Метод получения рекомбинантных VSV с подтверждением биологической активности

Полный текст

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

VSV – вирус везикулярного стоматита; rVSV – рекомбинантный вирус везикулярного стоматита; GFP – зеленый флуоресцентный белок; ЦПД – цитопатическое действие; MOI (англ. multiplicity of infection) – множественность заражения; ЦФ – центрифугирование; УЦФ – ультрацентрифугирование; TCID₅₀/мл – тканевая инфицирующая доза вируса; RFP – красный флуоресцентный белок.

ВВЕДЕНИЕ

Онколитические вирусы уже долгое время рассматриваются как возможные противоопухолевые средства. В настоящее время разработка новых онколитических вирусов является одним из приоритетных направлений иммунотерапии опухолей. По последним данным ведется более 200 клинических исследований безопасности и эффективности препаратов на основе онколитических вирусов [1, 2]. РНК-содержащий вирус везикулярного стоматита (VSV) эффективно инфицирует разные типы клеток животных и человека, не будучи патогенным для человека. Низкая вирулентность, быстрый цикл репликации в цитоплазме (без интеграции в геном), возможность получения высокого титра при наработке VSV в культурах клеток млекопитающих (BHK-21, HEK293), возможность генетической модификации и отсутствие в человеческой популяции нейтрализующих антител сделали VSV идеальным кандидатом для получения вирусных вакцин, векторов доставки трансгена и онколитических вирусов [3–5]. Сборка rVSV, например rVSV-dG-GFP, включает этап трансфекции клеток BHK-21 пятью плазмидами и коинфекцию клеток вирусом осповакцины (VV) или иным вирусом, экспрессирующим ДНК-зависимую РНК-полимеразу Т7 (Т7-РНК-полимеразу) [6]. При этом при получении биотехнологических продуктов, которые предполагается использовать в качестве лекарственных препаратов, необходимо минимизировать число вспомогательных вирусов, в частности репликативно-активных, поскольку они могут быть источниками вирусной контаминации. Кроме того, готовая лекарственная форма не должна содержать остатков VV или иных вирусов [7]. В современной литературе крайне мало источников с полным и подробным описанием всех этапов получения, очистки, концентрирования и проверки функциональной активности онколитических вирусов на основе VSV для дальнейшего проведения научных исследований. В настоящей работе разработан метод получения очищенного препарата репликативно-активного модельного rVSV, кодирующего зеленый флуоресцентный белок (rVSV-dM51-GFP), без использования вспомогательного вируса.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Плазмиды и генетическая инженерия

Для клонирования использовали коммерческие плазмиды: pBS-N-ФT-Kan (cat# EH1013, Kerafast, США), pBS-P-ФТ-Аmp (cat# EH1014, Kerafast), pBS-L-ФТ-Amp (cat# EH1015, Kerafast), pBS-G-OT-Kan (cat# EH1016, Kerafast), pCAGGS-G-Kan (cat# EH1017, Kerafast), pVSV-dG-GFP 2.6 (cat# EH1026, Kerafast), а также плазмиду: pCAG-T7pol (cat# 59926, Addgene). Для амплификации плазмид использовали штаммы Escherichia coli (DH5-alpha, NEB® Stable (cat# C3040H, NEB, Англия)). Генетическую трансформацию, гидролиз эндонуклеазами рестрикции, лигирование, гель-электрофорез и выделение ДНК проводили согласно стандартным протоколам и рекомендациям производителей ферментов [8]. Для выделения ДНК использовали коммерческие наборы (кат. # BC021L, кат. # BC124, ЗАО «Евроген» (Россия)). Направленный мутагенез гена VSVМ, кодирующего белок VSVM, проводили с использованием инвертированной ПЦР на матрице pVSV-dG-GFP 2.6 (cat# EH1026, Kerafast) и специфичными праймерами:

прямой GACACCTATGATCCGAATCAATTAAGATATGAGA;

обратный CTCGTCAACTCCAAAATAGGATTTGTCAATTGGA.

