Липополисахарид-индуцированное острое повреждение легких: анализ особенностей развития и возможность подавления аптамером к TNF-α

Полный текст

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ОПЛ – острое повреждение легких; ОРДС – острый респираторный дистресс-синдром; TNF-α – фактор некроза опухоли альфа; aptTNF-α – аптамер к TNF-α; PEG – полиэтиленгликоль; ЛПС – липополисахарид; БАЛЖ – бронхоальвеолярная жидкость.

ВВЕДЕНИЕ

Острое повреждение легких (ОПЛ), а также его последствие – острый респираторный дистресс-синдром (ОРДС) – являются специфической формой воспаления легких, которое характеризуется диффузным повреждением альвеол, некардиогенным отеком легких, а также легочным и системным нейтрофил-ассоциированным воспалением [1, 2]. Этиологическими факторами ОПЛ и ОРДС могут быть различные стимулы и заболевания, такие, как бактериальные и вирусные пневмонии [3, 4], механическая вентиляция [5, 6], воздействие химикатов [7, 8], острая травма головного мозга [9], сепсис [10, 11], острый панкреатит [12] и многие другие патологии. В последние годы рост показателей заболеваемости и смертности от ОПЛ/ОРДС связан с пандемией новой коронавирусной инфекции (COVID-19), вызванной коронавирусом, ассоциированным с тяжелым острым респираторным дистресс-синдромом (SARS-CoV-2) [13, 14]. Патогенез ОПЛ/ОРДС включает развитие местной и системной каскадной воспалительной реакции, сопровождающейся подъемом уровней провоспалительных цитокинов (TNF-α, IFN-γ, IL-6, IL-1β, GM-CSF, G-CSF) и хемокинов (CXCL10/IP10, MIP-1α, CCL2), вплоть до критических значений, приводящих к развитию полиорганной недостаточности [14–16].

В настоящее время терапия ОРДС и сопутствующих ему иммунных нарушений в основном симптоматическая, направлена на облегчение симптомов и часто включает механическую вентиляцию легких и введение кортикостероидных гормонов. Перспективным подходом к лечению указанной патологии может быть использование молекулярно-генетических инструментов, направленных на ключевые цитокины в качестве мишени. Одним из таких инструментов являются моноклональные антитела к TNF-α, IL-6, IL-1β, IFN-γ и другим компонентам цитокинового сигналинга [17, 18]. Олигонуклеотидные аптамеры представляют собой другой класс биомолекул, селективно узнающих мишень, которые в настоящее время рассматриваются в качестве потенциальной альтернативы антителам для создания таргетных терапевтических средств. От антител аптамеры выгодно отличают воспроизводимый химический синтез и стабильность ключевых характеристик, возможность введения в их состав дополнительных химических модификаций для регуляции времени жизни аптамера в организме с сохранением его сродства к молекуле-мишени [19, 20]. Важно отметить, что по своей природе аптамеры являются нуклеиновыми кислотами, что позволяет дополнительно регулировать их функциональную активность, используя комплементарный олигонуклеотид-антидот [21, 22]. Такой набор свойств вызывает интерес к использованию аптамеров для подавления активности растворимых сывороточных белков, в том числе ассоциированных с воспалением [23, 24].

В настоящей работе проанализированы особенности развития ЛПС-индуцированного ОПЛ у мышей, а также возможность его подавления аптамером к провоспалительному цитокину TNF-α. Показано, что TNF-α является ключевым игроком в развитии ОПЛ, а интраназальное введение мышам с ОПЛ аптамера к TNF-α, конъюгированного с полиэтиленгликолем 40 кДа (PEG-aptTNF-α), подавляет развитие воспаления в дыхательной системе экспериментальных животных.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Синтез ДНК-аптамера к TNF-α и контрольного олигонуклеотида

Нуклеотидные последовательности олигодезоксирибонуклеотидов, использованных в работе, представлены в табл. 1. Контрольный неаптамерный олигонуклеотид со случайной последовательностью был сгенерирован на основе ДНК-аптамера aptTNF-α с использованием сервиса (https://www.gensm/tools/create-scrambled-sequence).

 

Таблица 1. ДНК-аптамер к TNF-α, неаптамерный скрамблированный олигодезоксирибонуклеотид и их конъюгаты с PEG

Аптамер	Нуклеотидная последовательность, 5’-3’
PEG-aptTNF-α	PEG-NH2-(CH2)6-GCG CCA CTA CAG GGG AGC TGC CAT TCG AAT AGG TGG GCC GCTinv
aptTNF-α	NH2-(CH2)6-GCG CCA CTA CAG GGG AGC TGC CAT TCG AAT AGG TGG GCC GCTinv
PEG-Scr	PEG-NH2-(CH2)6-AGA GGC GGT ATG ACC AGG CTA ATC GGC CGA GCC TCC GTG CGTinv
Scr	NH2-(CH2)6-AGA GGC GGT ATG ACC AGG CTA ATC GGC CGA GCC TCC GTG CGTinv

PEG – остаток полиэтиленгликоля 40 кДа; T_inv – 3’-концевой остаток тимидина, соединенного с соседним нуклеотидом 3’–3’-фосфодиэфирной связью.

