Специфичность пенициллинацилаз в реакции снятия защитной группы в N-бензилоксикарбонильных производных аминокислот

Обложка

Цитировать

Полный текст

Аннотация

Изменение структуры N-ацильной группы в производных аминокислот существенным образом влияет как на узнавание, так и на активность пенициллинацилаз в этом ряду субстратов. Тем не менее, как пенициллинацилаза из Alcaligenes faecalis, так и пенициллинацилаза из Escherichia coli способны снимать N-бензилоксикарбонильную защитную группу c производных аминокислот в мягких условиях без использования токсичных реагентов и могут быть использованы в органическом синтезе.

Полный текст

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ ПА – пенициллинацилаза; ВЭЖХ – высокоэффективная жидкостная хроматография; PMSF – фенилметилсульфонилфторид; NIPAB – 6-нитро-3-фенилацетамидобензойная кислота; о-ФA – о-фталевый альдегид; NAC – N-ацетил-L-цистеин; Z – N-бензилоксикарбонильная группа.

ВВЕДЕНИЕ

Маскировка функциональных групп является важной частью органического синтеза [1, 2]. Использование ферментов для введения и снятия защитных групп существенно расширяет возможности в этой области, вплоть до применения новых реагентов и изменения условий проведения этих стадий. Так, в химическом пептидном синтезе, проводимом преимущественно в органических растворителях, используется один набор реагентов, а при использовании ферментов, например, для маскировки аминогрупп, возможно применение фенилацетильных [3], фталильных [4], ацетильных [5] защитных групп. Использование биокатализа в органическом синтезе, особенно при получении лекарственных препаратов, направлено также на поиск ферментов, способных катализировать традиционные химические реакции и сделать их более привлекательными с экологической и экономической точки зрения. В качестве примера можно привести отщепление бензилоксикарбонильной защитной группы в аминосоединениях, традиционно проводимое каталитическим гидрированием, восстановлением натрием в жидком аммиаке, а также ацидолизом с помощью бромоводорода в уксусной кислоте [1, 2]. Среди ограничений и недостатков этих методов можно выделить следующие: активно используемый метод гидрирования на палладиевом катализаторе нельзя применить, если в структуре соединения есть органические сульфиды, в том числе остатки цистеина или метионина [6]. Можно проводить деблокирование в присутствии циклогексиламина или эфирата трехфтористого бора [7], однако метод не селективен при наличии восстанавливаемых функциональных групп, таких, как C=C, C=O, CN, NO2, формильной, карбамоильной и др. [8]. Следует также принимать во внимание токсичность палладия и отсутствие методов надежного удаления его следов из конечного продукта, что чрезвычайно важно при синтезе лекарственных препаратов [9]. При восстановительном расщеплении натрием в жидком аммиаке [10] одновременно с бензилоксикарбонильным остатком отщепляются другие защитные группы, сложные эфиры, хотя бы частично, превращаются в амиды, разрушаются остатки треонина, частично деметилируются остатки метионина, происходит расщепление некоторых пептидных связей. При ацидолитическом расщеплении идут побочные реакции переэтерификации, ацетилирования остатков треонина и серина, разрушаются остатки триптофана, нитроаргинина, бензиловые эфиры и амидные группы [11]. Наряду с оптимизацией условий проведения этих реакций с целью снижения вклада побочных процессов интерес представляет разработка биокаталитических методов снятия N-бензилоксикарбонильной защиты аминогрупп. При развитии этого направления были обнаружены новые ферменты: уретангидролазы [12, 13], снимающие бензилоксикарбонильную защиту ферменты в Sphingomonas paucimobilis, Burkholderia phenazinium и Arthrobacter sp. [14–16], показана способность пенициллинацилазы из Escherichia coli расщеплять N-бензилоксикарбонильные производные аминокислот [17]. Целью данной работы было изучить как меняется специфичность пенициллинацилаз из Alcaligenes faecalis и E. coli при изменении структуры N-ацильной группы (замене фенилацетильного остатка на бензилоксикарбонильный) в структуре субстрата и сравнить способности двух ферментов снимать защитную группу.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Реагенты

