Наноантитело широкого спектра к гемагглютинину вируса гриппа А подтипа Н3

Обложка

Цитировать

Полный текст

Аннотация

Моноклональные антитела (мАт) и их антигенсвязывающие фрагменты являются перспективным средством борьбы с инфекционными заболеваниями. Наноантитела (VHH), благодаря уникальной структуре своего паратопа, имеют ряд преимуществ перед классическими мАт, особенно в случае вирусных инфекций. Вирусы гриппа А (ВГА) остаются серьезной угрозой для общественного здравоохранения. Основным протективным и иммунодоминантным антигеном ВГА является белок гемагглютинин (НА). В данной работе выделены три наноантитела с широкой реактивностью (D9.2, E12.2 и D4.2) к различным штаммам гриппа H3N2, а также получены и охарактеризованы слитые с Fc-фрагментом VHH (VHH-Fc). Эта модификация улучшила связывающую способность VHH и позволила взаимодействовать с более широким спектром штаммов. Антитело D9.2-Fc продемонстрировало 100% защиту мышей от летального исхода in vivo. Кроме того, показано, что протективная активность D9.2-Fc обусловлена Fc-FcγR-взаимодействием. Представленные результаты говорят о том, что антитело D9.2-Fc может применяться как препарат, эффективный против инфекции, вызванной H3N2.

Полный текст

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВГА – вирус гриппа А; НА – гемагглютинин; VHH – вариабельный домен тяжелоцепочечных антител представителей семейства Camelidae, наноантитело; ИФА – иммуноферментный анализ; EC50 – полумаксимальная эффективная концентрация; ЛД50 – полулетальная доза; мАт – моноклональные антитела; Fc – кристаллизующийся фрагмент антитела; SDS-PAGE – электрофорез белков в полиакриламидном геле; HRP – пероксидаза хрена; ОП450 нм – оптическая плотность, измеренная при длине волны 450 нм; РТГА – реакция торможения гемагглютинации; РН – реакция нейтрализации; ДТТ – дитиотреитол; SEM – стандартная ошибка среднего.

ВВЕДЕНИЕ

Вирусы H3N2 являются одними из возбудителей ежегодных сезонных эпидемий гриппа; представители данного подтипа ВГА циркулируют в человеческой популяции с 1968 г. [1]. Сезонную инфекцию H3N2 в разные годы связывают с беспрецедентным увеличением количества госпитализаций пациентов с пневмонией в отделения интенсивной терапии [2], а также с высокой летальностью и частотой осложнений [3–5].

Вакцинация остается наиболее распространенной мерой борьбы с гриппом; однако ее эффективность сильно варьирует в различные эпидсезоны [6, 7]. Помимо низкой эффективности профилактических мер, активность современных противовирусных препаратов также снижается из-за растущей резистентности вируса [8, 9]. В связи с этим актуальна разработка новых универсальных противовирусных препаратов и терапевтических мАт против гриппа. Антигенсвязывающие фрагменты тяжелоцепочечных антител представителей семейства Camelidae (наноантитела, VHH) являются перспективным инструментом для ранней этиотропной терапии инфекционных заболеваний. VHH представляют собой полностью функциональный домен, который связывается с антигеном с высокой аффинностью и специфичностью. Наноантитела также обладают выдающимися биохимическими характеристиками, такими, как хорошая растворимость и термическая/pH стабильность [10]. Более того, VHH кодируются одним полипептидом, поэтому их можно легко модифицировать, например, слить с Fc IgG [11, 12].

Основной мишенью иммунного ответа является гликопротеин НА; на сегодняшний день известно 18 различных вариантов НА [13, 14], образующих две филогенетические группы [15]. НА состоит из двух субъединиц – НА1 и НА2, играющих разную роль в инициации инфекционного процесса. Описано несколько антител, специфичных к НА подтипа H3 или всей филогенетической группе 2, с различными механизмами действия [16–27]. Одним из таких механизмов, вовлеченных в ликвидацию гриппозной инфекции, являются Fc-опосредованные функции антител [28, 29].

В данной работе мы выделили три H3-специфичных VHH, которые связываются с HA различных штаммов H3N2, выделенных в разные годы. Мы расширили спектр связывания и активность VHH путем их слияния с Fc-фрагментом. Наиболее перспективное антитело D9.2-Fc при профилактическом или терапевтическом введении защищает мышей от летальной инфекции, вызванной вирусом H3N2.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Клеточные линии

Клеточная линия CHO-S получена от Thermo Fisher Scientific, США (кат. № R80007), клеточные линии MDCK и Caco2 – из Российской коллекции клеточных культур позвоночных (Санкт-Петербург, Россия).

Вирусы

Использовали адаптированный к мышам ВГА A/Aichi/2/68 (H3N2).

Рекомбинантные белки

Список использованных в работе антигенов представлен в табл. 1.

 

Таблица 1. Рекомбинантные белки НА, использованные в исследованиях in vitro

Подтип

Аббревиатура

Описание

Источник

Кат. №

№ в базе данных GenBank или GISAID

H3

H3 HA1 Swiz

HA1 A/Switzerland/9715293/2013 (H3N2)

Sino Biological

40497-V08H1

EPI541659

H3 HA1 Vic

HA1 A/Victoria/210/2009 (H3N2)

Immune Technology

IT-003-00421p

EPI272062

H3 Swiz

HA0 A/Switzerland/9715293/2013 (H3N2)

Sino Biological

40497-VNAB

EPI541659

H3 Aichi

HA0 A/Aichi/2/1968 (H3N2)

Sino Biological

11707-V08H

AAA43178.1

H3 Perth

HA0 A/Perth/16/2009 (H3N2)

Sino Biological

40043-VNAB

ACS71642.1

H3 Sing

HA0 A/Singapore/INFIMH-16-0019/2016 (H3N2)

Xema

-

EPI1341068

H3 HK

HA0 A/Hong Kong/45/2019 (H3N2)

-

-

EPI1691930

H4

H4

HA0 A/mallard/Ohio/657/2002 (H4N6)

Sino Biological

11714-V08H1

ABI47995.1

H7

H7 Anhui

HA0 A/Anhui/1/2013 (H7N9)

Sino Biological

40103-V08H

EPI439507

H10

H10

HA0 A/Jiangxi-Donghu/346/2013 (H10N8)

Sino Biological

40359-VNAB

EPI497477

 

Иммунизация верблюда, получение иммунной библиотеки, селекция индивидуальных клонов, экспрессия и очистка VHH

Двугорбого верблюда пятикратно иммунизировали рекомбинантным НА H3 HK внутримышечно в дозе 100 мкг с гидроксидом алюминия в качестве адъюванта. Спустя 5 дней после последней иммунизации проводили отбор крови (50 мл) у животного для выделения фракции периферических лимфоцитов.