В полученную после мутагенеза плазмиду pVSV-dG-dM51-GFP по сайтам узнавания эндонуклеаз рестрикции NheI/XbaI клонировали ген VSVG из плазмиды pCAGGS-G-Kan и получали плазмиду pVSV-dM51-GFP, необходимую для сборки репликативно-активного rVSV-dM51-GFP. Для получения хелперных плазмид с CAG-промотором (pCAG-VSVL, pCAG-VSVN, pCAG-VSVP) в плазмиду pCAG-T7pol по XbaI/NotI-сайтам рестрикции клонировали последовательности гена L, гены N и P клонировали по EcoRI/NotI-сайтам. Амплификацию генов проводили с использованием специфичных праймеров, а в качестве матрицы для амплификации генов VSVN, VSVP и VSVL использовали плазмиды pBS-N-ФT-Kan, pBS-P-ФТ-Аmp, pBS-L-ФТ-Amp соответственно. Правильность сборки векторов проверяли секвенированием по Сэнгеру на ABI 3500 Genetic Analyzer (Applied Biosystems, США) при стандартных условиях и с использованием реагентов, рекомендованных производителем.

Получение клеточных линий HEK293TN-T7 и BHK-21-T7

Ген T7-RNApol, кодирующий Т7-РНК-полимеразу, клонировали в ретровирусный вектор pBabe-bleo (Plasmid #176) по BamHI/SalI-сайтам рестрикции, корректность сборки вектора pBabe-bleo подтверждали рестрикционным анализом и секвенированием по Сэнгеру.

Для получения ретровируса полученной плазмидой трансфицировали клетки Phoenix-AMPHO (CRL-3213 – ATCC) с использованием Lipofectamine® 3000 (cat# L3000015, Thermo Fisher Scientific) согласно рекомендациям производителя. Клетки HEK293TN и BHK-21 заражали культуральной жидкостью с полученным ретровирусом (3 раза каждые 12 ч). Селекцию проводили в течение недели на зеоцине 100 мкг/мл (cat# R25005, Invitrogen by Thermo Fisher Scientific). Выжившие клетки пересевали, через 2 недели после начала селекции проводили скрининг отдельных колоний по наличию встройки гена T7-RNApol в геноме клеток с использованием ПЦР и специфичных праймеров. Для дальнейшей работы отбирали по одному клону клеток HEK293TN-T7 и BHK-21-T7, активность Т7-РНК-полимеразы в которых подтверждали, определяя уровень люминесценции с использованием набора Luciferase Assay System (Promega, США). Для этого проводили трансфекцию клеток следующими векторами экспрессии: плазмидами pEGFPN3 (cat# 632515, Clontech), плазмидой pSmart_5’-Mod-FFLuc-3’-Mod [9], плазмидами pCAG-T7pol и pSmart_5’-Mod-FFLuc-3’-Mod (положительный контроль).

Получение и амплификация rVSV-dM51-GFP

Для сборки rVSV-dM51-GFP клетки HEK293TN-Т7 в лунках 12-луночного планшета при достижении 80–85% конфлюентности трансфицировали плазмидами pCAG-VSVN, pCAG-VSVP, pCAG-VSVL, pCAGGS-G и pVSV-dM51-GFP в соотношении 3:5:1:4:8, соответственно, с использованием PEI (соотношение 5:1) и суммарным количеством ДНК (10.5 мкг). Культуральную жидкость, полученную через 72 ч после трансфекции, использовали для последующей амплификации вируса в адгезионных клетках BHK-21 (cat# 85011433, ECACC General Collection) и в суспензионных клетках HEK293, растущих на бессывороточной среде (BalanCD HEK293, Irvine Scientific). Добавляли вируссодержащие супернатанты (MOI = 10^-4), полученные после ЦФ (3000 g) культуральной жидкости, полученной на предыдущих этапах наработки препарата rVSV-dM51-GFP, и инкубировали клетки в течение 72 ч. Отбирали культуральную жидкость на всех этапах наработки вируса, ЦФ (3000 g) и хранили при –80°С, или использовали сразу для повторной трансдукции или выделения, очистки, исследования вируса и пр. После амплификации вирусов в клетках HEK293 вируссодержащие супернатанты фильтровали через 0.45-мкм фильтры и концентрировали (300 кДа, Vivaspin 6, VS0651, Sartorius) в 100–200 раз с переводом в стандартный фосфатно-солевой буфер (PBS) с рН 7.4 для хранения, очистки или анализа.