 

Олигонуклеотиды были синтезированы твердофазным фосфитамидным методом в масштабе 0.4 мкмоль на автоматическом ДНК/РНК-синтезаторе ASM-800 («Биоссет», Россия) по протоколу, оптимизированному для данного прибора, с использованием β-цианэтил-N,N-диизопропилфосфитамидов 5’-N-защищенных 2’-дезоксирибонуклеозидов (Glen Research, США). В качестве полимерного носителя использовали стеклянные частицы CPG (controlled pore glass) с диаметром пор 500 Å с присоединенным через 5’-гидроксильную группу 3’-O-диметокситритилтимидином (Glen Research). Олигонуклеотиды, содержащие на 5’-конце остаток аминогексанола, синтезировали с использованием коммерчески доступного модификатора 6-(трифторацетиламино)-гексил-(2-цианоэтил)-(N,N-диизопропил)-фосфитамида (Glen Research). После синтеза олигонуклеотиды отделяли от носителя и удаляли защитные группы обработкой 40% водным раствором метиламина (300 мкл) в течение 15 мин при 65°C. Полностью деблокированные олигонуклеотиды очищали методом препаративного электрофореза в денатурирующем 15% полиакриламидном геле (ПААГ).

Синтез конъюгатов с полиэтиленгликолем 40 кДа

Для синтеза пегилированных конъюгатов к раствору 5’-аминомодифицированного олигонуклеотида (0.1 мкмоль) в 0.1 М тетраборатном буфере (рН 9.5) добавляли раствор 1 мкмоль N-гидроксисукцинимидного эфира линейного полиэтиленгликоля (PEG) с молекулярной массой 40 кДа (Sigma-Aldrich, США) в диметилформамиде (Sigma-Aldrich). Реакционную смесь инкубировали при перемешивании при 25°С в течение 16 ч. Полученные конъюгаты очищали от избытка реагентов с помощью электрофореза в денатурирующем 12% ПААГ с последующей элюцией водой и концентрированием с использованием ультрацентрифужных модулей Amicon 10K (Merck, США). Очищенные конъюгаты перед введением животным стерилизовали фильтрованием через фильтр с диаметром пор 0.22 мкм.

Лабораторные животные

В работе использовали 6–8-недельных мышей-самок линии Balb/C разведения вивария Института химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН (Новосибирск, Россия). Животных содержали по шесть особей в клетке в хорошо освещенном помещении. Мыши имели свободный доступ к еде и воде. Все процедуры с животными проводили в соответствии с рекомендациями по правильному использованию и уходу за лабораторными животными (Директива ЕС 2010/63/ЕС). Эксперименты на животных одобрены межинститутской Комиссией по биоэтике Института цитологии и генетики СО РАН (Новосибирск, Россия) (протокол № 56 от 10.08.2019 г.).

ЛПС-индуцированное острое повреждение легких

Острое повреждение легких (ОПЛ) у мышей индуцировали путем интраназального (и/н) введения ЛПС (055:B5, Sigma-Aldrich) в дозе 10 мкг/мышь под изофлюрановой анестезией. В эксперименте по исследованию динамики воспалительных изменений в дыхательной системе мышей выводили из эксперимента через 6, 16 и 24 ч после индукции и производили забор бронхоальвеолярной жидкости (БАЛЖ), сыворотки крови и ткани легких для последующего анализа. В эксперименте по исследованию противовоспалительной активности аптамеров к TNF-α мышам через 1 ч после индукции ОПЛ и/н вводили аптамер aptTNF-α в дозе 1 мг/кг или его конъюгат PEG-aptTNF-α в дозах 1 и 5 мг/кг. Мышей с ОПЛ без лечения и получавших соответствующие скрамблированные олигонуклеотиды (Scr в дозе 1 мг/кг и PEG-Scr в дозах 1 и 5 мг/кг) использовали в качестве контроля. Все препараты вводили и/н в 50 мкл физиологического раствора под изофлюрановой анестезией. Мышей выводили из эксперимента через 24 ч после индукции и производили забор материала (БАЛЖ и ткань легких) для последующего анализа. Всего было по шесть мышей в каждой группе.

Анализ бронхоальвеолярной жидкости

Легкие мышей из контрольных и экспериментальных групп промывали 1 мл холодного физиологического раствора. Собранную БАЛЖ центрифугировали на 1500 об/мин в течение 10 мин при 4°C, супернатант собирали для иммуноферментного анализа (ИФА). Осадок клеток ресуспендировали в 50 мкл физиологического раствора и определяли общее число лейкоцитов (×10⁵ клеток/мл) в камере Горяева после разбавления раствором Тюрка в соотношении 1 : 20.