Конструирование библиотеки и специфический скрининг клонов проводили согласно [30] с использованием в качестве антигена инактивированного ВГА A/Aichi/2/68 (H3N2).

Экспрессию и очистку наноантител выполняли как описано ранее [30].

Получение конструкций VHH-Fc, экспрессия и очистка модифицированных VHH

С помощью ПЦР получены последовательности генов D9.2-Fc, E12.2-Fc и D4.2-Fc, кодирующих соответствующее наноантитело, слитое с шарнирным участком и Fc человеческого IgG1 (GenBank: JQ666008.1). Полученные гены клонировали в вектор для эукариотической экспрессии pCEP4 (Thermo Fisher Scientific, США). Аналогичным образом получали плазмиду pCEP4-D9.2-mG2a, кодирующую наноантитело D9.2 с шарнирным участком и Fc IgG2а мыши (GenBank: V00798.1). Для создания плазмидной конструкции pCEP4-D9.2-mG2a LALA-PG в плазмиду pCEP4-D9.2-mG2a с помощью сайт-направленного мутагенеза вносили точечные мутации [31]. Экспрессию и очистку антител проводили как описано в [32]. Чистоту антител определяли с помощью электрофореза в полиакриламидном геле (SDS-PAGE) по Лэммли в восстанавливающих и невосстанавливающих условиях.

Аналогичным образом получали и анализировали контрольное VHH-Fc – SD36-Fc, соответствующее наноантителу (SD36) к стеблевому домену (субъединица НА2) НА Н3, аминокислотную последовательность которого брали согласно [33], слитому с Fc IgG1 человека.

Иммуноферментный анализ (ИФА)

ИФА выполняли согласно [32]. Для детекции антител в сыворотке крови верблюда использовали конъюгированные с пероксидазой хрена (HRP) anti-Llama IgG (Bethyl, A160-100P). HRP-конъюгированные вторичные антитела anti-c-Myc (ab1326, Abcam), anti-human IgG и anti-mouse IgG (A8667 и A9044, MilliporeSigma, США) использовали для выявления связавшихся с антигеном VHH и VHH-Fc с Fc-фрагментом человека и мыши соответственно. Значения полумаксимальной эффективной концентрации (EC50) рассчитывали с использованием четырехпараметрической логистической регрессии в GraphPad Prism 7 (GraphPad Software Inc., США).

Для проведения конкурентного ИФА VHH последовательно разводили в блокирующем буфере со стартовой концентрацией 800 нМ (~10 мкг/мл). Конкурентные антитела в формате VHH-Fc (5 нМ) добавляли в равном объеме в лунки, содержащие VHH. Связавшиеся VHH-Fc детектировали с использованием anti-human IgG HRP (A8667, MilliporeSigma, США). Оптическую плотность (OП450 нм) в лунках, содержащих только VHH-Fc, принимали за 100% уровень сигнала. Ингибирование выражали как процент снижения OП450 нм в лунках, содержащих смесь VHH/VHH-Fc, по сравнению с лунками без VHH.

Вестерн-блотинг

Белки разделяли с использованием 10% готовых гелей Mini-PROTEAN® (Bio-Rad, США) и переносили на нитроцеллюлозную мембрану Amersham™ Hybond™ P (Cytiva, США). После блокировки мембраны добавляли VHH-Fc в конечной концентрации 1 мкг/мл. Далее вносили антитела anti-human IgG HRP (A8667, MilliporeSigma, США). Иммунодетекцию проводили с использованием субстрата Clarity™ Western ECL (Bio-Rad).

Реакция торможения гемагглютинации (РТГА)

РТГА проводилась согласно [34].

Реакция нейтрализации (РН) вируса

РН в формате микронейтрализации в 96-луночных культуральных планшетах проводили как описано ранее [35]. Не нейтрализованные вирусные частицы выявляли с использованием поликлональных антител кролика к белку NP и anti-Rabbit IgG HRP вторичные антитела (Cat: 11675-T62 и SSA003, Sino Biological, Китай).

Способность антител ингибировать выход вирусного потомства из клетки и уменьшать размер бляшек оценивали с помощью описанных методик [16].

Оценка профилактической и терапевтической эффективности антител in vivo

Все эксперименты с животными, проведенные в соответствии с Директивой 2010/63/EU, рекомендациями FELASA [36], были одобрены этическим комитетом ФГБУ НИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи (протокол № 19 от 2022 г.).

Во всех экспериментах использовали SPF мышей линии BALB/c в возрасте 6–8 недель, полученных из НПП «Питомник лабораторных животных» ФИБХ РАН. Животных интраназально инфицировали 5 ЛД50 вируса A/Aichi/2/68 (H3N2), адаптированного к мышам. За животными наблюдали в течение 14 дней после заражения и ежедневно взвешивали, после чего эвтаназировали. Мышей, масса тела которых снизилась на 25% или более, эвтаназировали.

Подробная информация о схемах введения антител представлена в разделе «Результаты».

Выживаемость анализировали с использованием теста Мантела–Кокса в GraphPad Prism 7 (GraphPad Software Inc., США).