Очистка rVSV-dM51-GFP методом ультрацентрифугирования

Для очистки и концентрирования препарата rVSV-dM51-GFP методом УЦФ на первом этапе проводили первичную очистку, осаждение вирусных частиц через «сахарозную подушку», представляющую собой раствор 20% сахарозы в буфере HEN (10 мМ HEPES pH 7.4, 1 мМ EDTA, 100 мМ NaCl). В пробирки для УЦФ (cat# 344061, Beckman Coulter) переносили супернатант с вирусом и вносили под слой супернатанта 4 мл раствора 20% сахарозы. Проводили УЦФ при 120 000 g в течение 1 ч при 4°C, удаляли надосадочную жидкость, осадок ресуспендировали в 500 мкл буфера ET (1 мМ Tris-HCl, pH 7.5, 1 мМ EDTA, 10% ДМСО) и инкубировали в течение 2 ч при 4°C. Далее проводили 2 этап УЦФ в ступенчатом градиенте плотности сахарозы в буфере HEN с тремя различными плотностями (25, 45, 60%), ЦФ при 130 000 g и 4°C в течение 16 ч. Отбирали полосу на границе 25 и 45% растворов. На 3 этапе полученный образец разводили в стандартном PBS (рН 7.4) в 12 раз, ЦФ при 120 000 g и 4°C в течение 1 ч. Осадок, содержащий очищенную фракцию препарата, растворяли в необходимом объеме PBS (рН 7.4).

Анализ образцов препарата rVSV-dM51-GFP методом электронной микроскопии

Использовали сканирующий электронный микроскоп Crossbeam 550 (Carl Zeiss, Германия) в режиме просвечивающей электронной микроскопии (STEM). Образец наносили на предварительно обработанные плазмой воздуха в течение 10 с медные сетки (formvar/carbon (200 mesh), cat#BZ31022a, EMCN, Китай) с помощью установки плазменной очистки Zepto (Diener Electronic), инкубировали в течение 2 мин, далее сетку промывали бидистиллированной водой и контрастировали 1% водным раствором уранилацетата (cat#0379, Polysciences Inc.) 1 мин. Полученные сетки с образцом высушивали на воздухе при комнатной температуре. Съемку проводили при ускоряющем напряжении 30 кВ.

Анализ образцов препарата rVSV-dM51-GFP

Анализ белкового состава образцов проводили с помощью электрофореза в полиакриламидном геле (ПААГ) в денатурирующих условиях с использованием додецилсульфата натрия (ДСН-ПААГ) по стандартному протоколу [10]. Расчет титра (TCID₅₀/мл) препарата rVSV-dM51-GFP осуществляли по методу Рида–Менча [11].

Получение клеточной линии B16F10red

Клеточную линию B16F10Red получали на основе культуры клеток меланомы мыши B16F10 из коллекции опухолевых штаммов ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н. Блохина» (3-й пассаж), полученную из мыши линии С57BL/6. Клетки В16F10 трансдуцировали вирусными частицами, которые содержатся в культуральной среде HEK293TN, трансфицированных плазмидами pMD2.G (cat# 12259, Addgene), pMDLg/pRRE (cat# 12251, Addgene) pRSV-REV (cat# 12253, Addgene) и плазмидой, кодирующей слитый белок H2B-Katushka2 под промотором EF1a. Выжившие в селективной среде клетки пересевали в культуральный флакон площадью 25 см2 и отбирали колонии, имеющие наиболее яркую флуоресценцию репортера H2B-Katushka2. Интенсивность флуоресценции в полученной сублинии B16F10Red детектировали с помощью микроскопа c флуоресцентным модулем (Carl Zeiss Axio Vert.A1).