Оценка уровня провоспалительных цитокинов методом ИФА

Уровни провоспалительных цитокинов TNF-α и IL-6 определяли в образцах БАЛЖ с помощью наборов для проведения ИФА (#BMS607-3 и #KMC0061, Thermo Fisher Scientific, США) в соответствии с инструкциями производителя. Абсорбцию измеряли на длине волны 450 нм с помощью спектрофотометра Multiscan RC (Thermo Labsystems, Финляндия).

Оценка профиля цитокинов

Для оценки уровня провоспалительных цитокинов и хемокинов в БАЛЖ использовали LEGENDplex^TM Mouse Inflammation Panel (13-plex) (Biolegend, США) в соответствии с инструкцией производителя и проточный цитометр NovoCyte 3000 (ACEA Bioscience, США). Данные анализировали с помощью программного обеспечения Legendplex online software.

Гистология

Ткань легких фиксировали в 10% забуференном формалине, дегидратировали в растворах этанола и ксилола восходящей концентрации и заключали в парафин HISTOMIX. Парафиновые срезы толщиной до 5 мкм нарезали на микротоме Microm HM 355S и окрашивали гематоксилином и эозином. Все гистологические препараты были исследованы и отсканированы с помощью микроскопа Axiostar Plus с цифровой камерой AxioCam MRc5 на увеличении ×200.

Оценку интенсивности воспалительных изменений в легких проводили полуколичественным методом с использованием следующей шкалы: 0 – патологические изменения отсутствуют, 1 – воспаление выражено слабо, 2 – воспаление выражено умеренно, 3 – выраженные воспалительные изменения. Всего проанализировано по пять полей зрения в каждом образце (по 30 полей зрения в каждой группе).

Определение уровней экспрессии генов методом ОТ-ПЦР в реальном времени

Уровни мРНК генов Usp18, Traf1, Tnfaip3 и Hprt в ткани легких определяли методом количественной обратной транскрипции-полимеразной цепной реакции (ОТ-ПЦР) в реальном времени. Суммарную РНК выделяли из легких экспериментальных животных с помощью реагента TRIzol согласно инструкции производителя с предварительной гомогенизацией (гомогенизатор FastPrep-24TM 5G с адаптером QuickPrep 24, MP Biomedicals, США). кДНК синтезировали с использованием RT-буфера и ревертазы M-MuLV-RH («Биолабмикс», Россия) согласно инструкции производителя. ОТ-ПЦР в реальном времени проводили с использованием мастер-микса HS-qPCR (×2) («Биолабмикс») согласно инструкции производителя. Амплификацию проводили с использованием температурных условий: (1) – 94°С, 5 мин; (2) 94°С, 10 с; (3) 60°С, 30 с (50 циклов) на амплификаторе C1000 Touch с модулем CFX96 (Bio-Rad, США). Данные обрабатывали с помощью программного обеспечения BioRad CFX Manager. Последовательности олигонуклеотидов, использованных в качестве праймеров, приведены в табл. 2. Относительный уровень экспрессии генов нормализовали на уровень экспрессии Hprt по методу ΔΔСt.

 

Таблица 2. Специфические праймеры для проведения ОТ-ПЦР в реальном времени

Ген	Тип праймера	Нуклеотидная последовательность
Usp18	Forward	5’- GCCCTCATGGTCTGGTTG-3’
	Probe	5’-((5,6)-FAM)-ACGTGTTGCCTTAACTCCTTGCTTCA-BHQ1-3’
	Reverse	5’- CACTTCTCTTCCTCTCTTCTGC-3’
Traf1	Forward	5’- AGATCACCAATGTCACCAAGC-3’
	Probe	5’-((5,6)-FAM)-ACTGTCAGCCTCTTCTCTCCAGCTT-BHQ1-3’
	Reverse	5’- CATCCCCGTTCAGGTACAAG-3’
Tnfaip3	Forward	5’- AGCCAGCACTTTGTACCC-3’
	Probe	5’-((5,6)-FAM)-AGTCTTCAAACCTACCCCGGTCTCT-BHQ1-3’
	Reverse	5’- GCTTTTCCTTCATCTCATTCTCAG-3’
Hprt	Forward	5’-CCCCAAAATGGTTAAGGTTGC-3’
	Probe	5’- ((5,6)-ROX)-CTTGCTGGTGAAAAGGACCT-3’-BHQ2
	Reverse	5’-AACAAAGTCTGGCCTGTATCC-3’

 

Статистический анализ

Статистический анализ проводили с помощью двухстороннего непарного t-теста по Стьюденту в программном обеспечении Microsoft Excel. Значения p ≤ 0.05 считали статистически значимыми. Данные представлены как среднее значение ± стандартное отклонение.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Цитокиновый профиль и динамика воспалительных изменений в дыхательной системе мышей с ЛПС-индуцированным острым повреждением легких

