Синтетические повреждения с флуоресцеинкарбамоильной группировкой как аналоги объемных повреждений, удаляемых системой эксцизионной репарации нуклеотидов. Сравнительное исследование свойств

Полный текст

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ЭРН – эксцизионная репарация нуклеотидов; ОГ-ЭРН – общегеномная ЭРН; nFluL – N-[6-(5(6)-флуоресцеинилкарбамоил)гексаноил]-3-амино-1,2-пропандиол; nFluS – N-[6-(5(6)-флуоресцеинилкарбамоил)]-3-амино-1,2-пропандиол; ОДН – олигодезоксирибонуклеотид.

ВВЕДЕНИЕ

Поддержание целостности и стабильности генома обеспечивается механизмами репарации ДНК. Одним из таких механизмов является эксцизионная репарация нуклеотидов (ЭРН), ответственная за удаление объемных повреждений. Как правило, это ковалентные аддукты, присутствие которых вносит существенные изменения в регулярную структуру ДНК. В результате многостадийного процесса, в ходе которого белки последовательно формируют на ДНК в районе повреждения многосубъединичные комплексы переменного состава, повреждение распознается и удаляется из ДНК в составе окружающего его фрагмента цепи размером от 24 до 32 нуклеотидов. Исходная последовательность восстанавливается действием репарационных полимераз и ДНК-лигаз с использованием неповрежденной цепи ДНК в качестве матрицы. Различают две ветви ЭРН – независимую от функционального состояния генома, так называемую общегеномную ЭРН (ОГ-ЭРН), и репарацию, ассоциированную с транскрипцией [1, 2].

Система ЭРН характеризуется широкой специфичностью и удаляет из ДНК повреждения разной структуры: продукты, возникающие при воздействии УФ- и радиоактивного излучения, химически активных веществ из внешней среды, например, полициклических ароматических углеводородов и их активных метаболитов, диолэпоксидов. Действие многих химиопрепаратов также основано на формировании объемных аддуктов с ДНК. Изучению механизма ЭРН посвящено большое количество исследований. К настоящему времени обнаружены основные белки-участники ЭРН в клетках живых организмов, определены их функции, характер белковых взаимодействий и основные этапы данного процесса [1, 3]. Тем не менее многие детали механизма ЭРН и работы конкретных белков остаются неясными и продолжают изучаться на уровне белково-нуклеиновых комплексов [4–7]. Большой интерес – как фундаментальный, так и прикладной – вызывает сравнительная оценка активности ЭРН in vitro. Для оценки активности ОГ-ЭРН в таких исследованиях наиболее широко используются модельные субстраты, представляющие собой протяженные (не менее 120 п.н.) линейные ДНК-дуплексы, одна из цепей которых содержит во внутренней позиции объемное повреждение [8–11]. Подобные дуплексы различной длины используют и при изучении механизмов взаимодействия с поврежденной ДНК рекомбинантных белков, отвечающих за протекание обеих ветвей ЭРН [7, 12], а также при изучении функционирования ЭРН в контексте нуклеосом [4].

Модельные ДНК часто создают с использованием синтетических аналогов повреждений, вводимых в ДНК с помощью автоматического синтеза, что налагает определенные требования на свойства включаемого в цепь ДНК модифицированного звена [13]. Таким образом, поиск аналогов объемных повреждений, структура которых, с одной стороны, обеспечивает их эффективное удаление системой ЭРН, а с другой – позволяет стабильно и с высокой эффективностью встраивать модифицированные звенья в модельные ДНК, является актуальной задачей. Модельные ДНК, содержащие такие повреждения, могут использоваться для оценки активности системы ЭРН, в том числе в практических целях, для понимания того, насколько активно те или иные клетки могут противостоять появлению индуцированных проведением химиотерапии или спонтанных повреждений, а также как инструмент для изучения деталей механизма работы этой системы репарации.