РЕЗУЛЬТАТЫ

Для получения наноантител, связывающихся с НА подтипа Н3, двугорбого верблюда (Camelus bactrianus) иммунизировали рекомбинантным полноразмерным белком HA0 Н3 НК, ранее полученным в клетках CHO-S (рис. 1А). Мониторинг уровня НА-специфических антител в сыворотке крови верблюда осуществляли методом ИФА (рис. 1Б). Иммунная сыворотка, полученная после всего цикла иммунизаций, проявляла, в отличие от контрольной, специфическую активность в отношении белка H3 HK с титром связывания более 1:1 500 000. Фаговую библиотеку размером 1.4 × 107 конструировали из кДНК, кодирующей последовательности VHH, выделенные из В-клеток. VHH, специфичные для НА H3, были отобраны методом фагового дисплея в ходе трех раундов биопэннинга против инактивированного вируса A/Aichi/2/68 (H3N2) (рис. 1А). После третьего раунда пэннинга наблюдали значительное обогащение специфичными VHH к вирусу H3N2 (рис. 1В). Из полученной панели антител для дальнейших исследований отобрали три VHH (D4.2, D9.2 и E12.2), которые связывались с H3 HК (рис. 1А).

 

Рис. 1. Схема получения VHH, оценка связывающей способности выбранных VHH и схема их модификации: А – стратегия иммунизации животного и отбора VHH;Б – ИФА, показывающий уровень H3-специфичных антител в сыворотке крови верблюда до и после пятой иммунизации; В – результаты поликлонального фагового ИФА. BSA – бычий сывороточный альбумин, H3N2 – инактивированный ВГА A/Aichi/2/1968, старт. библ. – стартовая библиотека; Г – активность отобранных VHH в ИФА в отношении НА филогенетической группы 2 подтипов Н3, Н4, Н7 и Н10, выраженная в ЕС50 (нМ); Д – схема повышения эффективности VHH – модификация Fc-фрагментом

 

Иммунореактивность VHH анализировали с помощью ИФА на рекомбинантных HA, принадлежащих к подтипам H3, H4, H7 и H10 (рис. 1Г). Все VHH прочно связывались с иммобилизованными НА разных штаммов H3N2, включая изоляты 2009, 2013 и 2019 гг. Кроме того, E12.2 и D4.2 связывали НА штамма A/Aichi/2/1968. E12.2 также взаимодействовал с НА подтипа H4. И D9.2, и E12.2 узнавали субъединицу HA1 белка HA. В свою очередь, D4.2 не связывался с HA1, но взаимодействовал с полноразмерными HA0.

Для того чтобы повысить активность выбранных наноантител посредством естественной димеризации, увеличить период полувыведения из сыворотки и добавить Fc-опосредованные эффекторные функции, мы модифицировали VHH Fc-фрагментом (рис. 1Д). Последовательности выбранных VHH были слиты с шарнирной областью и Fc-доменом IgG1 человека. Таким образом получали конструкции VHH-Fc: D9.2-Fc, D4.2-Fc и E12.2-Fc. Димеризацию VHH-Fc подтверждали с помощью электрофореза (рис. 2А). Полоса с молекулярной массой примерно 80–90 кДа в невосстанавливающих условиях соответствует димерной форме VHH-Fc.

Широту связывающей способности VHH-Fc изучали в непрямом ИФА с использованием рекомбинантных белков HA0 и HA1 разных штаммов ВГА (рис. 2Б). Введение Fc-фрагмента в структуру молекулы VHH повышало эффективность связывания каждого выбранного VHH-Fc, но в разной степени. Наиболее заметное увеличение аффинности продемонстрировало D4.2-Fc: его значение EC50 для H3 Swiz составило 22 пМ, в то время как EC50 мономера – 1642 пМ. Мономерная форма D9.2 едва могла связываться с H3 Aichi, в то время как EC50 Fc-слитой формы для этого штамма составила 0.46 нМ. И D9.2-Fc, и D4.2-Fc также получили способность связывать НА подтипа H4. Наименее выраженный эффект модификация Fc-фрагментом оказала на E12.2.

Оценка специфичности VHH-Fc в вестерн-блот-анализе показала, что все отобранные антитела распознают как мономерную, так и ди- и тримерную формы НА (рис. 2В). Также с помощью иммуноблотинга показано, что антитела D9.2-Fc и E12.2-Fc специфически связываются с субъединицей НА1, в то время как D4.2-Fc – с субъединицей НА2 (рис. 2Г). Далее мы определяли, разрушаются ли распознаваемые нашими антителами эпитопы при снижении рН (рис. 2Д). Как известно, в процессе слияния мембран НА претерпевает значительные конформационные изменения, вызванные понижением рН в эндосомах клетки-хозяина. Несмотря на то, что субъединица НА1 не претерпевает таких серьезных перестроек, как НА2 [37, 38], активность связывающих HA1 антител (D9.2-Fc и E12.2-Fc) уменьшалась с уменьшением pH и полностью терялась при добавлении ДТТ, поскольку он удаляет субъединицу HA1 из HA. Однако D4.2-Fc одинаково связывалось с HA при различных значениях рН, как и с HA, обработанным ДТТ, что подтверждает нахождение его эпитопа именно в субъединице НА2.

По результатам конкурентного ИФА показано, что три отобранных клона VHH-Fc узнают различные не перекрывающиеся эпитопы на поверхности НА (рис. 2Е). Связывающее субъединицу НА2 антитело D4.2-Fc не конкурировало с контрольным VHH-Fc к НА2, SD36-Fc.