Для оценки уровня цитокинов и интенсивности воспаления в дыхательной системе мышей в динамике индуцировали острое повреждение легких (ОПЛ) путем интраназального (и/н) введения ЛПС (10 мкг/мышь) с последующим забором материала через 6, 16 и 24 ч после индукции (рис. 1А). Установлено, что уже через 6 ч после введения ЛПС уровень TNF-α в бронхоальвеолярной жидкости (БАЛЖ) повышался в 21 раз по сравнению со здоровыми животными и составлял 3.4 нг/мл, оставаясь приблизительно на том же уровне вплоть до 24 ч после индукции. Уровень IL-6 также повышался через 6 ч после введения ЛПС до 2 нг/мл, а затем постепенно снижался до 1.3 нг/мл к 24 ч после индукции, что многократно превышает уровень IL-6 у здоровых животных (рис. 1Б, левая панель). Оценка общего числа лейкоцитов в БАЛЖ показала, что максимальное значение данного показателя приходилось на 24 ч после индукции: введение ЛПС вызывало повышение числа лейкоцитов в 8.6 раза по сравнению со здоровыми животными (рис. 1Б, средняя панель). В сыворотке крови мышей с ОПЛ TNF-α и IL-6 детектировались во всех временных точках на крайне низком уровне, сопоставимом с уровнями у здоровых животных (рис. 1Б, правая панель).

 

Рис. 1. Цитокиновый профиль и воспалительные изменения в дыхательной системе мышей с ЛПС-индуцированным острым повреждением легких в динамике. А – схема эксперимента. У мышей линии Balb/C индуцировали острое повреждение легких (ОПЛ) путем интраназального (и/н) введения ЛПС (10 мкг/мышь). Забор материала проводили через 6, 16 и 24 ч после индукции. Б – уровни провоспалительных цитокинов (TNF-α и IL-6) и общее число лейкоцитов в БАЛЖ, а также уровни TNF-α и IL-6 в сыворотке крови мышей с ОПЛ через 6, 16 и 24 ч после индукции. В – цитокиновый профиль БАЛЖ мышей с ОПЛ в динамике, оцененный с помощью мультиплексного ИФА. Данные приведены в виде пг/мл. Г – гистологический анализ ткани легких мышей с ОПЛ через 6, 16 и 24 ч после индукции. Окр. гематоксилином и эозином, ув. ×200. Черными стрелками обозначена воспалительная инфильтрация. К – контроль (здоровые животные)

 

Определение цитокинового профиля БАЛЖ мышей с ОПЛ в динамике с помощью мультиплексного ИФА показало, что и/н введение ЛПС вызывает значимое повышение только двух провоспалительных цитокинов: TNF-α и IL-6. Причем уровень TNF-α оставался высоким на протяжении всего периода наблюдения, тогда как уровень IL-6 снижался уже через 16 ч после индукции (рис. 1В). Уровни остальных цитокинов (IL-23, IL-1α, IFN-γ, MCP-1, IL-12p70, IL-1β, IL-10, IL-27, IL-17A, IFN-β, GМ-CSF) не изменялись.

Гистологический анализ ткани легких мышей с ОПЛ показал, что введение ЛПС вызывает развитие патологических изменений в дыхательной системе, представленных воспалительной гранулоцитарной инфильтрацией, деструктивными (десквамация альвеолярного эпителия) и дисциркуляторными (венозное полнокровие, отек и кровоизлияния) нарушениями (рис. 1Г). Следует отметить, что на разных сроках наблюдения степень выраженности данных изменений была различной: через 6 ч после индукции преобладали изменения, связанные с нарушением кровообращения, через 16 ч появлялись начальные признаки миграции клеток к очагу воспаления, тогда как к 24 ч воспалительная инфильтрация в ткани легких была полностью сформирована, локализуясь преимущественно вокруг сосудов и бронхов (рис. 1Г).

Таким образом, определение динамики воспалительных изменений и цитокинового профиля мышей с ОПЛ показало, что именно TNF-α остается на стабильно высоком уровне на протяжении всего периода наблюдения, свидетельствуя о важной роли данного цитокина в сигнальных путях воспалительного ответа. Морфологические признаки воспаления, вызванные ЛПС в дыхательной системе мышей, были наиболее выражены через 24 ч после индукции, делая данный временной интервал оптимальным для оценки противовоспалительной активности исследуемых конструкций.