В данной работе предпринято сравнительное изучение свойств модельных ДНК-дуплексов, содержащих синтетические объемные повреждения, различающиеся способом соединения N-[6-(5(6)-флуоресцеинилкарбамоильного фрагмента с пропандиольной вставкой. С использованием ДНК, содержащей N-[6-(5(6)-флуоресцеинилкарбамоил)- гексаноил]-3-амино-1,2-пропандиол (nFluL), который эффективно удаляется белками системы ЭРН, проведены сравнительные исследования активности ЭРН в экстрактах клеток различных млекопитающих [14–17]. N-[6-(5(6)-флуоресцеинилкарбамоил)]-3-амино-1,2-пропандиол (nFluS) в качестве модельного повреждения ранее не исследовали (рис. 1).

 

 

 

Рис. 1. Синтетические аналоги повреждений, используемые в работе. nFluL – N-[6-(5(6)-флуоресцеинилкарбамоил)гексаноил]-3-амино-1,2-пропандиол; nFluS – N-[6-(5(6)-флуоресцеинилкарбамоил)]-3-амино-1,2-пропандиол

 

Структура повреждения nFluS, не содержащего гексаноильный линкер, выбрана на основании результатов наших работ, в которых была проанализирована эффективность первичного распознавания комплексами белка XPC участка ДНК, содержащего повреждение, и проверки наличия в дестабилизированной области дцДНК объемного повреждения, осуществляемой АТР-зависимой 5’→3’-хеликазой XPD – субъединицей комплекса TFIIH. Выбрав для анализа несколько модельных ДНК, содержащих повреждения, которые с разной эффективностью удаляются белками системы ЭРН, мы показали, что самое высокое сродство XPD проявляет к nFlu-содержащей модельной ДНК [18]. Результаты моделирования молекулярной динамики показали, что наличие протяженного гибкого линкера позволяет флуоресцеиновому фрагменту менять расположение и взаимодействовать с несколькими участками дцДНК, окружающей повреждение, в том числе и с 3’-стороны от повреждения, вызывая дестабилизацию структуры ДНК в этой области [17, 18]. Связывание XPC с расположенным таким образом участком дестабилизированной ДНК приводит к формированию непродуктивных для репарации комплексов XPC–ДНК, поскольку связавшийся с 3’-стороны от повреждения и продвигающийся в направлении 5’→3’ верифицирующий комплекс TFIIH с повреждением не сталкивается и покидает ДНК [19, 20]. Наиболее детальное представление о структуре и взаимодействиях объемных повреждений ДНК обеспечивают методы ЯМР, однако для таких исследований необходимы миллиграммовые количества образцов ДНК, несущей повреждение.

Помимо сравнительной оценки эффективности специфической эксцизии nFluS и nFluL белками ЭРН-компетентного экстракта клеток HeLa, нами методом термической денатурации с оптической регистрацией сигнала определена также степень влияния nFluS или nFluL во внутренней позиции одной из цепей ДНК-дуплексов (16 п.н.) на геометрию дцДНК и ее термостабильность. Кроме того, проведены эксперименты по спектрометрическому титрованию, в результате которых получены данные о характере взаимодействия полициклических фрагментов объемных повреждений с азотистыми основаниями соседних звеньев ДНК [21].

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Материалы

ЭРН-компетентный экстракт клеток HeLa был приготовлен по стандартной методике [22]. Использовали Т4-полинуклеотидкиназу, Т4-ДНК-лигазу и Taq-ДНК-полимеразу производства «Биосан» (Россия), протеиназу К (Sigma, СШA), EDTA, Tris, Hepes, дитиотреитол (DТТ, Sigma). Олигодезоксирибонуклеотиды (ОДН) синтезировали в Лаборатории биомедицинской химии ИХБФМ СО РАН, использованные при синтезе амидофосфиты были производства («НаноТех-С», Россия), [γ-³²Р]-АТР (3000 Ки/ммоль) и [α-³²P]-dСTP (3000 Ки/ммоль) произведены в ИХБФМ СО РАН. В работе также использовали DEAE-фильтры DE-81 (Whatman, Великобритания), мочевину, N,N′-метиленбисакриламид (Amresco, США), акриламид (Applichem, ФРГ), TEMED (Helicon, Россия). Использовали также: PSA, MgCl₂, NaCl, H₃BO₃, NaOH, NaCac, LiClO₄, (NH₄)₂SO₄, HCl, ацетон.