Мониторинг количества B16F10Red-клеток c помощью lncuCyte S3

Для изучения динамики изменения количества флуоресцирующих клеток B16F10Red после заражения вирусными частицами с разными разведениями препарата rVSV-dM51-GFP клетки инкубировали в течение 84 ч согласно рекомендациям производителя с использованием системы прижизненного клеточного анализа lncuCyte S3, измеряющего количества флуоресцирующих клеток каждые 2 ч.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Классический метод сборки rVSV включает трансфекцию клеток BHK-21 пятью плазмидами, экспрессирующими отдельные гены и полный геном VSV, и коинфекцию клеток вирусом осповакцины или иным вирусом, экспрессирующим Т7-РНК-полимеразу, необходимую для сборки rVSV [6]. Использование отдельных вирусов, экспрессирующих Т7-РНК-полимеразу для сборки rVSV, имеет ряд недостатков, которые были упомянуты выше. Котрансфекция клеток плазмидами для сборки rVSV и плазмидой, кодирующей ген Т7-РНК-полимеразы, позволяет обойтись без нежелательного использования хелперного вируса на этапе сборки rVSV. Использование дополнительной плазмиды в трансфекции увеличивает ДНК-нагрузку на клетки, что может иметь токсический эффект и негативно отразиться на сборке вируса. Поэтому нами были получены клеточные линии HEK293TN-T7 и BHK-21-T7, экспрессирующие Т7-РНК-полимеразу. Для проверки эффективности экспрессии полимеразы измеряли интенсивность люминесценции клеток после трансфекции с плазмидой с геном люциферазы светлячка под промотором Т7-РНК-полимеразы. Показано, что уровень экспрессии люциферазы под промотором Т7-РНК-полимеразы в клетках HEK293TN-T7 достигает уровня в положительном контроле (клетки после трансфекции плазмидой с геном Т7-РНК-полимеразы), но при этом превышает уровень в клетках BHK-21-T7 (рис. 1Б). Поэтому в дальнейшей работе для сборки вирусных частиц модельного rVSV использовали клеточную линию HEK293TN-T7. В качестве модельного вируса для отработки оптимизированной методики получения очищенных препаратов rVSV мы использовали rVSV-dM51-GFP с делецией метионина в 51 позиции белка М VSV (dM51). Известно, что rVSV c данной делецией при попадании в здоровые клетки не подавляет экспрессию интерферонов, что делает такую модификацию полезной с точки зрения безопасности терапевтических препаратов на основе rVSV [12]. Также геном модельного вируса содержит ген VSVG, кодирующий гликопротеин оболочки, необходимый для проникновения вируса в клетки, что делает его репликативно-активным, а также избавляет от необходимости предварительной трансфекции клеточных культур плазмидой с геном VSVG при наработке вирусных препаратов [6, 13]. Для внесения модификаций в геном модельного вируса мы получили плазмиду pVSV-dM51-GFP с делецией dM51 и геном VSVG (рис. 1А). Эту плазмиду использовали для трансфекции на этапе сборки вируса вместе с хелперными плазмидами (pCAG-VSVL, pCAG-VSVN, pCAG-VSVP). Для повышения эффективности этапа сборки модельного rVSV-dM51-GFP мы также сконструировали хелперные плазмиды с CAG-промотором, ориентируясь на данные об использовании этого промотора для сборки rVSV [14], а также на данные, согласно которым CAG-промотор усиливает синтез белка в клетках HEK293F [15]. Чаще всего rVSV нарабатывают в клетках BHK-21 или Vero [16], однако rVSV-dM51-GFP эффективно собирался только в клетках HEK293TN-T7 (рис. 1В). Однако в клетках BHK-21-T7, а также в BHK-21 и Vero-76, трансфицированных с использованием дополнительной плазмиды pCAG-T7pol, мы не наблюдали ни GFP-сигнала, ни ЦПД.

 

Рис. 1. Сборка вирусных частиц rVSV-dM51-GFP. А – карта плазмиды с геномом вируса для сборки rVSV-dM51-GFP. Отмечены мутация dM51 и гены, кодирующие белки rVSV-dM51-GFP, включая встроенный ген VSVG;Б – уровень люминесценции в клетках HEK293TN-T7 и BHK-21-T7;В – микрофотографии клеток HEK293TN-T7 через 72 ч после трансфекции (верхняя строка – отрицательный контроль трансфекции со всеми плазмидами для сборки rVSV-dM51-GFP без коровой плазмиды, кодирующей геном вируса (pCAG-VSVL, pCAG-VSVN и pCAG-VSVP), нижняя строка – трансфекция со всеми плазмидами (pCAG-VSVL, pCAG-VSVN, pCAG-VSVP и pVSV-dM51-GFP), необходимыми для сборки rVSV-dM51-GFP

 

В эффективном варианте сборки rVSV-dM51-GFP соотношение плазмид для трансфекции клеток HEK293TN-T7 отличалось от опубликованных ранее протоколов [6, 14], когда как при соотношениях плазмид, использованных, например, в статье Витта [6], GFP-сигнал и ЦПД были на уровне отрицательного контроля (данные не приведены, так как совпадали с отрицательным контролем как на рис. 1В). Можно предположить, что соотношения плазмид, оптимальные для сборки вирусных частиц модельного вируса rVSV-dM51-GFP, в разных условиях могут отличаться, поэтому, когда rVSV не собирается, можно изменить соотношение плазмид и выбрать оптимальное в данных условиях. В связи с отсутствием полных протоколов цикла наработки rVSV, в этой работе мы приводим метод, подробно описывающий все этапы наработки очищенного препарата модельного вируса rVSV с этапами определения титра и оценки онколитической активности (рис. 2–4).

