Реконструкция реакции модификации лантибиотика андалусицина лантионинсинтетазой AncKC в гетерологической системе Escherichia coli

Полный текст

ВВЕДЕНИЕ

Поиск новых антимикробных препаратов является одной из наиболее актуальных проблем, стоящих перед исследователями в 21 веке. Стремительное распространение бактериальных штаммов с множественной лекарственной устойчивостью сопряжено с рисками для общественного здоровья и требует особого внимания. Пептиды являются привлекательными кандидатами на роль новых антибиотиков благодаря своей генетически кодируемой природе, которая позволяет создавать искусственное разнообразие потенциальных антимикробных средств [1, 2].

Лантипептиды – это группа пептидов грамположительных бактерий, которые синтезируются на рибосомах и подвергаются посттрансляционным модификациям. К посттрансляционным модификациям лантипептидов относится дегидратация остатков Ser и Thr до дегидроаланина (Dha) и дегидробутирина (Dhb) с последующей циклизацией путем образования внутримолекулярных тиоэфирных связей через остаток Cys, вследствие чего образуются неканонические аминокислоты лантионин (Lan) и метил-лантионин (MeLan) [3]. Лантипептиды синтезируются в виде препептида, состоящего из С-концевой последовательности, которая подвергается посттрансляционным модификациям, и N-концевого лидерного пептида, который распознается ферментами модификации и затем удаляется путем протеолиза [4]. Наибольший интерес вызывают лантипептиды, обладающие антимикробной активностью, которые принято называть лантибиотиками [5]. Классификация лантипептидов основана на различиях в строении и механизмах работы ферментов, осуществляющих посттрансляционную модификацию лантипептидов. До недавнего времени выделяли IV класса лантипептидов, однако последние открытия позволяют выделить новый V класс [6].

 

Рис. 1. Структура лантипептида андалусицин: А – первичная структура андалусицина; Б – структура зрелого андалусицина; В – схематичное изображение кластера биосинтеза андалусицина

 

Лантипептид андалусицин был выделен из бактерии Bacillus thuringiensis SV andalusiensis B23193 (рис. 1) [7]. Кластер биосинтеза андалусицина содержит гены лантионинсинтетазы III класса AncKC, осуществляющей посттрансляционную модификацию лантипептидов; метилтрансферазы, осуществляющей метилирование; и ABC-транспортеров, осуществляющих экспорт лантипептидов во внеклеточную среду. Зрелый диметилированный андалусицин обладает выраженной антимикробной активностью в отношении многочисленных видов бактерий рода Bacillus, включая B. cereus, вызывающие выраженные токсикоинфекции у человека. Наличие в структуре лабионинового кольца, характерного только для лантипептидов III класса, делает андалусицин особенно интересным объектом для создания искусственного разнообразия антимикробных пептидов и пептидных молекул с улучшенными свойствами.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Конструирование плазмиды и трансформация бактериальных клеток

Гены ancKC и ancA были получены путем химического синтеза и обработаны эндонуклеазами рестрикции, а затем лигированы в вектор pIvI-His-TEV (рис. 2).

 

Рис. 2. Схематичное изображение генетической конструкции, содержащей транскрипционную единицу биосинтеза андалусицина

 

В качестве штамма-продуцента были выбраны клетки E. coli BL21 (DE3). Полученную генетическую конструкцию использовали для химической трансформации бактерий. Экспрессия генов, содержащихся в конструкции, приводила к совместной продукции препептида и лантионинсинтетазы AncKС, что обеспечивало внесение посттрансляционных модификаций in vivo. Трансформированные клоны отбирали на чашках Петри с агаризованной средой 2xYT (16 г/л Триптона, 10 г/л дрожжевого экстракта, 5 г/л NaCl) с добавлением ампициллина до концентрации 100 мкг/мл.

Наработка модифицированного андалусицина

Единичная колония штамма-продуцента была выбрана для наращивания в 10 мл жидкой среды 2xYT при 37°С в течение ночи. Для инокуляции 100 мл жидкой среды 2xYT использовали 1 мл ночной культуры. Клетки культивировали при 37°С при перемешивании до достижения OD₆₀₀ = 0.4–0.6, после чего добавляли ИПТГ до конечной концентрации 1 мМ и инкубировали клетки при 18°С в течение 18 ч и постоянном перемешивании. По окончании экспрессии клеточную массу осаждали центрифугированием.