Нуклеотидные последовательности всех ОДН, использованных в работе, приведены в табл. 1.

 

Таблица 1. ОДН, использованные в работе

№	Последовательность	Длина, н.	Описание
1	P-5′-atccagggсgacggtg	16	Немодифицированная цепь (серединное звено)
2	P-5′-atccagggmSgacggtg	16	ОДН с ненуклеотидным звеном, несущим остаток флуоресцеина (nFluS), для включения в верхнюю цепь (серединное звено, ОДН-2)
3	P-5′-atccagggmLgacggtg	16	ОДН с ненуклеотидным звеном, несущим остаток флуоресцеина и с линкером на основе аминогексановой кислоты (nFluL), для включения в верхнюю цепь (серединное звено верхней цепи, ОДН-3)
4	P-5′-caccgtcgccctggat	16	Нижняя цепь без модификации
5	5′-tggacgatatcccgcaagaggcccggcagtaccggcataaccaagcctatgcctacagc	59	5′-компонента для верхней цепи (левое плечо верхней цепи)
6	P-5′-ccgaggatgacgatgagcgcattgttagatttcatacacggtgcctgactgcgttagcaatt	62	3′-компонента для верхней цепи (правое плечо верхней цепи)
7	5′-catcctcggcaccgtcgccctggatgctgtaggcatag	38	Комплементарная цепь для лигирования трех фрагментов верхней цепи базовой последовательности
8	5′- tgcgctcatcgtcatcctcggcaccgtcgccctggatgctgtaggcataggctt	54	Нижняя немодифицированная цепь (серединное звено для нижней цепи, ОДН-7)
9	5′-gggggcgtaccttgtgagcaatcgtgttcatcat-P	34	Матрица для достройки продуктов эксцизии [α-³²P]-dCMP
10	5′-P-ggttatgccggtactgccgggcctcttgcgggatatcgtcca	42	3′-компонента для нижней цепи (правое плечо нижней цепи)
11	5′-cgatgagcgcattgttagatttc	23	Комплементарная цепь для лигирования ОДН-7 и левого плеча нижней цепи
12	5′-agtaccggcataaccaagcctatgcc	26	Комплементарная цепь для лигирования ОДН-7 и правого плеча нижней цепи

 

Синтез протяженных модельных ДНК

Протяженные модельные ДНК 137 п.н. синтезировали с использованием ОДН 1–3 и 5–12 и Т4-ДНК-лигазы как описано ранее [14]. Последовательности ОДН и протяженных модельных ДНК не отличались от использованных нами ранее.

Оценка субстратных свойств модельных ДНК-дуплексов, содержащих флуоресцеиновые аддукты

Для сравнительного анализа эффективности специфической эксцизии использовали метод 3’-концевого мечения продуктов эксцизии [14]. Реакционную смесь для проведения реакции (30 мкл), которая содержала 16 нМ ДНК-субстрат, 1.6 мг/мл NER-компетентного экстракта клеток и 0.5 мкМ матричный ОДН-9 для гибридизации продуктов эксцизии, в буфере (25 мМ Тris-HCl, pH 7.8; 45 мМ NaCl; 4.4 мМ MgCl₂; 0.1 мМ EDТА; 4 мМ ATP) инкубировали при 30°C в течение 10–40 мин. Для инактивации реакции смесь нагревали до 95°С, после чего охлаждали до комнатной температуры. После добавления 3 мкл смеси, содержащей 100 мкМ dATP, dGTP и dTTP, 5 ед. Taq-ДНК-полимеразы и 500–750 Бк [α-³²P]-dCTP, смесь инкубировали при 37°С в течение 5 мин, затем добавляли 0.5 мкл 50 мкМ dCTP, после чего инкубировали в течение еще 15 мин. Реакцию останавливали, добавляя раствор протеиназы К (4 мкг/мл), 10% SDS (по 1 мкл) и выдерживая смесь в течение 30 мин при 37°С. Продукты реакции переосаждали в 96% этаноле, после чего центрифугировали при 12000 g (4°С), отмывали в 70% этаноле, а полученный осадок растворяли в воде. Продукты реакции разделяли электрофорезом в полиакриламидном геле (ПААГ) в денатурирующих условиях. Гели, содержащие радиоактивно меченные образцы ДНК, анализировали с помощью радиолюминесцентного экрана Imaging Screen-K (Kodak, США) с последующим сканированием на GE Typhoon FLA 9500. Для количественного анализа результатов использовали программу Quantity One.