Выбор и синтез ДНК-аптамера к TNF-α

На данный момент опубликовано несколько нуклеотидных последовательностей РНК- и ДНК-аптамеров, способных специфично связывать TNF-α [25]. Большинство из них обладают сродством к белку-мишени в наномолярном диапазоне и способны ингибировать функциональную активность TNF-α in vitro. Для исследования был выбран ДНК-аптамер aptTNF-α, который, как показано ранее, обладает способностью подавлять развитие воспаления в in vivo моделях острого повреждения легких и печени при его внутривенном или интратрахеальном введении [26]. Общая длина этого аптамерного олигонуклеотида составляет 41 нуклеотид, что делает его химический синтез достаточно быстрым и экономичным (последовательность aptTNF-α приведена в табл. 1). В качестве аналогичной неаптамерной ДНК для контроля специфичности действия аптамера использовали скрамблированный олигонуклеотид той же длины и нуклеотидного состава. Противовоспалительная активность бивалентных аптамеров in vivo, в которых два аптамерных модуля ковалентно соединены остатком полиэтиленгликоля 20 кДа, была показана ранее [26]. В нашей работе мы выбрали другую стратегию химической модификации аптамера для увеличения времени его жизни в организме животных и использовали модификации, которые в настоящее время являются практически «золотым стандартом» для аптамеров, предназначенных для экспериментов in vivo или клинических исследований [27, 28]. На 3’-конец для защиты от экзонуклеазного гидролиза был введен дополнительный остаток тимидина, присоединенный 3’-3’-фосфодиэфирной связью, для чего при твердофазном синтезе олигонуклеотидов использовали коммерчески доступный полимерсвязанный 3’-О-диметокситритилтимидин, а на 5’-конец вводили полиэтиленгликоль (PEG) с молекулярной массой 40 кДа для улучшения фармакокинетических характеристик аптамера при его топической доставке в дыхательную систему мышей.

Таким образом, предложенный нами вариант аптамерной конструкции обеспечивает более контролируемый синтез и выделение пегилированного конъюгата, поскольку при детектированных нами уровнях TNF-α в БАЛЖ (не более 4 нг/мл) этот белок с высокой вероятностью представлен мономерной, а не тримерной формой [29]. Аналогичный набор модификаций использован и для контрольного неаптамерного олигонуклеотида.

Противовоспалительная активность аптамера к TNF-α на модели ЛПС-индуцированного острого повреждения легких

Противовоспалительную активность аптамеров к TNF-α (aptTNF-α и PEG-aptTNF-α) изучали на модели ЛПС-индуцированного ОПЛ. Аптамеры вводили мышам интраназально, поскольку высокий уровень данного цитокина детектировался именно в БАЛЖ. В качестве контроля специфичности действия аптамера мышам вводили соответствующие скрамблированные олигонуклеотиды (Scr или PEG-Scr). Исследуемые конструкции вводили через 1 ч после индукции ОПЛ с последующим забором материала через 24 ч (рис. 2А), поскольку именно в эту временную точку морфологические изменения в дыхательной системе мышей были наиболее выражены и окончательно сформированы.

 

Рис. 2. Влияние аптамеров к TNF-α на развитие ЛПС-индуцированного острого повреждения легких у мышей.А – схема эксперимента. У мышей линии Balb/C индуцировали острое повреждение легких (ОПЛ) путем интраназального (и/н) введения ЛПС (10 мкг/мышь). Через 1 ч после индукции мышам и/н вводили аптамеры к TNF-α: aptTNF-α в дозе 1 мг/кг и PEG-aptTNF-α в дозах 1 и 5 мг/кг. Мышей с ОПЛ без лечения и получавших соответствующий скрамблированный олигонуклеотид (Scr и PEG-Scr) использовали в качестве контролей. Мышей выводили из эксперимента через 24 ч после индукции и производили забор материала для последующего анализа.Б, В – общее число лейкоцитов (Б) и уровень TNF-α (В) в БАЛЖ мышей с ЛПС-индуцированным ОПЛ без лечения и после введения аптамеров к TNF-α. Г, Д – гистологическое исследование (Г) и полуколичественная оценка интенсивности воспалительных изменений (Д) в легких мышей контрольных и экспериментальных групп. Окр. гематоксилином и эозином, ув. ×200. Черными стрелками обозначена воспалительная инфильтрация. Для оценки воспаления в легких использована следующая шкала: 0 – патологические изменения отсутствуют, 1 – воспаление выражено слабо, 2 – воспаление выражено умеренно, 3 – выраженные воспалительные изменения. Данные представлены как среднее ± стандартное отклонение; *p < 0.05, **p < 0.01

 

Введение ЛПС вызывало повышение общего числа лейкоцитов в БАЛЖ мышей с ОПЛ в 7.7 раза по сравнению со здоровыми животными (рис. 2Б). Введение aptTNF-α или соответствующего Scr не влияло на данный показатель, тогда как введение пегилированного аптамера PEG-aptTNF-α в дозе 5 мг/кг достоверно снижало общее число лейкоцитов в БАЛЖ в 1.8 раза по сравнению с контролем и в 2.7 раза по сравнению с PEG-Scr, введенным в той же дозе (рис. 2Б). PEG-aptTNF-α в дозе 1 мг/кг также вызывал снижение данного показателя в 1.5 и 1.8 раза по сравнению с контролем и Scr соответственно. Данные различия (для дозы 1 мг/кг) оказались статистически недостоверными, однако они показывают дозозависимый характер действия PEG-aptTNF-α. Уровень TNF-α в БАЛЖ мышей с ОПЛ был повышен в 85 раз по сравнению со здоровыми животными, а введение PEG-aptTNF-α не оказывало значительного влияния на этот показатель (рис. 2В). Уровень TNF-α после введения непегилированного аптамера не исследовали, поскольку данная конструкция не вызывала снижения общего числа лейкоцитов в БАЛЖ как одного из показателей противовоспалительного действия препарата.