Очистка рекомбинантного модифицированного андалусицина

Клеточную массу дезинтегрировали ультразвуком, а затем центрифугировали на скорости 12000 об/мин в течение 20 мин. Использовали лизирующий буфер: 20 мМ Трис-HCl pH 8.0, 500 мМ NaCl. Андалусицин очищали методом металл-хелатной хроматографии c использованием сорбента Ni-NTA (Qiagen, Германия). Для хроматографической очистки пептида использовали буфер нанесения (20 мМ Трис-HCl pH 8.0, 500 мМ NaCl, 10 мМ имидазола) и элюирующий буфер (20 мМ Трис-HCl pH 8.0, 500 мМ NaCl, 300 мМ имидазола). Пробы после хроматографической очистки анализировали с помощью денатурирующего трицинового электрофореза в полиакриламидном геле [8].

Масс-спектрометрический анализ

Для масс-спектрометрического анализа образцы обрабатывали йодацетамидом и подвергали трипсинолизу (Promega, США). Затем 0.5 мкл образца смешивали с 0.5 мкл раствора 2,5-дигидроксибензойной кислоты (40 мг/мл в 30% ацетонитриле, 0.5% ТФУ, Sigma Aldrich) на мишени и высушивали.

Масс-спектры получали на MALDI-времяпролетном масс-спектрометре UltrafleXtreme BrukerDaltonics (Германия) в режиме положительных ионов. Для получения спектров протеолитических пептидов использовали рефлектрон; точность моноизотопных масс однозарядных протонированных ионов была в пределах 0.005% (50 ррm). Спектры фрагментации снимали в тандемном режиме с точностью измерения фрагментных ионов не ниже 1 Да. Идентификацию пептидов проводили по объединенным данным пептидного фингерпринта и спектров фрагментации отдельных пептидов с помощью программ FlexAnalysis 3.3 и Biotools 3.3 (Bruker Daltonics). При помощи программы Mascot 2.3.02 проводили поиск в домашней базе данных, куда предварительно вносили последовательности предполагаемых белков с учетом возможного окисления метионинов кислородом воздуха, возможной модификации остатков Cys йодацетамидом либо β-меркаптоэтанолом, возможного дегидрирования остатков Ser и Thr, возможного фосфорилирования остатков Ser и Thr. Кандидатные белки, имеющие score>56, считали определенными достоверно (p < 0.05). Дополнительно спектры размечали вручную.

Анализ уровня антимикробной активности

Уровень антимикробной активности анализировали, используя метод диффузии в агаре на чашках Петри с агаризованной средой 2хYT без добавления антибиотика. Колонию B. cereus ATCC 4342 наращивали в 10 мл жидкой среды 2xYT при 37°С в течение ночи. После чего с помощью ватного тампона, смоченного в ночной культуре тестовой бактерии, получали бактериальный газон на поверхности агаризованной среды.

Образец модифицированного прекурсора андалусицина обрабатывали протеазой Glu-C (NEB, США) для удаления лидерной последовательности. Полученную реакционную смесь наносили каплями на подготовленные чашки Петри, предварительно поделенные на равные сегменты таким образом, чтобы капли содержали 8, 4, 2, 1 и 0.5 мкг структурного пептида модифицированного андалусицина. Чашки Петри инкубировали при 37°С в течение ночи, после чего выявляли зоны ингибирования роста бактерий.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Андалусицин – лантипептид III класса – состоит из 23 аминокислотных остатков и содержит в своем составе лабиониновое кольцо, которое образуется в результате посттрансляционной модификации пептида-прекурсора лантионинсинтетазой AncKC. Андалусицин проявляет выраженную антимикробную активность против B. сereus ATCC 4342, что делает его интересным объектом для дальнейшего изучения.

В ходе исследования получена генетическая конструкция, объединяющая в единой рамке считывания гены препептида андалусицина и лантионинсинтетазы AncKC. В результате химической трансформации клеток E. coli BL21 (DE3) получен штамм-продуцент модифицированного препептида андалусицина.

Для подтверждения успешной реконструкции реакции модификации анализировали профиль модификаций наработанного препептида андалусицина. Наиболее чистые фракции продукта использовали для проведения масс-спектрометрического анализа.

Масс-спектрометрический анализ показал наличие молекулярных ионов с массой 3606.74 и 2755.28 Да (рис. 3Б). Ион с массой 3606.74 Да соответствует модифицированному полипептиду, расщепленному трипсином по Lys31 (фрагмент В+С), а ион с массой 2755.28 Да – по Lys39 (фрагмент С). Для дальнейшего исследования структуры андалусицина использовали фрагментацию иона фрагмента С (рис. 3В).