Определение угла изгиба ДНК-дуплексов

Угол изгиба дуплексов рассчитывали на основе данных об электрофоретической подвижности в неденатурирующих условиях (10% ПААГ, 1 × TBE, 4°С) по формуле:

$\alpha =\pi -\arccos$$\sqrt{\frac{{\mu }_{\mathrm{mod}}}{{\mu }_{un\mathrm{mod}}}}$,

где μ_модиф и μ_{немодиф} – электрофоретические подвижности дуплексов при разделении в неденатурирующем геле.

Оценка термостабильности ДНК-дуплексов методом термической денатурации с оптической регистрацией сигнала

В экспериментах использовали спектрофотометр Cary 300-Bio (Varian, Австралия), оборудованный шестисекционным элементом Пельтье для изменения температуры, и кварцевые кюветы с длиной оптического пути 0.2 см. Использовали диапазон температур 5–95°С. Температуру образца в каждой кювете откалибровывали с использованием термопар Temperature Probes Series II (Varian, Австралия). Измерения проводили на длинах волн 260, 270 и 300 нм (базовая линия; ширина щели 1 нм, время усреднения сигнала 1 с, скорость изменения температуры 0.5°С/мин). Все образцы для термической денатурации растворяли в деионизированной воде Mili-Q и в 10-мМ какодилатном буфере (CH₃)₂AsO₂Na pH 7.2, 0.1 М NaCl. Значения термодинамических параметров рассчитывали, обрабатывая данные об изменении оптической плотности при нагреве и охлаждении на длинах волн 260 и 270 нм путем подгонки теоретических кривых в рамках приближения модели двух состояний с помощью программы Simplex. Базу данных, характеризующую термостабильность ДНК-комплексов, формировали в MS Excel.

Спектрометрическое титрование

Спектрометрическое титрование проводили c использованием 16-звенных ОДН (табл. 1). Были приготовлены две серии образцов, которые содержали ОДН-2 (nFluS-ОДН) или ОДН-3 (nFluL-ОДН) в постоянной концентрации (5.4 мкМ) и комплементарную цепь (ОДН-4), концентрация которой варьировала от 1.25 до 5.4 мкМ, в 20 мМ Tris-HCl-буфере рН 8.0, содержащем 50 мМ NaCl. Контрольные образцы содержали только ОДН с модификацией. Образцы инкубировали в течение 5 мин при температуре 95°С в 1 × TE, затем охлаждали со скоростью 1°С/мин до комнатной температуры для формирования дуплекса. Спектры образцов были записаны с использованием спектрофлуориметра Clariostar plate reader (BMG Labtech, ФРГ) в UV-прозрачных планшетах Corning 3635.

Для полученных данных определяли стандартное отклонение по формуле:

$S=$$\sqrt{\frac{1}{n-1}\sum _{i=1}^n{\left(xi-\stackrel{=}{x}\right)}^2}$,

где n – объем выборки; xi – i-й элемент выборки; $\overline{\overline{x}}$ – среднее арифметическое выборки. Планки погрешностей на всех рисунках представляют собой стандартные отклонения, полученные на основе не менее трех независимых экспериментов.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Сравнительная оценка эффективности удаления nFluL и nFluS из модельных ДНК в реакции специфической эксцизии

