Search for Inhibitors of  Mycobacterium tuberculosis  Transketolase in a Series of Sulfo-Substituted Compounds

Irina V. Gushchina; Гущина Ирина Владимировна; Dmitriy K. Nilov; Нилов Дмитрий Константинович; Tatyana A. Shcherbakova; Щербакова Татьяна Анатольевна; Semen M. Baldin; Балдин Семен Михайлович; Vytautas K. Svedas; Швядас Витаутас Каятоно

doi:10.32607/actanaturae.15709

Поиск ингибиторов транскетолазы из Mycobacterium tuberculosis в ряду сульфозамещенных соединений

Авторы: Гущина И.В.¹, Нилов Д.К.¹, Щербакова Т.А.¹, Балдин С.М.¹, Швядас В.К.¹
Учреждения:
1. Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова
Выпуск: Том 15, № 2 (2023)
Страницы: 81-83
Раздел: Краткие сообщения
URL: https://actanaturae.ru/2075-8251/article/view/15709
DOI: https://doi.org/10.32607/actanaturae.15709
ID: 15709

Цитировать

Полный текст

Аннотация
Полный текст
Об авторах
Список литературы
Дополнительные файлы
Статистика

Аннотация

В результате компьютерного скрининга библиотеки сульфозамещенных соединений выявлены молекулы, способные связываться в активном центре транскетолазы из Mycobacterium tuberculosis. Осуществлена экспериментальная проверка ингибиторной активности наиболее перспективного соединения STK045765 в отношении высокоочищенного препарата рекомбинантного фермента. Показано, что молекула STK045765 конкурирует за участок связывания пирофосфатной группы кофактора тиаминдифосфата и в микромолярных концентрациях способна подавлять активность микобактериальной транскетолазы. Обнаруженный фурансульфонатный скаффолд может служить основой для создания противотуберкулезных препаратов.

Ключевые слова

сульфонаты, сульфогруппа, ингибиторы, тиаминдифосфат, транскетолаза, микобактерии

Полный текст

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

mbТК – транскетолаза микобактерий

ВВЕДЕНИЕ

Лечение туберкулеза основано на продолжительной многокомпонентной химиотерапии и зачастую сопровождается развитием лекарственной устойчивости у Mycobacterium tuberculosis. В связи с этим чрезвычайно актуален поиск новых молекулярных мишеней и разработка препаратов, способных селективно подавлять развитие микобактерий. Анализ генома штамма H37Rv M. tuberculosis позволил установить метаболические пути, подавление которых может служить основой для разработки новых лекарственных средств. В частности, важное значение имеет пентозофосфатный путь и связанный с ним фермент транскетолаза (mbТК) [1, 2]. mbTK катализирует обратимый перенос двухуглеродного фрагмента субстрата-донора (кетосахар) на субстрат-акцептор (альдоза). Один из субстратов mbTK, рибозо-5-фосфат, используется для синтеза клеточной стенки микобактерий [3, 4]. В настоящей работе мы осуществили компьютерный скрининг способности сульфозамещенных соединений связываться в активном центре mbТК и экспериментальную проверку ингибиторных свойств отобранного наиболее перспективного кандидата.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Молекулярная модель mbТК для докинга была получена на основе кристаллической структуры 3rim [4]. Атомы водорода добавляли с учетом ионизационных свойств аминокислотных остатков в программе AmberTools 1.2, затем их координаты оптимизировали в пакете Amber 12 [5] с использованием алгоритмов наискорейшего спуска и сопряженных градиентов. Библиотека сульфозамещенных соединений для скрининга была сконструирована на основе коммерческого набора низкомолекулярных соединений Vitas-M (https://vitasmlab.biz) с использованием структурного поиска по сульфогруппе в программе ACD/SpectrusDB (https://www.acdlabs.com). Соединения докировали в активный центр модели mbТК с помощью Lead Finder 1.1.16 [6]. Область поиска охватывала участок связывания кофактора тиаминдифосфата и субстрата [7]. При докировании отбирали соединения, способные к образованию электростатического взаимодействия с ионом Mg²⁺ (для этого использовали Perl-скрипт структурной фильтрации), а также других благоприятных контактов.