Согласно результатам гистологического исследования, введение исследуемых конструкций вызывает дозозависимое снижение интенсивности описанных ранее морфологических проявлений ЛПС-индуцированного ОПЛ. Применение aptTNF-α и PEG-aptTNF-α в дозе 1 мг/кг приводило к снижению интенсивности воспалительных изменений в ткани легких – в 1.5 и 1.8 раза по сравнению с контролем и в 1.4 и 1.6 раза по сравнению с соответствующим Scr (рис. 2Г,Д). Однако эти различия были статистически значимыми только при сравнении аптамеров и контроля. Введение PEG-aptTNF-α в дозе 5 мг/кг вызывало статистически значимое снижение воспаления в ткани легких как по сравнению с группой контроля (в 2.2 раза), так и по сравнению с группой, получавшей PEG-Scr (в 2 раза).

Таким образом, аптамер PEG-aptTNF-α, направленный к провоспалительному цитокину TNF-α, блокирует развитие воспалительных изменений в дыхательной системе мышей, вызванных введением ЛПС, однако не нормализует показатели до уровня здоровых животных. Следует отметить дозозависимый характер противовоспалительного действия aptTNF-α/PEG-aptTNF-α, что, скорее всего, связано с более эффективным связыванием TNF-α при увеличении дозы препарата, а противовоспалительное действие достоверно показано только для конъюгата с PEG за счет улучшенных фармакокинетических характеристик препарата.

Анализ уровней экспрессии генов-мишеней TNF-α в ткани легких мышей с ЛПС-индуцированным острым повреждением легких без лечения и после введения аптамера к TNF-α

Следующим этапом нашего исследования были поиск и оценка уровней экспрессии генов – возможных мишеней TNF-α – при развитии ЛПС-индуцированного ОПЛ и при его коррекции аптамером к TNF-α для подтверждения влияния использованных конструкций на способность целевого секретируемого белка связываться со своим рецептором и активировать сигналинг. Выбор генов, а именно Usp18, Traf1 и Tnfaip3, сделан на основе опубликованных данных, согласно которым уровни их экспрессии повышаются под действием TNF-α при широком спектре биологических и патологических процессов, таких, как ЛПС-индуцированный сепсис [30], повреждение миокарда по типу ишемия-реперфузия [31], церебральная ишемия [32], активация сигнальных путей NF-kB и интерферонов типа I [33–36], а также гемопоэз и регенерация миелоидного ростка кроветворения [37].

Уровни экспрессии Usp18, Traf1 и Tnfaip3 были оценены в ткани легких мышей с помощью ОТ-ПЦР (рис. 3). Легкие здоровых животных характеризовались низким уровнем экспрессии исследуемых генов (принятым за 1), в то время как введение ЛПС приводило к значительному увеличению уровней их экспрессии (контроль): Usp18 в 7 раз, Traf1 в 2 раза и Tnfaip3 в 61 раз по сравнению со здоровыми животными.

В ходе оценки влияния аптамеров на экспрессию исследуемых генов в ткани легких мышей с ОПЛ были выявлены следующие закономерности. Введение PEG-aptTNF-α в дозе 1 мг/кг приводило к статистически значимому снижению уровня экспрессии гена Usp18 до уровня у здоровых животных: в 5.9 раза по сравнению с контролем и в 2.6 раза по сравнению с PEG-Scr. PEG-aptTNF-α в дозе 5 мг/кг также приводил к снижению уровня экспрессии Usp18 в 2.6 и 3 раза по сравнению с контролем и PEG-Scr соответственно. Однако статистически значимые отличия выявлены только между аптамером и скамблированным олигонуклеотидом (рис. 3). Введение PEG-aptTNF-α в дозах 1 и 5 мг/кг приводило к снижению экспрессии гена Traf1 в 3.5 и 2.6 раза по сравнению с контролем и в 1.8 и 1.7 раза по сравнению с PEG-Scr соответственно. Однако статистически значимой разницы в эффектах PEG-aptTNF-α и PEG-Scr в дозе 5 мг/кг не наблюдали (рис. 3). В случае гена Tnfaip3 единственным статистически значимым было снижение в 1.6 раза уровня экспрессии под действием PEG-aptTNF-α в дозе 1 мг/кг по сравнению с группой PEG-Scr (рис. 3). Введение PEG-Scr в дозах 1 и 5 мг/кг не оказывало статистически значимого влияния на экспрессию всех исследуемых генов. Введение aptTNF-α дозе 1 мг/кг приводило к статистически недостоверному снижению уровней экспрессии Usp18 и Traf1 в 1.7–2.4 раза, а в случае Tnfaip3 – к повышению его экспрессии (в 1.3 раза) по сравнению с контролем (рис. 3).