Влияние структурных различий nFluL и nFluS на эффективность их удаления из ДНК-субстратов оценивали с помощью метода концевого мечения продуктов специфической эксцизии (рис. 2А) [14]. В качестве субстратов эксцизионной репарации нуклеотидов использовали протяженные (137 п.н.) ДНК-дуплексы, содержащие во внутренней (68) позиции одной из цепей ненуклеотидное звено nFluL или nFLuS. Модельные ДНК-субстраты инкубировали в течение 0–40 мин при 30°C с белками экстракта клеток HeLa. После остановки реакции продукты специфической эксцизии (фрагменты цепи ДНК длиной 24–32 нуклеотидов, содержащие повреждение) гибридизовали с присутствующей в реакционной смеси матрицей (табл. 1, ОДН-9), комплементарной содержащему повреждение участку цепи ДНК (рис. 2А). Далее проводили достройку продуктов специфической эксцизии, гибридизованных на матрице, с помощью Taq-ДНК-полимеразы, а также смеси dNTP и [α-³²P]-dСTP, благодаря чему происходило ³²P-мечение продуктов специфической эксцизии. Длина продуктов эксцизии после достройки составила, в основном, 34 нуклеотида. Продукты эксцизии разделяли с помощью электрофореза в ПААГ в денатурирующих условиях (рис. 2Б). На основе данных об интенсивности полос, соответствующих 34 нуклеотидам, были построены графики зависимости относительной эффективности эксцизии от времени инкубации с белками экстракта (рис. 2В).

 

Рис. 2. Сравнительная оценка эффективности удаления nFluL или nFluS из модельных ДНК в реакции специфической эксцизии, катализируемой белками экстракта клеток HeLa. А – схематическое представление процедуры оценки эксцизионной активности ЭРН in vitro методом концевого мечения продуктов специфической эксцизии (адаптировано из [14, 23]); Б – радиоавтограф геля после разделения продуктов реакции эксцизии; В – график зависимости относительной эффективности эксцизии поврежденного участка ДНК от времени инкубации с белками ЭРН. Значения для кривых рассчитывали с учетом интенсивности сигнала продуктов длиной 34 н.

 

Как видно из представленных результатов, на всем временном промежутке удаление nFluS из модельной ДНК происходило в 1.5–2 раза более эффективно, чем nFluL. Проведение последующих экспериментов позволило получить и сравнить данные об индуцированных этими объемными повреждениями изменениях геометрии дцДНК и ее стабильности – характеристик, от которых зависит эффективность удаления повреждений ДНК системой ЭРН.

Особенности геометрии модельных ДНК, содержащих объемную модификацию nFluL или nFluS

Перегиб сахарофосфатного остова в месте расположения объемного повреждения – одно из нарушений регулярной двухцепочечной структуры ДНК, распознаваемых на этапе первичного узнавания места повреждения. Величина перегиба зависит от типа повреждения и окружающей его последовательности [24]. Чем больше перегиб ДНК-дуплексов, который вызывает присутствие объемной модификации (т.е. чем больше значение угла изгиба отдаляется от 180°), тем меньше их подвижность в геле при электрофорезе в неденатурирующих условиях. Это явление объясняется меньшей компактностью изогнутой структуры ДНК, затрудняющей ее прохождение через поры геля. Таким образом, особенности геометрии модельных 16-звенных ДНК-дуплексов, несущих модификацию nFluL или nFluS в одной из цепей, могут быть определены на основе данных об их подвижности в геле при электрофорезе в неденатурирующих условиях. Радиоавтограф геля, полученный в результате эксперимента, представлен на рис. 3.

 

Рис. 3. Сравнение электрофоретической подвижности 16-звенных ДНК-дуплексов. Радиоавтограф геля после проведения электрофореза в неденатурирующих условиях. 1 – nFluS-дцДНК, 2 – nFluL-дцДНК, 3 – НМ-дцДНК

 

Согласно результатам обсчетов по формуле (см. «Определение угла изгиба ДНК-дуплексов»), nFluL-содержащий ДНК-дуплекс изогнут сильнее – угол изгиба для него составляет 165.40 ± 0.95°, что совпадает с данными, полученными ранее [17, 25], в то время как для nFluS-дцДНК угол изгиба составил 170.64 ± 0.83°. Эти различия в перегибе сахарофосфатного остова двух эффективно процессируемых субстратов могут быть обусловлены различиями во взаимодействии флуоресцеинового фрагмента повреждений с азотистыми основаниями соседних нуклеотидных звеньев. Согласно результатам моделирования молекулярной динамики ДНК-дуплекс, содержащий nFluL, наряду с преимущественным нахождением флуоресцеинового фрагмента вне дуплекса, показал высокую подвижность в области введения повреждения; наблюдалась динамика возникновений/исчезновений изгиба в области повреждения на достаточно большой угол (~135°) [17]. Структура nFluS позволяет предполагать, что в этом случае Flu не склонен к выворачиванию, что может быть связано с преимущественным расположением флуоресцеинового фрагмента nFluS внутри дуплекса. Стоит также отметить, что, несмотря на меньшую степень изгиба nFluS-ДНК по сравнению с nFluL-ДНК, nFluS удалялся более эффективно белками экстракта клеток HeLa. Тем не менее эффективность репарации объемного аддукта не всегда коррелирует со степенью изгиба спирали ДНК, что показано нами ранее [11].