 

Рис. 3. Масс-спектрометрический анализ рекомбинантного препептида андалусицина: А – структура препептида андалусицина с указанием сайтов протеолиза; Б – масс-спектр препептида андалусицина после обработки трипсином; В – спектр фрагментации иона 2755.3 Да

 

Анализ спектра фрагментации данного молекулярного иона позволил установить аминокислотную последовательность модифицированного пептида и идентифицировать 11 остатков дегидроаминокислот. Наличие Δm/z 683.84 Да на спектре фрагментации между молекулярным ионом и первым фрагментным ионом соответствует лабиониновому кольцу на С-конце андалусицина. Отсутствие фрагментации в этой части спектра свидетельствует о конформационной жесткости структуры.

Уровень антимикробной активности аналога андалусицина анализировали методом диффузии. В качестве модельного организма использовали штамм B. cereus ATCC 4342. Полученные результаты указывают на антимикробную активность в 20 ± 10 раз меньше, чем у зрелого природного андалусицина, что, вероятно, обусловлено отсутствием двух метильных групп на N-конце структурного пептида у полученного аналога (рис. 4).

 

Рис. 4. Определение активности аналога андалусицина с использованием метода диффузии в агаре. В качестве модельного организма использовали B. cereus ATCC 4342

 

Таким образом, показано, что AncKC вносит в предшественник андалусицина посттранcляционные модификации, соответствующие аналогичным модификациям природного пептида, что обусловлено успешной реконструкцией этой реакции в гетерологической системе E. coli. Наличие минимальной антимикробной активности также указывает на успешную модификацию аналога андалусицина. Присутствие в структуре дегидроаминокислот в совокупности с лабиониновым кольцом на С-конце лантипептида обеспечивает связывание с одним из ключевых компонентов биосинтеза бактериальной клеточной стенки – липидом II.

Результаты данного исследования расширяют наше представление о лантипептидах III класса и открывают новые возможности для направленной модификации рекомбинантных антимикробных пептидов.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Разработка новых антимикробных препаратов – одна из ключевых задач современности. Пептиды являются перспективными кандидатами на роль новых антибиотиков. В частности, некоторые представители лантипептидов демонстрируют выраженную антимикробную активность, что, вместе с уникальными посттрансляционными модификациями, делает их интересными объектами для исследований. Нами получена генетическая конструкция, объединяющая гены лантионинсинтетазы III класса AncKC и лантипептида андалусицина, позволяющая осуществлять совместную наработку и модификацию пептида в гетерологическом продуценте E. coli BL21 (DE3). Масс-спектрометрический анализ рекомбинантного препептида андалусицина подтвердил внесение посттрансляционных модификаций, соответствующих модификациям в природном андалусицине. Полученные результаты расширяют пространство возможностей для использования лантипептидов в области поиска и создания новых антибиотиков.

 

Работа выполнена при поддержке гранта РНФ № 19-14-00331.

Об авторах

Н. З. Мирзоева

Государственный научный центр Российской Федерации Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН

Email: ivansmr@inbox.ru
Россия, Москва, 117997

С. О. Пипия

Государственный научный центр Российской Федерации Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН

Email: ivansmr@inbox.ru
Россия, Москва, 117997

Ю. А. Мокрушина

Государственный научный центр Российской Федерации Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН; Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова, химический факультет

Email: ivansmr@inbox.ru
Россия, Москва, 117997; Москва, 119991

М. В. Серебрякова

Научно-исследовательский институт физико-химической биологии имени А.Н. Белозерского, Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова

Email: ivansmr@inbox.ru
Россия, Москва, 119991

А. А. Григорьева

Центр наук о жизни, Сколковский институт науки и технологий; Институт биологии гена РАН

Email: ivansmr@inbox.ru
Россия, Москва, 121205; Москва, 119334

С. А. Дубилей

Центр наук о жизни, Сколковский институт науки и технологий; Институт биологии гена РАН

Email: ivansmr@inbox.ru
Россия, Москва, 121205; Москва, 119334

С. С. Терехов

Государственный научный центр Российской Федерации Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН

Email: ivansmr@inbox.ru
Россия, Москва, 117997

И. В. Смирнов

Государственный научный центр Российской Федерации Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН; Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова, химический факультет

Автор, ответственный за переписку.
Email: ivansmr@inbox.ru
Россия, Москва, 117997; Москва, 119991

Список литературы

Дополнительные файлы