 

Рис. 3. Уровни экспрессии генов – возможных мишеней TNF-α (Usp18, Traf1 и Thfaip3) в ткани легких мышей с ЛПС-индуцированным острым повреждением легких без лечения и после введения аптамеров. Уровни экспрессии генов нормированы по уровню экспрессии Hprt, который использовали в качестве внутреннего стандарта. Три образца из каждой группы проанализированы в трех повторностях. Данные представлены как среднее ± стандартное отклонение; *p < 0.05, **p < 0.01

 

Таким образом, наиболее эффективное снижение уровней экспрессии потенциальных генов-мишеней зафиксировано при введении PEG-aptTNF-α в дозе 1 мг/кг, тогда как значимые противовоспалительные эффекты выявлены при использовании данного аптамера в дозе 5 мг/кг, что может быть связано с выбором времени определения уровней экспрессии этих генов, когда максимальное действие более высокой дозы аптамера на экспрессию TNF-α ассоциированных генов уже прошло.

ОБСУЖДЕНИЕ

TNF-α – плейотропный цитокин, продуцируемый активированными макрофагами, Т-лимфоцитами и натуральными киллерами – является одним из важнейших регуляторов иммунного ответа, поэтому воздействие на уровень этого цитокина может быть эффективной стратегией коррекции иммунных нарушений, ассоциированных с опухолевыми, воспалительными, обменными и инфекционными заболеваниями [38, 39]. Учитывая многообразие заболеваний и биологических процессов, в которых TNF-α принимает участие, количество генов и сигнальных путей, регулирующих и регулируемых TNF-α, исчисляется десятками [40, 41].

В настоящее время основными анти-TNF-α-препаратами, одобренными к применению в клинике, являются моноклональные антитела, которые, однако, вызывают такие побочные эффекты, как повышение чувствительности к инфекциям, развитие демиелинизирующих заболеваний и злокачественных новообразований [41]. Использование анти-TNF-α-средств другой природы, таких, как аптамеры, возможно, позволит сократить количество и тяжесть осложнений.

В данной работе противовоспалительная активность аптамера к TNF-α, а также влияние химических модификаций на эффективность его действия изучены на мышиной модели ЛПС-индуцированного ОПЛ. Следует отметить, что выбор способа введения аптамера обоснован и аргументирован данными профилирования уровня цитокинов в БАЛЖ и сыворотке крови при развитии ОПЛ у мышей в динамике. Показано, что уровень TNF-α в БАЛЖ значительно выше, чем в сыворотке крови, что свидетельствует о перспективности топического интраназального введения аптамера по сравнению с системным. Что касается доз аптамера, использованных в эксперименте, нами были выбраны концентрации, которые с высокой вероятностью должны обеспечивать целевой эффект, принимая во внимание, что концентрации пегилированных аптамеров в диапазоне 1–10 мг/кг являются оптимальными для in vivo экспериментов и клинических исследований [42].

Обнаружено, что PEG-aptTNF-α обладает более выраженным противовоспалительным действием, чем немодифицированный аналог, что может быть связано с его более длительным временем жизни в организме животных. PEG-aptTNF-α демонстрирует определенную дозозависимость: в дозе 5 мг/кг он был более эффективен, чем в дозе 1 мг/кг. Однако, несмотря на противовоспалительную активность, наблюдаемую в БАЛЖ и ткани легких, значимое снижение количества самого TNF-α в БАЛЖ не зафиксировано. Подобное расхождение может быть следствием того, что аптамер и анти-TNF-α-антитела, используемые в ИФА, могут связываться с разными пространственно удаленными эпитопами TNF-α, при этом взаимодействие с аптамером не влияет на связывание антител. Однако в отсутствие данных структурных исследований или молекулярного моделирования, которые бы указали, с каким именно эпитопом TNF-α происходит связывание анти-TNF-α-аптамера, эта гипотеза нуждается в дальнейшем подтверждении.

Поскольку прямое измерение уровня TNF-α не привело к ожидаемым результатам, было решено оценить эффект аптамера к TNF-α с помощью анализа количества мРНК генов, которые участвуют в регуляции и передаче сигнала TNF-α. В качестве потенциальных генов-мишеней TNF-α были выбраны гены, которые напрямую задействованы в регуляторном каскаде TNF-α и уровень которых повышается при развитии ОПЛ.