В работе использовали фенилацетилхлорид (Sigma, США); фенилметилсульфонилфторид (Merck, ФРГ); ацетонитрил («Криохром», Россия); N-фенилацетильные производные α-аминокислот синтезировали как описано ранее [18]. Препарат пенициллинацилазы из E. coli выделяли как описано ранее [19], препарат пенициллинацилазы из A. faecalis предоставлен компанией ООО «Инновации и высокие технологии МГУ», концентрацию активных центров пенициллинацилаз определяли титрованием фенилметилсульфонилфторидом (PMSF) как описано ранее [20, 21].

Определение kкат и KM гидролиза N-ацильных производных аминокислот под действием пенициллинацилаз

Кинетические эксперименты проводили в термостатируемой ячейке спектрофотометра Shimadzu UV-1601 при 400 нм и 25оС в 0.01 M фосфатном буфере pH 7.5 в присутствии 0.1 M KCl. Значения константы Михаэлиса (KM) для гидролиза N-фенилацетильных и N-бензилоксикарбонильных производных аминокислот определяли как константы конкурентного ингибирования гидролиза цветного субстрата NIPAB этими соединениями при анализе зависимости наблюдаемой константы Михаэлиса гидролиза NIPAB от концентрации N-фенилацетильного или N-бензилоксикарбонильного производного аминокислоты. Определение каталитических констант ферментативного гидролиза N-фенилацетильных и N-бензилоксикарбонильных производных аминокислот проводили при насыщающей концентрации субстрата (численно равной 10 и 20 KM) для определения максимальной скорости ферментативной реакции. За протеканием реакции следили при помощи отбора проб и спектрофотометрической регистрации образующихся аминогрупп после модификации о-фталевым альдегидом. В типичном эксперименте раствор N-ацильного производного аминокислоты в 0.01 M фосфатном буфере pH 7.5, содержащем 0.1 M KCl, помещали в термостатируемую ячейку при 25оС и при перемешивании добавляли необходимое количество фермента. Через определенное время отбирали пробы (15–30 мкл) реакционной смеси, смешивали их с 50 мкл 10 мМ раствора PMSF в изопропаноле для остановки реакции, разбавляли до нужной концентрации и анализировали при помощи ВЭЖХ. Для определения начальных скоростей ферментативного гидролиза обычно отбирали 8–10 проб, степень превращения субстрата при этом не превышала 10%.

ВЭЖХ-анализ с предколоночной модификацией аминогрупп о-фталевым альдегидом

Модификацию первичных аминогрупп проводили следующим образом: к 900 мкл 0.5 мМ раствора аминосоединения в 0.4 М боратном буфере pH 9.6 при 25оС добавляли 50 мкл метанольного раствора, содержащего NAC (40 мМ) и о-ФA (20 мМ). Смесь перемешивали, через 15 мин разбавляли элюентом для хроматографии, центрифугировали в течение 3 мин при 12000 об/мин и анализировали. Хроматографическая система состояла из модуля подачи элюента Waters M6000, инжектора типа Reodyne 7 125 с петлей объемом 50 мкл, колонки для обращенно-фазовой хроматографии Nucleosil C1-8 Chrompack Varian (250×4 мм, 5 мкм) и детектора Waters M481 LC. Хроматограммы регистрировали на программно-аппаратном комплексе для сбора и обработки хроматографических данных Мультихром («Амперсенд», Россия). Скорость потока 1 мл/мин. Образующиеся изоиндолы анализировали при 340 нм с использованием в качестве подвижной фазы 6 мМ фосфатного буфера pH 6.8, содержащего ацетонитрил (10–40% по объему).