 

Рис. 2. Получение VHH-Fc и их характеристика in vitro: А – SDS-PAGE очищенных VHH-Fc в невосстанавливающих (2–4) и восстанавливающих (5–7) условиях: маркер молекулярных масс (1), D9.2-Fc (2, 5), E12.2-Fc (3, 6) и D4.2-Fc (4, 7); Б – спектр связывания VHH-Fc с различными НА филогенетической группы 2 по результатам ИФА, выражен в ЕС50 (нМ); В – вестерн-блот-анализ специфичности антител D9.2-Fc (1, 2), D4.2-Fc (3, 4) и E12.2-Fc (5, 6) к HA0 H3 Swiz в восстанавливающих (1–3) и невосстанавливающих (4–6) условиях; Г – вестерн-блот-анализ специфичности VHH-Fc к НА1 или НА2 субъединице НА: инактивированный ВГА A/Aichi/2/1968 в восстанавливающих условиях, детектированный D9.2-Fc (1), D4.2-Fc (2) или E12.2-Fc (3);Д – результаты непрямого ИФА, показывающие связывание VHH-Fc с H3 Aichi, обработанным трипсином-TPCK и инкубированным в буферах с различным pH или ДТТ;Е – конкурентный ИФА для определения эпитопной специфичности VHH-Fc

 

Протективную активность VHH-Fc in vivo изучали с использованием летальной мышиной модели (рис. 3). Мышам BALB/c интраназально вводили 1 мг/кг VHH-Fc за 1 ч до инфицирования. Животным контрольной группы вводили изотип IgG1 – нерелевантное VHH-Fc к S-белку вируса SARS-CoV-2; положительным контролем служило антитело SD36-Fc.

 

Рис. 3. Профилактическая эффективность VHH-Fc in vivo: А – кривые выживаемости, показано различие между контрольной и группой D9.2-Fc (**p = 0.002); Б – кривые изменения массы тела выживших мышей, данные представлены как средние значения ± SЕМ

 

Антитело D9.2-Fc защищало 100% животных от летального исхода, потеря веса в данной группе в среднем не превышала 10%, к концу эксперимента вес мышей превышал изначальный. В свою очередь, ни E12.2-Fc, ни D4.2-Fc не показали протективной активности, поэтому D9.2-Fc было выбрано для дальнейшего исследования in vivo.

Далее мы оценили профилактическую эффективность системного введения D9.2-Fc в отношении летальной инфекции H3N2 (рис. 4А,Б). Мышам вводили антитела в дозе 10 мг/кг внутрибрюшинно за 24 ч до заражения ВГА. У животных, получавших D9.2-Fc, не наблюдалось признаков заболевания, потеря веса отсутствовала или была незначительной, в то время как контрольные мыши пали спустя 7 суток.

Для определения терапевтической эффективности D9.2-Fc мышам вводили внутрибрюшинно 40 мг/кг D9.2-Fc спустя 24 ч после инфицирования (рис. 4В,Г). Мыши из контрольной группы пали к 9 дню после заражения. Из животных, получивших D9.2-Fc, 80% выжили; изменение массы тела не превышало 15%, к концу наблюдения вес всех мышей вернулся к начальным значениям.

 

Рис. 4. Эффективность D9.2-Fc in vivo в режиме профилактического (А и Б) и терапевтического (В и Г) введения: А и В – кривые выживаемости (***р = 0.0002, **p = 0.0021); Б и Г – кривые изменения массы тела выживших мышей, данные представлены как средние значения ± SЕМ

 

Чтобы изучить механизм противовирусного действия D9.2-Fc, мы оценивали активность VHH-Fc в РТГА и различных вариантах РН. Данное антитело не тормозило гемагглютинирующую активность ВГА в реакции микронейтрализации, и в реакции нейтрализации бляшкообразования D9.2-Fc не обладало вируснейтрализующей активностью. При определении способности VHH-Fc ингибировать выход вируса из клетки антитело D9.2-Fc также не показало нейтрализующих свойств.

Поскольку D9.2-Fc не обладало способностью нейтрализовать ВГА, мы предположили, что эффективность данного антитела in vivo опосредована Fc-зависимыми эффекторными функциями. Поэтому были получены две дополнительные формы D9.2: VHH с Fc IgG2a мыши (D9.2-mG2a), а также D9.2-mG2a LALA-PG, в которой в Fc внесены мутации L234A, L235A и P329G (рис. 5). Комплекс мутаций LALA-PG ингибирует связывание с FcγR и C1q, в то время как взаимодействие с FcRn и стабильность Fc не затрагиваются [39]. С помощью ИФА показано, что эти мутации не влияют на связывание D9.2 с НА (рис. 5Б). Для оценки и сравнения протективных свойств полученных конструкций мышам вводили внутрибрюшинно антитела в дозе 5 мг/кг за 24 ч до заражения (рис. 5В,Г). Мыши (4 из 5), получавшие антитело D9.2-mG2a, были защищены от летального исхода, тогда как все мыши, получавшие антитело LALA-PG, пали к 6 дню, как и мыши контрольной группы. Следовательно, взаимодействие Fc-FcγR необходимо для защиты животных in vivo с помощью ненейтрализующего антитела D9.2.

 

Рис. 5. Протективность D9.2 in vivo зависит от Fc-FcγR-взаимодействий. А – SDS-PAGE-анализ полученных конструкций в невосстанавливающих (1, 3) и восстанавливающих (2, 4) условиях: D9.2-mG2a (1, 2) и D9.2-mG2a LALA-PG (3, 4), маркер молекулярных масс (5). Б – результаты ИФА, отражающие связывание указанных антител с НА Н3 Aichi и H3 Sing. В – кривые выживаемости (различия между группами D9.2-mG2a и IgG1: *р = 0.0361; между группами D9.2-mG2a и LALA-PG – * p = 0.0116). Г – кривые изменения массы тела выживших мышей, представлены средние значения ± SЕМ

 

ОБСУЖДЕНИЕ

В настоящее время одним из перспективных направлений в медицине является использование мАт для профилактики и лечения инфекций. В частности, наноантитела (VHH) рассматриваются как практичная и эффективная альтернатива классическим IgG. В последнее время активно изучается возможность использования VHH в качестве антибактериальных [40, 41] или противовирусных антител [32, 42, 43]. VHH, состоящие из одного полипептида, могут успешно использоваться для пассивной иммунизации в составе аденовирусных векторов [44, 45], аденоассоциированных вирусных векторов [46, 47] или мРНК [48]. В данной работе нами выделены три VHH: D9.2, D4.2 и E12.2, специфичные к разным эпитопам молекулы НА вируса H3N2. D9.2 и E12.2 связываются с субъединицей HA1, тогда как D4.2 взаимодействует с субъединицей HA2. Полученные VHH узнают HA различных штаммов H3N2. Кроме того, E12.2 в формате мономера может связывать HA подтипа H4.