 

Рис. 2. Схема наработки очищенного препарата rVSV-dM51-GFP в адгезионных и суспензионных культурах клеток

 

Рис. 3. Анализ препарата rVSV-dM51-GFP.А – электрофорез в ПААГ (слева направо):1 – маркер молекулярной массы белков (10–250 кДа),2 – супернатант после ЦФ (3000 g) культуральной жидкости с rVSV-dM51-GFP,3 – образец фракции с rVSV-dM51-GFP после 2 этапа УЦФ,4 – образец очищенного препарата rVSV-dM51-GFP после 3 этапа УЦФ;Б – STEM-микрофотография образца препарата rVSV-dM51-GFP до очистки методом УЦФ, увеличение 130 000;В – STEM-микрофотография образца препарата rVSV-dM51-GFP после очистки путем УЦФ, увеличение 130 000; Г – расчет TCID₅₀ на клетках BHK-21 с фотографиями клеток при наличии (сверху) и отсутствии (снизу) ЦПД

 

Рис. 4. Зависимость доза–эффект препарата rVSV-dM51-GFP на клетках линии B16F10Red. А – микрофотографии клеток полученной линии B16F10Red; Б – динамика изменения ЦПД на клетках линии B16F10Red после добавления препарата rVSV-dM51-GFP в разных разведениях

 

Наработка препарата в суспензионной культуре значительно облегчает процесс масштабирования технологического процесса и упрощает процесс масштабирования лабораторной технологии до объемов промышленных биореакторов и, соответственно, процедуру наработки промышленных серий rVSV [17]. Использование на этапе культивирования бессывороточной среды, как в случае суспензионной культуры HEK293, делает необязательной проверку препарата на содержание компонентов животного происхождения [18]. Оптимизация процесса культивирования HEK293, например, использование культуральных подпиток может значительно увеличить титр вируса [17]. Для очистки препарата rVSV-dM51-GFP от примесей, ингибирующих частиц и концентрирования мы проводили трехступенчатую очистку образцов с использованием УЦФ в градиенте плотности сахарозы (рис. 2). Процесс очистки состоял из этапов концентрирования вирусных частиц, очистки в градиенте плотности сахарозы с последующим выделением и диализом целевой фракции вирусов в PBS (рН 7.4). В аналогичных вариантах очистки VSV порядок этапов варьирует, например, этап концентрирования через так называемую «сахарозную подушку» может быть завершающим [19] или отсутствовать [20]. В данной работе мы центрифугировали культуральную жидкость, содержащую rVSV-dM51-GFP, через 20% сахарозу, чтобы не только сконцентрировать образец, но и предварительно очистить его от части примесей и тем самым увеличить эффективность следующего 2 этапа очистки в градиенте плотности сахарозы. На 2 этапе УЦФ мы использовали следующие концентрации сахарозы: 25%, 45% и 60% [21]. Завершающим этапом очистки был диализ в PBS (рН 7.4) посредством переосаждения с помощью УЦФ (рис. 2). Проведение УЦФ может привести к потере и повреждению вирусных частиц и, соответственно, к снижению титра препарата. Чтобы проверить титр и чистоту препаратов rVSV-dM51-GFP, полученных по предложенной нами схеме (рис. 2), образцы анализировали с помощью ДСН-ПААГ, TCID₅₀ и STEM (рис. 3). Изменение яркости полос, соответствующих пяти белкам rVSV, в ДСН-ПААГ [22, 23] и исчезновение полос неспецифичных примесей указывают на повышение концентрации препарата на каждом этапе очистки (рис. 3А).