Прямой ВЭЖХ-анализ компонентов реакционной смеси

ВЭЖХ-анализ компонентов реакционной смеси без предколоночной модификации образующихся аминогрупп проводили при помощи хроматографической системы Waters, колонки Kromasil Eternity-5-C18 column (Eka Chemicals, Швеция) с использованием 6 мМ фосфатного буфера pH 3.0, содержащего ацетонитрил (30% по объему) и 0.1 г/л додецилсульфата натрия, при 210 нм и скорости потока 1 мл/мин.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Схема ферментативного гидролиза N-фенилацетильных и N-бензилоксикарбонильных производных аминокислот представлена на рис. 1. Необходимо отметить отличие продуктов в этих двух реакциях: при снятии N-фенилацетильной защиты и выделении аминокислоты со свободной аминогруппой образуется фенилуксусная кислота, в то время как при снятии N-бензилоксикарбонильной защиты наряду с аминокислотой накапливается бензиловый спирт и выделяется СО2.

 

Рис. 1. Реакции снятия фенилацетильной и бензилоксикарбонильной защитных групп, катализируемые пенициллинацилазами

 

Отличие ацильных групп на один атом кислорода приводит к существенному изменению в эффективности связывания субстратов в активном центре пенициллинацилаз, это характерно как для пенициллинацилазы из A. faecalis, так и для пенициллинацилазы из E. coli. Изменение в структуре N-ацильной группы не меняет специфичность ферментов к боковому радикалу аминокислоты, о чем свидетельствуют корреляции между значениями константы Михаэлиса в реакциях снятия N-фенилацетильной и N-бензилоксикарбонильной защиты, катализируемых обеими пенициллинацилазами. В то же время оба фермента отличаются по своей специфичности к этому структурному фрагменту: если наименее эффективно связывающимися субстратами пенициллинацилазы из E. coli являются производные аспарагиновой кислоты (рис. 2), то для пенициллинацилазы из A. faecalis это производные аргинина (рис. 3).

 

Рис. 2. Корреляция между значениями констант Михаэлиса (KM) в реакциях гидролиза N-фенилацетильных (ось абсцисс) и N-бензилоксикарбонильных (ось ординат) производных аминокислот, катализируемых пенициллинацилазой из E. coli

 

Рис. 3. Корреляция между значениями констант Михаэлиса (KM) в реакциях гидролиза N-фенилацетильных (ось абсцисс) и N-бензилоксикарбонильных (ось ординат) производных аминокислот, катализируемых пенициллинацилазой из A. faecalis

 

При замене фенилацетильного остатка на бензилоксикарбонильный сродство обоих ферментов к субстрату снижается более чем на порядок, при этом пенициллинацилаза из A. faecalis проявляет более высокое сродство к новым субстратам (значения KM в интервале 0.08–1.6 мМ).

В то время как сродство обоих ферментов к субстратам зависит от природы боковой цепи аминокислоты, этот структурный фрагмент по-разному влияет на реакционную способность пенициллинацилаз (рис. 4). Природа боковой цепи аминокислоты в ряду N-фенилацетильных производных аминокислот слабо влияет на каталитическую активность пенициллинацилазы из A. faecalis (верхний правый рисунок), в то время как реакционная способность пенициллинацилазы из E. coli сильно зависит от этого структурного фрагмента и падает в ряду N-Phac-Ala, Glu, Asp, Arg, Val более чем в 20 раз (верхний левый рисунок). При замене фенилацетильного остатка на бензилоксикарбонильный снижается реакционная способность ферментов. Так, активность пенициллинацилазы из E. coli падает в 10–49 раз в зависимости от структуры бокового радикала аминокислотного остатка, а пенициллинацилаза из A. faecalis еще более чувствительна к такому структурному изменению: активность фермента уменьшается на два порядка. Тем не менее, обе пенициллинацилазы способны снимать защитные N-бензилоксикарбонильные группы в производных аминокислот (рис. 5), а введением мутаций в структуру ферментов можно увеличить каталитическую активность к неспецифическим субстратам. Опыт изучения пенициллинацилазы из E. coli показывает, что методами белковой инженерии удается повысить как каталитическую активность, так и сродство фермента к субстратам [22].