Сравнение термической стабильности дуплексов

Методом термической денатурации с оптической регистрацией сигнала определены термическая стабильность и термодинамические характеристики формирования ДНК-дуплексов длиной 16 п.н. Проведена регистрация зависимости величины оптической плотности растворов ДНК-дуплексов от температуры. Анализ кривых термической денатурации различных субстратов показал, что гипохромный эффект в случае дуплекса без модификации выражен более заметно, чем у дуплексов, содержащих ненуклеотидное звено. Согласно расчетам, гипохромный эффект НМ-ДНК составляет 14.75%, nFluL-ДНК 13.5%, nFluS-ДНК 14.3%. На нормированных графиках зависимости оптической плотности от температуры видны различия в термостабильности ДНК-дуплексов (рис. 4).

 

Рис. 4. График зависимости оптической плотности ДНК-дуплексов на длине волны 260 нм от температуры

 

Наиболее стабильным оказался ДНК-дуплекс без модификации, T_m составила 67.6 ± 0.3°C; у nFluL-дуплекса T_m составила 55.6 ± 0.3°C и наименее термостабильным оказался nFluS-дуплекс (T_m = 51.5 ± 0.3°C). Таким образом, присутствие повреждений nFluL и nFluS сильнее, чем присутствие другого ненуклеотидного повреждения – nAnt (T_m для nAnt-ДНК составляет 59.6 ± 0.2°С) [16], однако nFluS дестабилизирует двухцепочечную структуру дуплексов наиболее заметно. Ранее с использованием компьютерного моделирования мы показали, что флуоресцеиновые фрагменты синтетических азотистых оснований, связанные с сахарофосфатным остовом ДНК протяженными линкерами (Flu-dU и nFluL), взаимодействуют с азотистыми основаниями нуклеотидных звеньев соседних участков дцДНК, нарушая и дестабилизируя регулярную структуру этих участков. С использованием молекулярно-динамического моделирования показано, что флуоресцеиновый фрагмент nFlu способен выворачиваться из дуплекса и большую часть времени находиться снаружи [17, 25].

 

Рис. 5. График в линейных координатах Вант-Гоффа для немодифицированного ДНК-дуплекса и дуплексов, содержащих повреждение nFlu (nFluL) и (nFluS)

 

Таблица 2. Термодинамические данные и температура плавления ДНК-дуплексов

ДНК-дуплекс	ΔS°, кал/моль×К	ΔH°, ккал/моль	ΔG°37, ккал/моль	Tm (20 мкM), °C
НМ-ДНК	-382 ± 167	-140.0 ± 56.7	-20.2 ± 4.8	67.6 ± 0.3**
nFluL-ДНК	-339 ± 187	-119.4 ± 61.2	-14.3 ± 3.2	55.6 ± 0.3**
nFluS-ДНК	-295 ± 104	-103.5 ± 33.5	-12.0 ± 1.2	51.5 ± 0.3**

**Стандартное отклонение для температуры взято исходя из погрешности измерительного прибора.

 

Полученные нами данные дают основание полагать, что более существенное снижение термостабильности nFluS-содержащего дуплекса (по сравнению с nFluL-содержащим) может быть связано с преимущественным расположением флуоресцеинового фрагмента nFluS внутри существенно искажаемого его присутствием дуплекса и его взаимодействиями с азотистыми основаниями ближайших нуклеотидных звеньев [26]. С использованием минимизации суммы квадратов отклонений между экспериментальной и теоретической кривой термической денатурации проведен расчет термодинамических параметров плавления. Значения ∆S° и ∆H° определяли путем линеаризации выражения в координатах 1000/T_пл и ln(C_t/4) (координаты Вант-Гоффа) и построения линейной зависимости обратной величины температуры плавления от логарифма концентрации ln(C_t/4) методом наименьших квадратов. Графики, представленные на рис. 5, результаты расчетов термодинамических параметров в табл. 2 также говорят о повышенной способности nFluS к дестабилизации двухцепочечной структуры окружающей ДНК по сравнению с nFluL.