Ранее сообщалось об усилении противовирусного действия VHH путем мультимеризации. Например, димеризация VHH P2C5 приводила к 200-кратному увеличению нейтрализующей активности против SARS-CoV-2 [49], в то время как димер другого анти-S VHH Fu2 в 10 раз эффективнее нейтрализовал вирус в отличие от его мономерной формы [50]. Согласно данным Hultberg A. и соавт., можно получить 4000-кратное усиление активности VHH, что и было показано для бивалентной формы VHH, нейтрализующего респираторно-синцитиальный вирус [12]. Аналогичное наблюдение сделано для молекул VHH, слитых с Fc, так как через Fc-фрагмент происходит естественная димеризация [51, 52]. Более того, показано расширение спектра связывания некоторых VHH в результате мультимеризации. Например, противогриппозный VHH R1a-B6 в бивалентном формате приобрел способность нейтрализовать вирусы H2N2 [53], а G2.3, слитый с Fc-фрагментом, подтипы H5N2 и H9N2 [32]. Fc-слитая форма VHH, активного в отношении SARS-CoV-1, демонстрировала перекрестную реактивность с SARS-CoV-2 [54]. Кроме того, модификация с помощью Fc позволяет задействовать эффекторные функции, включая активацию комплемента и/или антителозависимую клеточную цитотоксичность и фагоцитоз, которые имеют решающее значение при гриппозной инфекции [29]. Поэтому мы объединили наши VHH с Fc IgG1 человека, и опосредованная Fc димеризация привела к увеличению связывающей активности наряду с появлением способности реагировать с белком НА подтипа H4 (для VHH D9.2 и D4.2). Однако модификация E12.2 привела к минимальному (по сравнению с другими VHH) улучшению связывающей способности, что позволяет предположить, что потенциал увеличения эффективности и ширины спектра связывания антитела за счет мультимеризации зависит от его эпитопа.

Мы исследовали эффективность выбранных антител in vivo и показали, что D9.2-Fc при его интраназальном введении за 1 ч до заражения полностью защищает животных от летального исхода, тогда как D4.2-Fc и E12.2-Fc не смогли обеспечить защиту животных. Учитывая эти результаты, D9.2-Fc отобрали для дальнейшей оценки его профилактических и терапевтических свойств in vivo. При системном введении D9.2-Fc за 24 ч до заражения наблюдали 100% протективность данного антитела, в то время как при введении через сутки после инфицирования выживало 80% животных, получивших D9.2-Fc.

Мы оценили также вируснейтрализующую активность D9.2-Fc in vitro. Однако D9.2-Fc не обладает способностью нейтрализовать вирус H3N2, поэтому мы предположили, что его протективные свойства in vivo зависят от Fc-опосредованных эффекторных функций антитела. Как известно, Fc-фрагмент IgG1 человека способен связывать FcγR мыши [55]. Тем не менее, в определенных случаях подтип IgG играет решающую роль в протективности мАт на летальной мышиной модели. Например, показано, что связывающиеся с субъединицей НА2, а также и нацеленные на интерфейс HA варианты мАт с константной областью тяжелой цепи IgG2a мыши улучшают защиту in vivo по сравнению с исходным субтипом IgG. Причиной этого является более высокое сродство Fc-фрагмента субтипа IgG2a к FcγR по сравнению с IgG1 [56, 57]. Несмотря на различия в представлениях ученых о том, до какой степени противовирусный эффект in vivo мАт, специфичных к НА1, зависит от Fc-опосредованных функций, опубликованы данные, подтверждающие по крайней мере частичную зависимость протективности анти-НА1 мАт от Fc-FcγR-взаимодействия [19, 25, 26, 58]. Мы сравнили протективные свойства in vivo D9.2, слитого с Fc IgG2a мыши (D9.2-mG2a), и D9.2 с мутациями LALA-PG (D9.2-mG2a LALA-PG) и показали, что D9.2-mG2a обеспечивало выживаемость 80% животных, в то время как вся группа мышей, получавших LALA-PG, пала. Таким образом установлено, что D9.2-Fc защищает животных благодаря Fc-FcγR-взаимодействию.

ВЫВОДЫ

В данной работе мы идентифицировали три клона VHH, узнающие неперекрывающиеся эпитопы в структуре НА и активные в отношении НА различных штаммов вируса гриппа H3N2. Мы расширили спектр их связывания, модифицировав VHH Fc-фрагментом. Из трех отобранных VHH-Fc только D9.2-Fc продемонстрировало протективную активность in vivo на мышиной модели гриппозной инфекции. Несмотря на отсутствие нейтрализующей активности в отношении ВГА H3N2, D9.2-Fc способно обеспечивать эффективную защиту in vivo с помощью Fc-опосредованных механизмов.

Исследование выполнено в рамках Государственного задания Министерства здравоохранения Российской Федерации № 121031800132-4.

×

Об авторах

Д. В. Щебляков

Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи Минздрава России

Email: daryavoronin2009@yandex.ru
Россия, Москва, 123098

Д. В. Воронина

Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи Минздрава России

Автор, ответственный за переписку.
Email: daryavoronin2009@yandex.ru
Россия, Москва, 123098

И. А. Фаворская

Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи Минздрава России

Email: daryavoronin2009@yandex.ru
Россия, Москва, 123098

И. Б. Есмагамбетов

Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи Минздрава России

Email: daryavoronin2009@yandex.ru
Россия, Москва, 123098

И. А. Алексеева

Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи Минздрава России

Email: daryavoronin2009@yandex.ru
Россия, Москва, 123098

А. И. Коробкова

Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи Минздрава России

Email: daryavoronin2009@yandex.ru
Россия, Москва, 123098

Е. И. Рябова

Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи Минздрава России; Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии – МВА имени К.И. Скрябина

