CRISPR/Cas9 Essential Gene Editing in Drosophila

Igor S. Osadchiy; Осадчий Игорь С.; Kamalyan O. Sophia; Софья Камалян О.; Karina Yu. Tumashova; Тумашова Карина Ю.; Pavel G. Georgiev; Георгиев Павел  Г.; Oksana G. Maksimenko; Максименко Оксана Г.

doi:10.32607/actanaturae.11874

Редактирование жизненно важных генов с помощью системы CRISPR/Cas9 на модели дрозофилы

Авторы: Осадчий И.С.¹, Софья К.О.¹, Тумашова К.Ю.¹, Георгиев П..¹, Максименко О.Г.¹
Учреждения:
1. Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биологии гена Российской академии наук
Выпуск: Том 15, № 2 (2023)
Страницы: 70-74
Раздел: Экспериментальные статьи
Дата подачи: 08.12.2022
Дата принятия к публикации: 04.04.2023
Дата публикации: 03.08.2023
URL: https://actanaturae.ru/2075-8251/article/view/11874
DOI: https://doi.org/10.32607/actanaturae.11874
ID: 11874

Цитировать

Полный текст

Аннотация
Полный текст
Об авторах
Список литературы
Дополнительные файлы
Статистика

Аннотация

Система редактирования на основе CRISPR/Cas9 в последние годы стала основным инструментом манипуляций с геномами разных организмов. Однако при использовании данного метода исследователи часто сталкиваются с низкой эффективностью внесения изменений и с разрезами в нецелевых участках генома (off-target). Более того, редактирование жизненно важных генов часто заканчивается неудачей вследствие повышенной летальности при эффективном разрезании обoих аллелей гена интереса (ГИ). В статье предложена новая стратегия геномного редактирования с помощью CRISPR/Cas9-системы, основанная на том, что чем более важен ген для выживания организма, тем с меньшей эффективностью детектируются успешные случаи его редактирования и параллельно наблюдается все большее число разрезания нецелевых участков, что по сути является «ошибкой выжившего». В представленном методе в геном редактируемого организма предварительно вносят дополнительную копию ГИ, способную обеспечить уровень экспрессии гена, достаточный для выживания организма. Последующее применение CRISPR/Cas9-системы на фоне избыточной экспрессии ГИ позволило получить успешно редактированные линии дрозофилы с делециями трех жизненно важных генов – trf2, mep-1 и top2.

Ключевые слова

CRISPR/Cas9, редактирование генома, редактирование жизненно важных генов, гены домашнего хозяйства

Полный текст

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

гРНК – гидовая РНК

Хр – хромосома

TRF2 – родственный ТВР фактор 2 (ТВР related factor 2)

Top2 – топоизомераза 2 (Topoisomerase 2)

MEP-1 – взаимодействующие с MOG и эктопические Р-гранулы (MOG interacting and ectopic P-granules)

ВВЕДЕНИЕ

Развитие системы CRISPR/Cas9 в качестве программируемого инструмента для внесения двухцепочечных разрывов в ДНК существенно расширило возможности исследования функций генов и регуляторных элементов генома. Наиболее широко CRISPR/Cas9-система используется для получения нокаута гена интереса (ГИ) за счет внесения разрывов, приводящих к сдвигу рамки считывания. Стоит отметить, что ГИ может быть жизненно важным и попытки получить его нокаут при помощи CRISPR/Cas9-системы часто оказываются безуспешными либо из-за летальности успешно редактированных эмбрионов, либо за счет биологической пластичности – появления альтернативного старт-кодона, пропуска дефектного экзона и т.д. [1]. В представленной работе CRISPR/Cas9-система редактирования применена на фоне избыточной экспрессии ГИ, что позволило достаточно эффективно получить нокауты трех жизненно важных генов у дрозофилы. Похожий подход был недавно протестирован на клеточной линии человека HEK293T [2]. В настоящей работе нами осуществлено внесение достаточно протяженных делеций в кодирующие участки ГИ с сопутствующим встраиванием посадочной платформы, содержащей в своем составе участок для сайт-специфической рекомбинации, позволяющий быстро и эффективно встраивать модифицированные производные ГИ.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Рис. 1. Общая схема редактирования. A – вставка репортерного гена 1 (yellow) и копии гена интереса (ГИ), которая не содержит мишеней для CRISPR/Сas9-системы, в локус типа «тихая гавань» с помощью сайт- специфической рекомбинации. Б – микроинъекция эмбрионов матрицей для гомологичной рекомбинации (ГР) и плазмидами, экспрессирующими Cas9 и гРНК. В – внесение двухцепочечных разрывов в геномный участок интереса с помощью CRISPR/Cas9 и гомологичная рекомбинация с плазмидной матрицей, содержащей репор- терный ген 2 (mCherry), окруженный loxP-сайтами, и attP-сайт. Г – интеграция модифицированной последова- тельности гена интереса с последующим CRE-опосредованным вырезанием репортерных генов 2 (mCherry) и 3 (white) и скрещивание для замены хромосомы с копией ГИ (Хр II) на хромосому дикого типа

Представленная стратегия дополняет методы, описанные в статьях [3–5], и подходит для повсеместно экспрессирующихся жизненно важных генов. Предложенный подход состоит из трех этапов (рис. 1):