Спектрометрическое титрование

Метод спектрометрического титрования в сочетании с другими подходами позволяет на основе данных об изменениях спектральных характеристик, обусловленных формированием дуплекса, сделать вывод о наличии тех или иных взаимодействий. Наиболее заметные различия между двумя повреждениями, содержащими объемный карбоксифлуоресцеиновый фрагмент, выявлены при сравнительном изучении ДНК-дуплексов, содержащих объемные модификации nFluL и nFluS, с помощью спектрометрического титрования. Использование этого метода в сочетании с другими подходами позволяет на основе данных об изменениях спектральных характеристик при формировании дуплекса сделать выводы о взаимодействиях, в которые вовлекается (или не вовлекается) флуоресцентная группировка. Образцы содержали модифицированные цепи nFluS или nFluL в постоянной концентрации 5.4 мкМ; концентрация комплементарной ДНК варьировала. Контрольные образцы в каждой серии содержали только модифицированную цепь. Измерения проводили после проведения гибридизации цепей. Спектры оптического поглощения представлены на рис. 6.

 

Рис. 6. Спектры оптического поглощения образцов, содержащих nFluS-ДНК (А) или nFluL-ДНК (Б) в постоянной концентрации 5.4 мкМ. Указаны соотношения концентраций в образцах, содержащих модифицированную (nFluS- или nFluL) и немодифицированную (НМ) цепи, формирующие дуплексы

 

На длине волны 260 нм наблюдалось постепенное увеличение оптической плотности обеих серий образцов, происходящее в результате увеличения суммарной концентрации ДНК в смеси, в то время как на длине волны 495 нм (максимум поглощения флуоресцеина) характер изменения оптической плотности образцов, содержащих nFluS-ДНК и nFluL-ДНК, менялся по мере увеличения содержания в образцах комплементарной цепи, а следовательно, и двухцепочечных структур.

Сравнение оптического поглощения nFluS-ДНК и nFluL-ДНК, полученных при их титровании немодифицированной ДНК, показывает, что в области максимального поглощения нуклеотидов (260 нм) в обеих сериях ДНК наряду с ростом оптической плотности наблюдается одинаковый по величине гипохромный эффект, обусловленный формированием дуплексов (рис. 6). Характер изменений оптической плотности вблизи максимума поглощения флуоресцеина (495 нм) при этом отличается: в случае ДНК-дуплексов, содержащих nFluS, гипохромный эффект, проявляющийся при максимальной концентрации неповрежденной цепи, составляет 40%, в то время как у ДНК-дуплексов, содержащих nFluL, он не превышает 20% (рис. 6).

Ранее на примере спектров поглощения ДНК-дуплексов, которые содержали цис- и транс-B[α]P-N2-dG-повреждения, было показано, что образование дуплексов, в которых аддукт B[α]P формировал прочные интеркаляционные комплексы, сопровождается гипохромным эффектом, проявляющимся в области поглощения пиренильных колец B[α]P [27]. Таким образом, результаты спектрофотометрического титрования показывают, что, хотя присутствие повреждения с более протяженным спейсерным фрагментом приводит к локальной дестабилизации ДНК, достаточной для эффективного распознавания и удаления nFluL белками системы ЭРН, его флуоресцеинилкарбамоильный фрагмент не образует устойчивых сэндвич-структур либо других комплексов, формирование которых приводит к заметным изменениям в спектре, что коррелирует с данными недавно выполненного моделирования МД-траекторий nFuL-cодержащих ДНК [17].

