЦ онкологии им. Н.Н. Блохина. Суспензию опухолевых клеток человека HCT116 (0.2 мл, 1.2×106 кл/мл) вводили подкожно в правый и левый бок мыши. Введение тестируемых веществ начинали на 10-й день после перевивки. Мышей разбивали на группы по 4 животных в каждой: контрольная группа I, калий-фосфатный буфер (в/б, 3 раза в неделю); группа II, цисплатин (1 мг/кг в/б, 3 раза в неделю в течение 1 недели); группа III, 7-МГ (50 мг/кг в/ж, 3 раза в неделю); группа IV, 7-МГ + цисплатин. При комбинированном лечении 7-МГ вводили за 3 ч до цисплатина. Объем опухолевых узлов измеряли по формуле V = π/6×длина×ширина×глубина.

Все эксперименты на животных выполняли в соответствии с требованиями Этического комитета НМИЦ онкологии им. Н.Н. Блохина по работе с животными.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Биологическая активность ингибитора 7-МГ при в/ж введении была исследована на модели рака толстой кишки мыши Акатол. В качестве препарата сравнения использовали классический генотоксичный агент цисплатин, эффективность которого была ранее продемонстрирована в отношении модели Акатол. В результате показано существенное торможение роста опухоли в случае введения цисплатина (65.8%), 7-МГ (52.5%) и их комбинации (65.5%) на 16-е сутки эксперимента (рис. 1). Эффекты известного химиопрепарата цисплатина и обнаруженного ингибитора ПАРП-1 7-МГ оказались сопоставимы, а использование их комбинации не привело к усилению противоопухолевого действия.

 

Рис. 1. Динамика роста аденокарциномы толстой кишки в модели Акатол

 

Согласно регламенту работы с модельными мышами, при достижении критического размера опухоли (4000 мм3) животное может быть исключено из экспериментальной группы. Время, за которое опухоль достигает такого размера, можно условно принять за продолжительность жизни после перевивки. На рис. 2 показано выбывание мышей из группы по достижении критического размера опухоли, можно видеть заметное увеличение выживаемости при введении цисплатина и 7-МГ.

 

Рис. 2. Выживаемость мышей с перевитой опухолью Акатол (животное выбывало из группы по достижении размера опухоли 4000 мм3)

 

Для подтверждения накопления 7-МГ в перевитой опухоли Акатол был осуществлен фармакокинетический эксперимент. После в/ж введения 7-МГ его содержание в опухоли постепенно возрастало и через 15, 60 и 180 мин составило 218±13, 460±28 и 989±59 нг/г соответственно. При этом соотношение концентраций 7-МГ в опухоли и крови практически не зависело от времени и равнялось в среднем 0.44, что, с учетом низкой васкуляризации ткани, свидетельствует об эффективном проникновении 7-МГ в опухоль.

Также противоопухолевая активность 7-МГ была протестирована на ксенографтной модели рака толстой кишки, полученной в результате перевивки мышам опухолевых клеток человека HCT116. На 32 сутки эксперимента торможение роста опухоли при введении цисплатина, 7-МГ и их комбинации составило 16.1, 37.8 и 80% соответственно (рис. 3). Интересно, что комбинация 7-МГ и цисплатина привела к аддитивному эффекту, который не наблюдался в случае модели Акатол. Вероятно, опухолевые клетки человека HCT116 более чувствительны к комбинированному воздействию тестируемых препаратов.

 

Рис. 3. Динамика роста аденокарциномы толстой кишки в ксенографтной модели

 

ВЫВОДЫ

Осуществлен in vivo анализ противоопухолевой активности природного соединения 7-МГ на модели рака толстой кишки Акатол, а также на ксенографтной модели с использованием опухолевых клеток человека HCT116. Показатели торможения роста опухоли при введении 7-МГ свидетельствуют о высокой эффективности препарата в выбранном режиме – 50 мг/кг в/ж, 3 раза в неделю. С использованием хромато-масс-спектрометрического анализа показана высокая степень накопления 7-МГ в опухолевой ткани. В случае ксенографтной модели обнаружено существенное усиление противоопухолевого действия при комбинированном введении 7-МГ и известного химиотерапевтического препарата цисплатина (торможение роста 80%). Полученные данные подтверждают перспективность дальнейших исследований 7-МГ в качестве нового противоопухолевого средства.

Работа выполнена при финансовой поддержке Российского научного фонда (грант № 19-74-10072). Получение дейтерированного 7-МГ осуществлено в рамках выполнения государственного задания НИЦ «Курчатовский институт».

×

Об авторах

К. И. Кирсанов

Национальный медицинский исследовательский центр онкологии имени Н.Н. Блохина; Российский университет дружбы народов

Email: nilovdm@gmail.com

Научно-исследовательский институт канцерогенеза; Медицинский институт

Россия, Москва, 115478; Москва, 117198

Т. И. Фетисов

Национальный медицинский исследовательский центр онкологии имени Н.Н. Блохина

Email: nilovdm@gmail.com

Научно-исследовательский институт канцерогенеза

Россия, Москва, 115478

Е. Е. Антошина

Национальный медицинский исследовательский центр онкологии имени Н.Н. Блохина

Email: nilovdm@gmail.com

Научно-исследовательский институт канцерогенеза

Россия, Москва, 115478

Т. Г. Горькова

Национальный медицинский исследовательский центр онкологии имени Н.Н. Блохина

Email: nilovdm@gmail.com

Научно-исследовательский институт канцерогенеза

Россия, Москва, 115478

Л. С. Труханова

Национальный медицинский исследовательский центр онкологии имени Н.Н. Блохина

Email: nilovdm@gmail.com

Научно-исследовательский институт канцерогенеза

Россия, Москва, 115478

С. И. Шрам

Национальный исследовательский центр «Курчатовский институт»