 

Рис. 4. Каталитическая активность пенициллинацилаз из E. coli (левые рисунки) и A. faecalis (правые рисунки) в реакциях гидролиза N-фенилацетильных и N-бензилоксикарбонильных производных аминокислот, выраженная как значение каталитических констант по отношению к производным аланина (в процентах): верхние рисунки показывают активность ферментов по отношению к N-фенилацетильным производным аминокислот, нижние – к N-бензилоксикарбонильным производным аминокислот

 

Рис. 5. Снятие N-бензилоксикарбонильной защитной группы, катализируемое пенициллинацилазой из A. faecalis. Красными точками представлено изменение концентрации субстрата (N-бензилоксикарбонил-L-Ala), желтыми – накопление продукта превращения (бензилового спирта). Условия реакции: рН 7.5, 25оС, концентрация субстрата 1 мМ, концентрация фермента 6 мкМ

 

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Проведенное исследование показало, что изменение структуры N-ацильной группы в производных аминокислот существенным образом влияет как на узнавание, так и на активность пенициллинацилаз в этом ряду субстратов. Тем не менее, как пенициллинацилаза из A. faecalis, так и пенициллинацилаза из E. coli способны снимать N-бензилоксикарбонильную защитную группу в производных аминокислот в мягких условиях без использования токсичных реагентов и могут быть использованы в органическом синтезе. Эффективность такого биокаталитического снятия защитной группы может быть улучшена при использовании современных методов рационального дизайна ферментов.

Работа выполнена при поддержке Российского научного фонда (грант № 21-71-30003).

×

Об авторах

Ирина Александровна Морозова

Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова

Email: vytas@belozersky.msu.ru

НИИ физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского

Россия, Москва, 119991

Дорел Феодорович Гуранда

Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова

Email: vytas@belozersky.msu.ru

НИИ физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского

Россия, Москва, 119991

Николай Владимирович Панин

Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова; Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова

Email: vytas@belozersky.msu.ru

НИИ физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского; Научно-исследовательский вычислительный центр

Россия, Москва, 119991; Москва, 119991

Витаутас К. Швядас

Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова; Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова; Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова

Автор, ответственный за переписку.
Email: vytas@belozersky.msu.ru

НИИ физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского; Научно-исследовательский вычислительный центр; факультет биоинженерии и биоинформатики

Россия, Москва, 119991; Москва, 119991; Москва, 119991

Список литературы

  1. Kadereit D., Waldmann H. // Chem. Rev. 2001. V. 101. № 11. P. 3367–3396.
  2. Sartori G., Maggi R. // Chem. Rev. 2010. V. 113. P. 1–54.
  3. Didziapetris R.J., Drabnig B., Schellenberger V., Jakubke H.-D., Svedas V.K. // FEBS Lett. 1991. V. 287. P. 31–33.
  4. Costello C.A., Kreuzman A.J., Zmijewski M.J. // Tetrahedron Lett. 1996. V. 37. № 42. P. 7469–7472.
  5. Simons C., van Leeuwen J.G.E., Stemmer R., Arends I.W.C.E., Maschmeyer T., Sheldon R.A., Hanefeld U. // J. Mol. Catal. B Enzym. 2008. V. 54. № 3–4. P. 67–71.
  6. Sewald N., Jakubke H.-D. Peptides: Chemistry and Biology. 2nd еd. Weinheim: Wiley, 2009. 594 p.
  7. Yajima H. // Chem. Pharm. Bull. Japan. 1968. V. 16. P. 1342.
  8. Medzihradszky K., Medzihradszky-Schweiger H. // Acta Chem. Acad. Sci. Hung. 1965. V. 44. P. 15–18.
  9. Ojha N.K., Zyryanov G.V., Majee A., Charushin V.N., Chupakhin O.N., Santra S. // Coordination Chem. Rev. 2017. V. 353. P. 1–57.
  10. Sifferd R.H., Vigneaud V. // J. Biol. Chem. 1935. V. 108. P. 753.
  11. Wunsch E., Drees F. // Chem. Ber. 1966. V. 99. P. 110.
  12. Matsumura E., Shin T., Murao S., Sakaguchi M., Kawano T. // Agric. Biol. Chem. 1985. V. 49. № 12. P. 3643–3645.
  13. Matsumura E., Yamamoto E., Kawano T., Shin T.H., Murao S. // Agric. Biol. Chem. 1986. V. 50. № 6. P. 1563–1571.
  14. Patel R.N., Nanduri V., Brzozowski D., McNamee C., Banerjee A. // Adv. Synth. Catal. 2003. V. 345. P. 830–834.
  15. Chu L.N., Nanduri V.B., Patel R.N., Goswami A. // J. Mol. Catal. B Enzym. 2013. V. 85–86. P. 56–60.
  16. Maurs M., Acher F., Azerad R. // J. Mol. Catal. B Enzym. 2012. V. 84. P. 22–26.
  17. Alvaro G., Feliu J.A., Caminal G., Lopez-Santin J., Clapes P. // Biocatal. Biotransformation. 2000. V. 18. № 3. P. 253–258.
  18. Guranda D.T., van Langen L.M., van Rantwijk F., Sheldon R.A., Svedas V.K. // Tetrahedron: Asymmetry. 2001. V. 12. P. 1645–1650.
  19. Ясная А.С., Ямскова О.В., Гуранда Д.Ф., Щербакова Т.А., Тишков В.И., Швядас В.К. // Вестник МГУ. Серия 2. Химия. 2008. Т. 49. С. 127–133.
  20. Швядас В.К., Марголин А.Л., Шерстюк С.Ф., Клесов А.А., Березин И.В. // Биоорган. химия. 1977. Т. 3. С. 546–554.
  21. Švedas V., Guranda D., van Langen L., van Rantwijk F., Sheldon R. // FEBS Lett. 1997. V. 417. P. 414–418.
  22. Shapovalova I.V., Alkema W.B.L., Jamskova O.V., de Vries E., Guranda D.T., Janssen D.B., Švedas V.K. // Acta Naturae. 2009. V. 1. P. 94–98.