Email: daryavoronin2009@yandex.ru
Россия, Москва, 123098; Москва, 109472

А. А. Деркаев

Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи Минздрава России

Email: daryavoronin2009@yandex.ru
Россия, Москва, 123098

В. Ю. Кан

Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи Минздрава России

Email: daryavoronin2009@yandex.ru
Россия, Москва, 123098

А. Ш. Джаруллаева

Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи Минздрава России

Email: daryavoronin2009@yandex.ru
Россия, Москва, 123098

А. И. Тухватулин

Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи Минздрава России

Email: daryavoronin2009@yandex.ru
Россия, Москва, 123098

А. С. Банделюк

Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи Минздрава России

Email: daryavoronin2009@yandex.ru
Россия, Москва, 123098

М. М. Шмаров

Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи Минздрава России

Email: daryavoronin2009@yandex.ru
Россия, Москва, 123098

Д. Ю. Логунов

Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи Минздрава России

Email: daryavoronin2009@yandex.ru
Россия, Москва, 123098

А. С. Гинцбург

Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи Минздрава России

Email: daryavoronin2009@yandex.ru
Россия, Москва, 123098

Список литературы

  1. Cockburn W.C., Delon P.J., Ferreira W. // Bull W. Hlth Organ. 1969. V. 41. P. 345–348.
  2. Burrell A., Huckson S., Pilcher D.V. // N. Engl. J. Med. 2018. V. 378. № 22. P. 2138–2139.
  3. Huang S.Y., Huang W.C., Chen Y.C., Tsai C.Y., Lee I.K. // Am. J. Trop. Med. Hygiene. 2017. V. 97. № 6. P. 1945–1951.
  4. Nateghian A., Gouya M.M., Nabavi M., Soltani H., Mousavi S.V., Agah E., Erfani H., Parchami P., Dadras M., Robinson J.L. // J. Clin. Virol. 2020. V. 124. P. 104281.
  5. Tekin S., Keske S., Alan S., Batirel A., Karakoc C., Tasdelen-Fisgin N., Simsek-Yavuz S., Işler B., Aydin M., Kapmaz M., et al. // Inter. J. Infect. Dis. 2019. V. 81. P. 6–9.
  6. Darvishian M., van den Heuvel E.R., Bissielo A., Castilla J., Cohen C., Englund H., Gefenaite G., Huang W.T., la Bastide-van Gemert S., Martinez-Baz I., et al. // Lancet Respir. Med. 2017. V. 5. № 3. P. 200–211.
  7. Lewnard J.A., Cobey S. // Vaccines (Basel). 2018. V. 6. № 2. P. 28.
  8. Hayden F.G., Sugaya N., Hirotsu N., Lee N., de Jong M.D., Hurt A.C., Ishida T., Sekino H., Yamada K., Portsmouth S., et al. // N. Eng. J. Med. 2018. V. 379. № 10. P. 913–923.
  9. Stephenson I., Democratis J., Lackenby A., McNally T., Smith J., Pareek M., Ellis J., Bermingham A., Nicholson K., Zambon M. // Clin. Infect. Dis. 2009. V. 48. № 4. P. 389–396.
  10. Huang K., Ying T., Wu Y. // Viruses. 2022. V. 14. № 6. P. 1162.
  11. Hoefman S., Ottevaere I., Baumeister J., Sargentini-Maier M.L. // Antibodies. 2015. V. 4. № 3. P. 141–156.
  12. Hultberg A., Temperton N.J., Rosseels V., Koenders M., Gonzalez-Pajuelo M., Schepens B., Ibañez L.I., Vanlandschoot P., Schillemans J., Saunders M., et al. // PLoS One. 2011. V. 6. № 4. P. e17665.
  13. Ferrara F., Molesti E., Temperton N. // Future Virol. 2015. V. 10. № 6. P. 731–749.
  14. Wu Y., Wu Y., Tefsen B., Shi Y., Gao G.F. // Trends Microbiol. 2014. V. 22. № 4. P. 183–191.
  15. Tong S., Zhu X., Li Y., Shi M., Zhang J., Bourgeois M., Yang H., Chen X., Recuenco S., Gomez J., et al. // PLoS Pathog. 2013. V. 9. № 10. P. e1003657.
  16. Bangaru S., Lang S., Schotsaert M., Vanderven H.A., Zhu X., Kose N., Bombardi R., Finn J.A., Kent S.J., Gilchuk P., et al. // Cell. 2019. V. 177. № 5. P. 1136–1152.e18.
  17. Benjamin E., Wang W., McAuliffe J.M., Palmer-Hill F.J., Kallewaard N.L., Chen Z., Suzich J.A., Blair W.S., Jin H., Zhu Q. // J. Virol. 2014. V. 88. № 12. P. 6743–6750.
  18. DiLillo D.J., Palese P., Wilson P.C., Ravetch J.V. // J. Clin. Invest. 2016. V. 126. № 2. P. 605–610.
  19. Henry Dunand C.J., Leon P.E., Huang M., Choi A., Chromikova V., Ho I.Y., Tan G.S., Cruz J., Hirsh A., Zheng N.Y., et al. // Cell Host Microbe. 2016. V. 19. № 6. P. 800–813.
  20. Iba Y., Fujii Y., Ohshima N., Sumida T., Kubota-Koketsu R., Ikeda M., Wakiyama M., Shirouzu M., Okada J., Okuno Y., et al. // J. Virol. 2014. V. 88. № 13. P. 7130–7144.
  21. Kubota-Koketsu R., Mizuta H., Oshita M., Ideno S., Yunoki M., Kuhara M., Yamamoto N., Okuno Y., Ikuta K. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2009. V. 387. № 1. P. 180–185.
  22. Lee J., Boutz D.R., Chromikova V., Joyce M.G., Vollmers C., Leung K., Horton A.P., DeKosky B.J., Lee C.H., Lavinder J.J., et al. // Nat. Med. 2016. V. 22. № 12. P. 1456–1464.
  23. McCarthy K.R., Watanabe A., Kuraoka M., Do K.T., McGee C.E., Sempowski G.D., Kepler T.B., Schmidt A.G., Kelsoe G., Harrison S.C. // Immunity. 2018. V. 48. № 1. P. 174–184.e9.
  24. Son S., Ahn S. Bin, Kim G., Jang Y., Ko C., Kim M., Kim S.J. // Antiviral Res. 2023. V. 213. P. 105591.
  25. Tan G.S., Leon P.E., Albrecht R.A., Margine I., Hirsh A., Bahl J., Krammer F. // PLoS Pathog. 2016. V. 12. № 4. P. e1005578.