Анализ образцов препаратов методом STEM также показал, что после УЦФ препарата rVSV-dM51-GFP количество вирусных частиц в поле видимости возрастает, а количество примесей снижается (рис. 3Б,В). Чтобы проверить, насколько вирусные частицы сохраняют при этом жизнеспособность, мы определили титры препаратов rVSV-dM51-GFP до и после УЦФ, используя определение TCID₅₀ как метод, определяющий именно количество инфекционных вирусных частиц, обладающих цитопатическим действием [11]. В подтверждение данным, полученных методами ДСН-ПААГ-электрофореза и STEM, титр rVSV-dM51-GFP в супернатантах до концентрирования (2× 10⁸ TCID₅₀/мл) был ниже, чем после очистки и концентрирования препарата с помощью УЦФ (4.3 × 10⁹ TCID₅₀/мл) (рис. 3Г). Кроме проведения качественного и количественного анализа нами были также проверены онколитические свойства и зависимость доза–эффект полученного данным методом препарата модельного rVSV на клеточной линии меланомы мыши B16F10 (рис. 4Б), которая часто используется для оценки терапевтических свойств различных препаратов, включая онколитические вирусы, в том числе и для проведения исследований in vivo [24–26]. Визуализация живых клеток при помощи флуоресцентных белков позволяет контролировать рост раковых клеток как в in vitro, так и в in vivo, что в свою очередь дает возможность оценивать терапевтический эффект противоопухолевых препаратов. Для оценки зависимости доза–эффект in vitro мы получили клеточную линию B16F10, экспрессирующую RFP (B16F10Red) (рис. 4A), и использовали метод прижизненного мониторинга количества клеток c помощью lncuCyte S3 (рис. 4Б). В вариантах без добавления препарата и в вариантах с добавлением препарата в больших разведениях (10⁸ и 10¹⁰) наблюдали схожую динамику роста: фаза роста (~0–40 ч), фаза плато (~40–75 ч) и фаза гибели клеток (~75 ч и более). А в варианте с меньшим разведением препарата (10⁷) динамика роста клеток сильно отличалась – примерно через 25 ч после фазы роста начиналась фаза гибели клеток. Строили кривые зависимости количества флуоресцентных объектов от степени разведения добавляемого препарата и наблюдали зависимость доза–эффект количества препарата и количества живых клеток (рис. 4Б). Исходя из этого можно сделать вывод, что после предложенных нами этапов сборки, амплификации и очистки вирусные частицы модельного вируса не теряют жизнеспособность и онколитические свойства, сохраняют способность лизировать раковые клетки при больших разведениях (10⁷–10⁸) препарата.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Нами разработана масштабируемая методика получения очищенного препарата модельного rVSV-dM51-GFP без использования хелперного вируса, включающая этапы наработки, очистки, проверки титра и онколитической активности вируса. Полученный с помощью предложенной нами методики препарат модельного вируса может быть использован для оценки его терапевтических свойств в сингенных in vivo моделях мышей с B16F10-клетками, в том числе, в сравнении с армированными вариантами rVSV, обладающими иммуностимулирующими свойствами [12, 26, 27].

Финансирование проекта осуществлялось Министерством науки и высшего образования Российской Федерации(Соглашение № 075-10-2021-093;Проект GTH-RND-2113).

Об авторах

В. Д. Мороз

Научно-технологический университет «Сириус»

Автор, ответственный за переписку.
Email: moroz.vd@talantiuspeh.ru
Россия, Краснодарский край, пгт Сириус, 354340

Н. Б. Гасанов

Научно-технологический университет «Сириус»

Email: gasanov.nb@talantiuspeh.ru
Россия, Краснодарский край, пгт Сириус, 354340

А. Д. Егоров

Научно-технологический университет «Сириус»

Email: moroz.vd@talantiuspeh.ru
Россия, Краснодарский край, пгт Сириус, 354340

А. С. Малоголовкин

Научно-технологический университет «Сириус»; Первый Московский государственный медицинский университет им. И.М. Сеченова Минздрава России, Сеченовский университет

Email: moroz.vd@talantiuspeh.ru
Россия, Краснодарский край, пгт Сириус, 354340; Москва, 119435

М. О. Нагорных

Научно-технологический университет «Сириус»

Email: moroz.vd@talantiuspeh.ru
Россия, Краснодарский край, пгт Сириус, 354340

Е. Н. Субчева

Научно-технологический университет «Сириус»

Email: moroz.vd@talantiuspeh.ru
Россия, Краснодарский край, пгт Сириус, 354340

Е. С. Колосова

Научно-технологический университет «Сириус»

Email: moroz.vd@talantiuspeh.ru
Россия, Краснодарский край, пгт Сириус, 354340

А. Ю. Физикова

Научно-технологический университет «Сириус»

Email: moroz.vd@talantiuspeh.ru
Россия, Краснодарский край, пгт Сириус, 354340

Р. А. Иванов

Научно-технологический университет «Сириус»

Email: moroz.vd@talantiuspeh.ru
Россия, Краснодарский край, пгт Сириус, 354340

А. В. Карабельский

Научно-технологический университет «Сириус»

Email: moroz.vd@talantiuspeh.ru
Россия, Краснодарский край, пгт Сириус, 354340

Список литературы

Дополнительные файлы