Email: nilovdm@gmail.com
Россия, Москва, 123182

И. Ю. Нагаев

Национальный исследовательский центр «Курчатовский институт»

Email: nilovdm@gmail.com
Россия, Москва, 123182

Ю. А. Золотарев

Национальный исследовательский центр «Курчатовский институт»

Email: nilovdm@gmail.com
Россия, Москва, 123182

Л. Або Кура

Национальный медицинский исследовательский центр онкологии имени Н.Н. Блохина; Российский университет дружбы народов

Email: nilovdm@gmail.com

Научно-исследовательский институт канцерогенеза; Медицинский институт

Россия, Москва, 115478; Москва, 117198

В. С. Покровский

Национальный медицинский исследовательский центр онкологии имени Н.Н. Блохина; Российский университет дружбы народов

Email: nilovdm@gmail.com

Научно-исследовательский институт канцерогенеза; Медицинский институт

Россия, Москва, 115478; Москва, 117198

М. Г. Якубовская

Национальный медицинский исследовательский центр онкологии имени Н.Н. Блохина

Email: nilovdm@gmail.com

Научно-исследовательский институт канцерогенеза

Россия, Москва, 115478

В. К. Швядас

Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова

Email: nilovdm@gmail.com

НИИ физико-химической биологии имени А.Н. Белозерского; факультет биоинженерии и биоинформатики

Россия, Москва, 119991

Д. К. Нилов

Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова

Автор, ответственный за переписку.
Email: nilovdm@gmail.com

НИИ физико-химической биологии имени А.Н. Белозерского

Россия, Москва, 119991

Список литературы

  1. Topp H., Sander G., Heller-Schöch G., Schöch G. // Anal. Biochem. 1987. V. 161. P. 49–56.
  2. Нилов Д.К., Тараров В.И., Куликов А.В., Захаренко А.Л., Гущина И.В., Михайлов С.Н., Лаврик О.И., Швядас В.К. // Acta Naturae. 2016. Т. 8. № 2. С. 120–128.
  3. Nilov D., Maluchenko N., Kurgina T., Pushkarev S., Lys A., Kutuzov M., Gerasimova N., Feofanov A., Švedas V., Lavrik O., et al. // Int. J. Mol. Sci. 2020. V. 21. P. 2159.
  4. Кургина Т.А., Шрам С.И., Кутузов М.М., Абрамова Т.В., Щербакова Т.А., Мальцева Е.А., Поройков В.В., Лаврик О.И., Швядас В.К., Нилов Д.К. // Биохимия. 2022. Т. 87. С. 794–803.
  5. Шрам С.И., Щербакова Т.А., Абрамова Т.В., Барадиева Э.Ц., Ефремова А.С., Смирновская М.С., Сильников В.Н., Швядас В.К., Нилов Д.К. // Биохимия. 2023. Т. 88. С. 962–972.
  6. Пушкарев С.В., Винник В.А., Шаповалова И.В., Швядас В.К., Нилов Д.К. // Биохимия. 2022. Т. 87. С. 550–557.
  7. Zhang J., Lu R., Zhang Y., Matuszek Ż., Zhang W., Xia Y., Pan T., Sun J. // Cancers (Basel). 2020. V. 12. P. 628.
  8. Ohmoto A., Yachida S. // Onco Targets Ther. 2017. V. 10. P. 5195–5208.
  9. Mittica G., Ghisoni E., Giannone G., Genta S., Aglietta M., Sapino A., Valabrega G. // Recent Pat. Anticancer Drug Discov. 2018. V. 13. P. 392–410.
  10. Kirsanov K., Fetisov T., Antoshina E., Trukhanova L., Gor’kova T., Vlasova O., Khitrovo I., Lesovaya E., Kulbachevskaya N., Shcherbakova T., et al. // Front. Pharmacol. 2022. V. 13. P. 842316.
  11. Фетисов Т.И., Тилова Л.Р., Лесовая Е.А., Антошина Е.Е., Горькова Т.Г., Труханова Л.С., Морозова О.В., Шипаева Е.В., Иванов Р.В., Пурмаль А.А. и др. // Усп. мол. онкол. 2016. Т. 3. С. 67–72.
  12. Zolotarev Y.A., Dadayan A.K., Borisov Y.A., Kozik V.S. // Chem. Rev. 2010. V. 110. P. 5425–5446.

Дополнительные файлы

Доп. файлы
Действие
1. JATS XML
Скачать
2. Рис. 1. Динамика роста аденокарциномы толстой кишки в модели Акатол

Скачать (190KB)
Метаданные
3. Рис. 2. Выживаемость мышей с перевитой опухолью Акатол (животное выбывало из группы по достижении размера опухоли 4000 мм3)

Скачать (146KB)
Метаданные
4. Рис. 3. Динамика роста аденокарциномы толстой кишки в ксенографтной модели

Скачать (211KB)
Метаданные

© Кирсанов К.И., Фетисов Т.И., Антошина Е.Е., Горькова Т.Г., Труханова Л.С., Шрам С.И., Нагаев И.Ю., Золотарев Ю.А., Або Кура Л., Покровский В.С., Якубовская М.Г., Швядас В.К., Нилов Д.К., 2024

Creative Commons License
Эта статья доступна по лицензии Creative Commons Attribution 4.0 International License.

Данный сайт использует cookie-файлы

Продолжая использовать наш сайт, вы даете согласие на обработку файлов cookie, которые обеспечивают правильную работу сайта.

О куки-файлах