В начале сигналинга растворимая форма TNF-α связывается с рецептором TNF1 типа (TNFR1), вызывая тримеризацию рецептора и вовлечение в процесс белка домена смерти (TRADD) и серин-треониновой протеинкиназы 1 (RIPK1) (рис. 4). Далее TRADD взаимодействует с гетеродимером TRAF1/TRAF2, образуя комплекс I, который активирует сигнальный путь NF-kB и запускает синтез провоспалительных цитокинов, в том числе IFN-I [33]. В дальнейшем IFN-I воздействует через рецепторы IFNAR1/2 и сигнальный путь JAK/STAT на следующее важное звено в развитии воспалительного ответа – ось ISG15/USP18, которая регулирует активность иммунной системы [36] и снижает интенсивность воспалительного ответа, подавляя сигнальный путь JAK/STAT, что указывает на возможную петлю отрицательной обратной связи между USP18, IFN-I и, как следствие, TNF-α [43, 44].

 

Рис. 4. Общая схема сигналинга TNF-α

 

Другая ключевая молекула механизма обратной регуляции – белок 3, индуцируемый TNF-α (TNFAIP3), также известный как А20. Базальный уровень экспрессии TNFAIP3 низок в большинстве клеток, однако быстро возрастает при развитии воспалительного ответа [45]. TNFAIP3 рекрутируется в сигнальный комплекс TNFR1, где деубиквитинирует RIPK1, что приводит к потере стабильности комплекса I и блокированию дальнейшей активации NF-kB. Диссоциировавший из комплекса I TRADD образует комплексы с Fas-ассоциированным белком домена смерти (FADD) и каспазой-8 (комплекс IIа) или с RIPK1, FADD и каспазой-8 (комплекс IIb), которые в дальнейшем приводят к апоптозу или некроптозу [46].

Учитывая вовлечение описанных генов в сигналинг и регуляцию TNF-α, введение аптамера к TNF-α, как и ожидалось, приводило к снижению уровня экспрессии генов-мишеней, выбранных для валидации, а именно: Traf1 как компонента гетеродимерного комплекса, непосредственно участвующего в передаче сигнала TNF-α; Tnfaip3, блокирующего активацию провоспалительного сигнального пути NF-kB; и Usp18, регулирующего интенсивность воспалительного ответа после активации NF-kB по механизму отрицательной обратной связи, что говорит о правомерности использования генов-мишеней TNF-α для оценки биологического действия анти-TNF-α-аптамера. Как и в случае морфологических изменений в дыхательной системе мышей, PEG-aptTNF-α обладал более выраженным эффектом на уровень экспрессии генов, чем немодифицированные аптамеры.

Таким образом, проведенное исследование еще раз продемонстрировало важность TNF-α как терапевтической мишени при ОПЛ, а также преимущество использования химически модифицированных аптамеров для блокирования его функции. Секреторный белок является крайне привлекательной мишенью для аптамера, поскольку для связывания с ним не требуется доставка препарата в клетку, вместо этого терапевтический аптамер может вводиться системно или локально в те органы и ткани, где повышен уровень белка-мишени. Возможность введения аптамера после начала развития патологии и блокирование действия антидотом также представляются крайне привлекательными и делают терапевтические аптамеры практически «идеальными лекарствами».

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В результате проведенного исследования установлено, что TNF-α является одним из ключевых игроков цитокинового сигналинга при развитии ЛПС-индуцированного ОПЛ, а интраназальное введение аптамеров к TNF-α эффективно снижает воспалительные изменения в дыхательной системе мышей, вызванные ЛПС, влияет на ассоциированные с TNF-α гены-мишени и может рассматриваться в качестве инструмента для терапии ОПЛ различной этиологии и других заболеваний легких, сопровождающихся иммунными нарушениями.

Финансирование.Работа выполнена при финансовой поддержке Российского научного фонда (грант № 19-74-30011) и государственного задания ИХБФМ СО РАН № 121031300042-1.

Об авторах

А. В. Сенькова

Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН

Автор, ответственный за переписку.
Email: alsenko@mail.ru
Россия, Новосибирск, 630090

И. А. Савин

Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН

Email: alsenko@mail.ru
Россия, Новосибирск, 630090

Е. Л. Черноловская

Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН

Email: alsenko@mail.ru
Россия, Новосибирск, 630090

А. С. Давыдова

Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН

Email: alsenko@mail.ru
Россия, Новосибирск, 630090

М. И. Мещанинова

Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН

Email: alsenko@mail.ru
Россия, Новосибирск, 630090

А. Бишани

Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН

Email: alsenko@mail.ru
Россия, Новосибирск, 630090

М. А. Воробьева

Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН

Email: alsenko@mail.ru
Россия, Новосибирск, 630090

М. А. Зенкова

Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН

Email: alsenko@mail.ru
Россия, Новосибирск, 630090

Список литературы

Дополнительные файлы