 

Рис. 7. Спектры возбуждения флуоресценции в диапазоне 420–520 нм в сериях образцов, содержащих nFluS-ДНК (А) или nFluL-ДНК (Б), в концентрации 5.4 мкМ и комплементарную цепь без модификаций (НМ)

 

Наиболее наглядные результаты, позволяющие судить о причинах, лежащих в основе различий двух флуоресцеиновых повреждений, получены при сравнении спектров флуоресценции двух серий образцов, содержащих nFluS-ДНК либо nFluL-ДНК и немодифицированную цепь ДНК в таких же соотношениях, как и в экспериментах по анализу изменения оптических спектров.

Полученные спектры возбуждения и испускания ДНК-дуплексов с повреждениями nFluS и nFluL представлены на рис. 7 и 8 соответственно. Спектры возбуждения флуоресценции записывали при фиксированной длине волны испускания 548 нм; длина волны возбуждения изменялась в диапазоне 420–520 нм с шагом 1 нм (рис. 7А,Б соответственно). Спектры испускания, представляющие собой зависимость интенсивности испускания света флуорофором (Flu) от длины волны возбуждающего света, снимали в диапазоне 500–600 нм с шагом измерения 1 нм при фиксированной длине волны возбуждающего света 533 нм (рис. 8А,Б).

 

Рис. 8. Спектры испускания флуоресценции в серии образцов, содержащих nFluS (А) или nFluL (Б), в концентрации 5.4 мкМ и комплементарную цепь без модификаций (НМ)

 

Интенсивность флуоресценции образцов, содержащих nFluS-ДНК, заметно и последовательно уменьшается по мере увеличения концентрации комплементарной цепи, в то время как в случае образцов, содержащих nFluL-ДНК, в структуре которого есть протяженный линкер, интенсивность флуоресценции практически не изменяется (рис. 7А и 8А).

Таким образом, результаты спектрометрического титрования с большой уверенностью позволяют предполагать, что при образовании дуплекса флуоресцеинилкарбамоильный фрагмент повреждения nFluS располагается внутри дуплекса и способен взаимодействовать с гуанинами ближайших к повреждению звеньев ДНК аналогично тому, как это описано для некоторых вариантов расположения флуоресцеиновой модификации в дуплексе [26].

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В соответствии с нашим предположением, nFluS (N-[6-(5(6)-флуоресцеинилкарбамоил)]-3-амино-1,2-пропандиол) представляет собой аналог объемного повреждения, эффективность специфической эксцизии которого из модельной ДНК выше, чем у nFluL (N-[6-(5(6)-флуоресцеинилкарбамоил)-гексаноил]-3-амино-1,2-пропандиола). В результате сравнительного исследования особенностей геометрии, термодинамических характеристик, анализа спектров оптического поглощения, а также спектров флуоресценции модельных ДНК-дуплексов, содержащих nFluS или nFluL, показано, что увеличение эффективности специфической эксцизии nFluS по сравнению с nFluL ассоциировано с обусловленной взаимодействием флуоресцеинилкарбамоильного фрагмента с соседними азотистыми основаниями дцДНК дополнительной дестабилизацией двухцепочечной структуры ДНК. При этом расположение дестабилизированного участка в nFluS-содержащих дцДНК, вероятно, способствует формированию продуктивных комплексов XPC–ДНК, внося вклад в улучшение субстратных свойств nFluS-ДНК в реакции специфической эксцизии. Для подтверждения последнего предположения необходимо проведение экспериментов по молекулярному моделированию.

 

Работа выполнена при финансовой поддержке РНФ (проект № 19-74-10056П).

Об авторах

А. А. Попов

Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН

Email: irapetru@niboch.nsc.ru
Россия, Новосибирск, 630090

В. М. Голышев

Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН

Email: irapetru@niboch.nsc.ru
Россия, Новосибирск, 630090

Л. С. Королева

Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН

Email: irapetru@niboch.nsc.ru
Россия, Новосибирск, 630090

К. Д. Назаров

Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН

Email: irapetru@niboch.nsc.ru
Россия, Новосибирск, 630090

Р. О. Анарбаев

Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН

Email: irapetru@niboch.nsc.ru
Россия, Новосибирск, 630090

И. О. Петрусева

Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН

Автор, ответственный за переписку.
Email: irapetru@niboch.nsc.ru
Россия, Новосибирск, 630090

Список литературы

Дополнительные файлы