  26. Watanabe A., McCarthy K.R., Kuraoka M., Schmidt A.G., Adachi Y., Onodera T., Tonouchi K., Caradonna T.M., Bajic G., Song S., et al. // Cell. 2019. V. 177. № 5. P. 1124–1135.e16.
  27. Yoon A., Yi K.S., Chang S.Y., Kim S.H., Song M., Choi J.A., Bourgeois M., Hossain M.J., Chen L.M., Donis R.O., et al. // PLoS One. 2015. V. 10. № 10. P. e0141312.
  28. Gao R., Sheng Z., Sreenivasan C.C., Wang D., Li F. // Viruses. 2020. V. 12. № 3. P. 276.
  29. Boudreau C.M., Alter G. // Front. Immunol. 2019. V. 10. P. 440.
  30. Voronina D.V., Shcheblyakov D.V., Esmagambetov I.B., Derkaev A.A., Popova O., Shcherbinin D.N. // Acta Naturae. 2021. V. 13. № 4. P. 33–41.
  31. Saunders K.O. // Front. Immunol. 2019. V. 10. P. 1296.
  32. Voronina D.V., Shcheblyakov D.V., Favorskaya I.A., Esmagambetov I.B., Dzharullaeva A.S., Tukhvatulin A.I., Zubkova O.V., Popova O., Kan V.Y., Bandelyuk A.S., et al. // Viruses. 2022. V. 14. № 11. P. 2485.
  33. Laursen N.S., Friesen R.H.E., Zhu X., Jongeneelen M., Blokland S., Vermond J., van Eijgen A., Tang C., van Diepen H., Obmolova G., et al. // Science. 2018. V. 362. № 6414. P. 598–602.
  34. Kaverin N.V., Rudneva I.A., Govorkova E.A., Timofeeva T.A., Shilov A.A., Kochergin-Nikitsky K.S., Krylov P.S., Webster R.G. // J. Virol. 2007. V. 81. № 23. P. 12911–12917.
  35. He W., Mullarkey C.E., Miller M.S. // Methods. 2015. V. 90. P. 95–100.
  36. Mähler M., Berar M., Feinstein R., Gallagher A., Illgen-Wilcke B., Pritchett-Corning K., Raspa M. // Lab. Anim. 2014. V. 48. № 3. P. 178–192.
  37. Benhaim M.A., Prasad V.M., Garcia N.K., Guttman M., Lee K.K. // Sci. Adv. 2020. V. 6. № 18. P. eaaz8822.
  38. Benton D.J., Gamblin S.J., Rosenthal P.B., Skehel J.J. // Nature. 2020. V. 583. № 7814. P. 150–153.
  39. Mausser E., Nador E., Politch J.A., Pauly M.R., Marathe J.G., Moench T.R., Zeitlin L., Whaley K.J., Anderson D.J. // PLoS One. 2023. V. 18. № 3. P. e0282147.
  40. Cawez F., Mercuri P.S., Morales-Yãnez F.J., Maalouf R., Vandevenne M., Kerff F., Guérin V., Mainil J., Thiry D., Saulmont M., et al. // Antimicrob. Agents Chemother. 2023. V. 67. № 4. P. e01499-22.
  41. Kumar S., Athreya A., Gulati A., Nair R.M., Mahendran I., Ranjan R., Penmatsa A. // Commun. Biol. 2021. V. 4. № 1. P. 836.
  42. Esmagambetov I.B., Shcheblyakov D.V., Egorova D.A., Voronina O.L., Derkaev A.A., Voronina D.V., Popova O., Ryabova E.I., Shcherbinin D.N., Aksenova E.I., et al. // Acta Naturae. 2021. V. 13. № 4. P. 53–63.
  43. Wang R., Zhang H., Peng C., Shi J., Zhang H., Gong R. // Virol. Sin. 2021. V. 36. № 6. P. 1600–1610.
  44. Burmistrova D.A., Tillib S.V., Shcheblyakov D.V., Dolzhikova I.V., Shcherbinin D.N., Zubkova O.V., Ivanova T.I., Tukhvatulin A.I., Shmarov M.M., Logunov D.Y., et al. // PLoS One. 2016. V. 11. № 3. P. e0150958.
  45. Tutykhina I.L., Sedova E.S., Gribova I.Y., Ivanova T.I., Vasilev L.A., Rutovskaya M.V., Lysenko A.A., Shmarov M.M., Logunov D.Y., Naroditsky B.S., et al. // Antiviral Res. 2013. V. 97. № 3. P. 318–328.
  46. Derkaev A.A., Ryabova E.I., Esmagambetov I.B., Shcheblyakov D.V., Godakova S.A., Vinogradova I.D., Noskov A.N., Logunov D.Y., Naroditsky B.S., Gintsburg A.L. // Front Microbiol. 2022. V. 13. P. 960937.
  47. Esmagambetov I.B., Ryabova E.I., Derkaev A.A., Shcheblyakov D.V., Dolzhikova I.V., Favorskaya I.A., Grousova D.M., Dovgiy M.A., Prokofiev V.V., Gosudarev A.I., et al. // Front. Immunol. 2023. V. 14. P. 1129245.
  48. Panova E.A., Kleymenov D.A., Shcheblyakov D.V., Bykonia E.N., Mazunina E.P., Dzharullaeva A.S., Zolotar A.N., Derkaev A.A., Esmagambetov I.B., Sorokin I.I., et al. // Front. Immunol. 2023. V. 14. P. 1098302.
  49. Favorskaya I.A., Shcheblyakov D.V., Esmagambetov I.B., Dolzhikova I.V., Alekseeva I.A., Korobkova A.I., Voronina D.V., Ryabova E.I., Derkaev A.A., Kovyrshina A.V., et al. // Front Immunol. 2022. V. 13. P. 822159.
  50. Hanke L., Das H., Sheward D.J., Perez Vidakovics L., Urgard E., Moliner-Morro A., Kim C., Karl V., Pankow A., Smith N.L., et al. // Nat. Commun. 2022. V. 13. № 1. P. 155.
  51. Liu H., Wu L., Liu B., Xu K., Lei W., Deng J., Rong X., Du P., Wang L., Wang D., et al. // Cell Rep. Med. 2023. V. 4. № 2. P. 100918.
  52. Schepens B., van Schie L., Nerinckx W., Roose K., Fijalkowska D., Devos S., Weyts W., De Cae S., Vanmarcke S., Lonigro C., et al. // Sci. Transl. Med. 2021. V. 13. №. 621. P. eabi7826.
  53. Hufton S.E., Risley P., Ball C.R., Major D., Engelhardt O.G., Poole S. // PLoS One. 2014. V. 9. № 8. P. e103294.
  54. Wrapp D., De Vlieger D., Corbett K.S., Torres G.M., Wang N., van Breedam W., Roose K., van Schie L., Hoffmann M., Pöhlmann S., et al. // Cell. 2020. V. 181. № 5. P. 1004–1015.e15.
  55. Derebe M.G., Nanjunda R.K., Gilliland G.L., Lacy E.R., Chiu M.L. // Immunol. Lett. 2018. V. 197. P. 1–8.
  56. DiLillo D.J., Tan G.S., Palese P.R.J.V. // Nat. Med. 2014. V. 20. № 2. P. 143–151.
  57. Bruhns P. // Blood. 2012. V. 119. № 24. P. 5640–5649.
  58. Ko Y.A., Yu Y.H., Wu Y.F., Tseng Y.C., Chen C.L., Goh K.S., Liao H.Y., Chen T.H., Cheng T.J.R., Yang A.S., et al. // PLoS Pathog. 2021. V. 17. № 8. P. e1009724.