Дополнительные файлы

Доп. файлы
Действие
1. JATS XML
Скачать
2. Рис. 1. Реакции снятия фенилацетильной и бензилоксикарбонильной защитных групп, катализируемые пенициллинацилазами

Скачать (129KB)
Метаданные
3. Рис. 2. Корреляция между значениями констант Михаэлиса (KM) в реакциях гидролиза N-фенилацетильных (ось абсцисс) и N-бензилоксикарбонильных (ось ординат) производных аминокислот, катализируемых пенициллинацилазой из E. coli

Скачать (77KB)
Метаданные
4. Рис. 3. Корреляция между значениями констант Михаэлиса (KM) в реакциях гидролиза N-фенилацетильных (ось абсцисс) и N-бензилоксикарбонильных (ось ординат) производных аминокислот, катализируемых пенициллинацилазой из A. faecalis

Скачать (80KB)
Метаданные
5. Рис. 4. Каталитическая активность пенициллинацилаз из E. coli (левые рисунки) и A. faecalis (правые рисунки) в реакциях гидролиза N-фенилацетильных и N-бензилоксикарбонильных производных аминокислот, выраженная как значение каталитических констант по отношению к производным аланина (в процентах): верхние рисунки показывают активность ферментов по отношению к N-фенилацетильным производным аминокислот, нижние – к N-бензилоксикарбонильным производным аминокислот

Скачать (461KB)
Метаданные
6. Рис. 5. Снятие N-бензилоксикарбонильной защитной группы, катализируемое пенициллинацилазой из A. faecalis. Красными точками представлено изменение концентрации субстрата (N-бензилоксикарбонил-L-Ala), желтыми – накопление продукта превращения (бензилового спирта). Условия реакции: рН 7.5, 25оС, концентрация субстрата 1 мМ, концентрация фермента 6 мкМ

Скачать (66KB)
Метаданные

© Морозова И.А., Гуранда Д.Ф., Панин Н.В., Швядас В.К., 2023

Creative Commons License
Эта статья доступна по лицензии Creative Commons Attribution 4.0 International License.

Данный сайт использует cookie-файлы

Продолжая использовать наш сайт, вы даете согласие на обработку файлов cookie, которые обеспечивают правильную работу сайта.

О куки-файлах