Рекомбинантный белок mbТК получали с использованием плазмиды pET-19b с геном Rv1449c и штамма Escherichia coli BL21(DE3). Выделение и очистку белка проводили как описано ранее [8, 9]. Активность mbТК измеряли по сопряженной реакции восстановления NAD⁺, катализируемой глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназой из мышц кролика [10]. Система для измерения активности содержала: глицил-глицин (50 мМ), дитиотреитол (3.2 мМ), арсенат натрия (10 мМ), хлорид магния (2.5 мМ), тиаминдифосфат (5 мкМ), ксилулозо-5-фосфат (140 мкМ), рибозо-5-фосфат (560 мкМ), NAD⁺ (370 мкМ), глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназу (3 Е) и разные концентрации ингибитора STK045765 (0–1000 мкМ). Реакцию начинали добавлением раствора апоформы mbТК в реакционную смесь, инкубируемую в термостатируемой ячейке при рН 7.6 и 25°С. Скорость реакции регистрировали по увеличению оптической плотности раствора при 340 нм с помощью спектрофотометра Shimadzu UV-1800.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

В активном центре mbТК располагается кофактор тиаминдифосфат, а также ион Mg²⁺ [4]. Взаимодействие пирофосфатной группы с Mg²⁺ вносит существенный вклад в энергию связывания тиаминдифосфата и имеет важное значение для дизайна ингибиторов транскетолаз, которые для mbТК до проведения наших исследований не были известны.

Рис. 1. Химические структуры потенциальных ингибиторов mbТК, отобранных в результате компьютерного скрининга

В качестве возможного структурного миметика пирофосфатной группы, способного образовать электростатическое взаимодействие с ионами металлов, была выбрана сульфогруппа. Из библиотеки коммерчески доступных низкомолекулярных веществ извлечено 320 молекул с концевой (отрицательно заряженной) сульфогруппой и 563 молекулы с этерифицированной сульфогруппой. В результате докинга определены позиции связывающихся соединений этого класса в активном центре mbТК; полученные результаты были подвергнуты структурной фильтрации, учитывающей наличие прямого электростатического взаимодействия сульфогруппы с Mg²⁺. При экспертном анализе позиций отобранных соединений идентифицированы пять соединений с концевой сульфогруппой (рис. 1), эффективно взаимодействующих с Mg²⁺ и окружающими остатками активного центра mbТК. Менее эффективные взаимодействия этерифицированных сульфонатов указывают на то, что для связывания ингибиторов в активном центре mbTK необходима отрицательно заряженная группа.

Рис. 2. Модель фермент-ингибиторного комплекса mbТК и STK045765. Сульфогруппа способна взаимодействовать с ионом Mg²⁺ и образовать водородную связь с остатком His85, гидрофобный бициклический структурный фрагмент комплементарен участку, сформированному остатками Ile211, Leu402 и Phe464. Рисунок подготовлен с использованием VMD 1.9.2 [11]

Для экспериментального тестирования ингибиторных свойств была отобрана молекула STK045765, образующая наиболее благоприятные связи и контакты при моделировании фермент-ингибиторных комплексов. В данной молекуле фурансульфонатный и нафталиновый фрагменты соединены гидразидным линкером. Отрицательно заряженная сульфогруппа STK045765 способна взаимодействовать с ионом Mg²⁺ и боковой цепью His85 (рис. 2) подобно пирофосфатной группе кофактора. Наряду с этим имеют место выгодные гидрофобные контакты бициклического структурного фрагмента STK045765 с боковыми цепями Ile211, Leu402 и Phe464. Экспериментальная проверка подтвердила выводы молекулярного моделирования. При добавлении ингибитора в реакционную смесь обнаружено подавление активности mbТК: так в присутствии STK045765 в концентрации 1 мМ остаточная активность составила 27% (рис. 3).

Ile211, Leu402 и Phe464. Рисунок подготовлен с использованием VMD 1.9.2 [11]

Рис. 3. Влияние ингибитора STK045765 на каталитиче- скую активность mbТК

ВЫВОДЫ

Компьютерный скрининг библиотеки сульфозамещенных соединений позволил идентифицировать потенциальные ингибиторы, способные связываться в активном центре mbТК и конкурировать с кофактором тиаминдифосфатом. Экспериментальная проверка одного из кандидатов (STK045765, содержащего фурансульфонатную группу) в отношении высокоочищенного препарата mbTK подтвердила, что соединения данного класса способны подавлять ферментативную активность. В результате проведенного исследования обнаружен первый (в своем классе) ингибитор mbТК, структура которого может стать основой для разработки более эффективных ингибиторов – прототипов противотуберкулезных препаратов.

*************

Работа выполнена при финансовой поддержке Российского научного фонда (грант № 15-14-00069-П).