Дополнительные файлы

Доп. файлы
Действие
1. JATS XML
Скачать
2. Рис. 1. Схема получения VHH, оценка связывающей способности выбранных VHH и схема их модификации:А – стратегия иммунизации животного и отбора VHH;Б – ИФА, показывающий уровень H3-специфичных антител в сыворотке крови верблюда до и после пятой иммунизации;В – результаты поликлонального фагового ИФА. BSA – бычий сывороточный альбумин, H3N2 – инактивированный ВГА A/Aichi/2/1968, старт. библ. – стартовая библиотека;Г – активность отобранных VHH в ИФА в отношении НА филогенетической группы 2 подтипов Н3, Н4, Н7 и Н10, выраженная в ЕС50 (нМ);Д – схема повышения эффективности VHH – модификация Fc-фрагментом

Скачать (623KB)
Метаданные
3. Рис. 2. Получение VHH-Fc и их характеристика in vitro:А – SDS-PAGE очищенных VHH-Fc в невосстанавливающих (2–4) и восстанавливающих (5–7) условиях: маркер молекулярных масс (1), D9.2-Fc (2, 5), E12.2-Fc (3, 6) и D4.2-Fc (4, 7);Б – спектр связывания VHH-Fc с различными НА филогенетической группы 2 по результатам ИФА, выражен в ЕС50 (нМ);В – вестерн-блот-анализ специфичности антител D9.2-Fc (1, 2), D4.2-Fc (3, 4) и E12.2-Fc (5, 6) к HA0 H3 Swiz в восстанавливающих (1–3) и невосстанавливающих (4–6) условиях;Г – вестерн-блот-анализ специфичности VHH-Fc к НА1 или НА2 субъединице НА: инактивированный ВГА A/Aichi/2/1968 в восстанавливающих условиях, детектированный D9.2-Fc (1), D4.2-Fc (2) или E12.2-Fc (3);Д – результаты непрямого ИФА, показывающие связывание VHH-Fc с H3 Aichi, обработанным трипсином-TPCK и инкубированным в буферах с различным pH или ДТТ;Е – конкурентный ИФА для определения эпитопной специфичности VHH-Fc

Скачать (808KB)
Метаданные
4. Рис. 3. Профилактическая эффективность VHH-Fc in vivo: А – кривые выживаемости, показано различие между контрольной и группой D9.2-Fc (**p = 0.002); Б – кривые изменения массы тела выживших мышей, данные представлены как средние значения ± SЕМ

Скачать (283KB)
Метаданные
5. Рис. 4. Эффективность D9.2-Fc in vivo в режиме профилактического (А и Б) и терапевтического (В и Г) введения: А и В – кривые выживаемости (***р = 0.0002, **p = 0.0021); Б и Г – кривые изменения массы тела выживших мышей, данные представлены как средние значения ± SЕМ

Скачать (516KB)
Метаданные
6. Рис. 5. Протективность D9.2 in vivo зависит от Fc-FcγR-взаимодействий. А – SDS-PAGE-анализ полученных конструкций в невосстанавливающих (1, 3) и восстанавливающих (2, 4) условиях: D9.2-mG2a (1, 2) и D9.2-mG2a LALA-PG (3, 4), маркер молекулярных масс (5). Б – результаты ИФА, отражающие связывание указанных антител с НА Н3 Aichi и H3 Sing. В – кривые выживаемости (различия между группами D9.2-mG2a и IgG1: *р = 0.0361; между группами D9.2-mG2a и LALA-PG – * p = 0.0116). Г – кривые изменения массы тела выживших мышей, представлены средние значения ± SЕМ

Скачать (491KB)
Метаданные

© Щебляков Д.В., Воронина Д.В., Фаворская И.А., Есмагамбетов И.Б., Алексеева И.А., Коробкова А.И., Рябова Е.И., Деркаев А.А., Кан В.Ю., Джаруллаева А.Ш., Тухватулин А.И., Банделюк А.С., Шмаров М.М., Логунов Д.Ю., Гинцбург А.С., 2024

Creative Commons License
Эта статья доступна по лицензии Creative Commons Attribution 4.0 International License.

Данный сайт использует cookie-файлы

Продолжая использовать наш сайт, вы даете согласие на обработку файлов cookie, которые обеспечивают правильную работу сайта.

О куки-файлах