Встраивание копии ГИ без узнаваемых системой CRISPR/Cas9 последовательностей вместе с репортерным геном 1 в локус без жизненно важных генов («тихая гавань») и находящийся на хромосоме, на которой не представлен нативный ГИ. На данном этапе получается спасающая линия с гетерологичной экспрессией копии ГИ. В настоящей работе для данного этапа созданы конструкции, содержащие последовательности, кодирующие белки TRF2, Top2 и MEP-1, под контролем промотора гена Ubi-p63E и гена yellow в качестве репортерного гена 1. Нокаут данных генов приводит к эмбриональной летальности. Конструкции встроены с помощью φC31-опосредованной сайт-специфической рекомбинации в локусы 86Fb (TRF2, Top2) и 38D (MEP-1).
Замена протяженного участка кодирующей области нативного ГИ сайтом attP путем коинъекции трех плазмид, кодирующих белок Cas9 и гРНК, а также с матрицей для гомологичной рекомбинации, которая содержит сайт узнавания φC31-интегразы attP и репортерный ген 2 (mCherry), окруженный сайтами loxP. На данном этапе получается линия с нокаутом ГИ на фоне экспрессии его копии. Для CRISPR/Cas9-опосредованного редактирования ГИ использовали экспрессирующие Cas9 линии мух, полученные из депозитария Bloomington в Университете Индианы: BL54591 (Сas9 под контролем промотора nanos) и BL58492 (Cas9 под контролем промотора Actin5C). В альтернативном варианте в смесь для инъекции добавляли вектор, экспрессирующий Cas9 (Addgene #62209). CRISPR-мишени были выбраны с помощью инструмента fly CRISPR Optimal Target Finder (Университет Висконсина) [4] и клонированы в вектор на основе плазмиды pCFD4-U6:1_U6:3tandemgRNAs (Addgene #49411). Для делеции trf2 использовали участки: гРНК1 (tcttcgtgcatactcttagc), гРНК2 (tgcttttcgcttcggtgtcc) и гРНК3 (accaagtagctagagactta); пара гРНК1/гРНК2 приводит к делеции геномного фрагмента размером 6.7 т.п.н., гРНК1/гРНК3 – 1.1 т.п.н. Для mep-1 использовали гРНК1м (acgaacagcagggcgcgcgc), гРНК2м (cagcaagtgacgctggcttg) и гРНК3м (aggggatcttcggcctcgca), приводящие к делеции 5.6 т.п.н. (гРНК1м/гРНК2м) и 2 т.п.н. (гРНК1м/гРНК3м). Для делеции top2 использовали гРНК1т (gttcccagtacagtagcacc) и гРНК2т (tctacggcgtgttcccgctt), приводящие к делеции 2 т.п.н.

Мух, полученных после инъекции (F0), индивидуально скрещивали с мухами линии y¹w¹¹¹⁸, и потенциальные события редактирования генома в потомстве (F1) выявляли с помощью флуоресценции mCherry. Правильность встраивания посадочной платформы (attP-mCherry) в геном проверяли с помощью ПЦР и секвенирования редактированных участков генома.

Встройка в посадочную платформу модифицированных вариантов ГИ вместе с окруженным loxP-сайтами репортерным геном 3 (ген white). Встройка осуществляется за счет коинъекции содержащей attB-сайт конструкции и вспомогательной плазмиды с геном интегразы φC31 (Addgene #26290). Репортерные гены 2 и 3 удаляли при помощи CRE-опосредованной сайт-специфической рекомбинации.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

TRF2 – это паралог базального фактора транскрипции TBP, инактивация которого ассоциирована с эмбриональной летальностью [6, 7].

Рис. 2. Схемы замены ГИ – trf2 (А), mep-1 (Б), top2 (В) – на посадочную платформу (attP-сайт и репортерный ген mCherry) при частичной или полноразмерной делеции

Ранее, несмотря на использование разных источников Cas9 (экспрессия с инъецированного в эмбрион плазмидного вектора или использование линии мух с конститутивной экспрессией Cas9) и двух комбинаций гРНК, нам не удалось заменить ген trf2 на посадочную платформу для последующей сайт-специфической встройки мутантных вариантов гена [8]. Последовательность всего гена trf2 составляет около 25 т.п.н., в то время как его кодирующая часть укладывается в 7 т.п.н. Использованные комбинации гРНК приводят к образованию двух двухцепочечных разрывов ДНК на расстоянии 6.7 или 1.1 т.п.н. для того, чтобы заменить всю кодирующую часть гена или участок, содержащий только старт-кодон, на платформу (рис. 2А).

Результаты, полученные при использовании разных схем замены гена trf2 с помощью CRISPR/Cas9, показаны в табл. 1.

Таблица 1. Результаты микроинъекций смеси плазмид для замены гена на посадочную платформу для генов trf2, mep-1 или top2

Линия мух		Источник Cas9	Делеция, п.н.	Инъецировано эмбрионов	Вылетело из куколок, F0	Линии F1 mCherry+	Нецелевые встройки
TRF2	y¹w¹¹¹⁸	Инъекция Сas9 вектора	6700	200	100	–	–
	54591	Cas9 под промотором nanos	6700	250	140	1	+
	58492	Cas9 под промотором Actin5C	6700	200	80	–	–
	58492	Cas9 под промотором Actin5C	1100	250	120	–	–
	y¹w¹¹¹⁸+сверхэкспрессия TRF2	Инъекция Сas9вектора	6700	100	80	5	2
	y¹w¹¹¹⁸+сверхэкспрессия TRF2	Инъекция Сas9вектора	1100	100	80	5	2
MEP-1	y¹w¹¹¹⁸	Инъекция Сas9	2000	300	160	–	–
	y¹w¹¹¹⁸	Инъекция Сas9	5600	150	90	1	–
	y¹w¹¹¹⁸+сверхэкспрессия MEP-1	вектора	5600	240	175	4	–
TOP2	y¹ w¹¹¹⁸	Инъекция Сas9	2053	150	100	–	–
TOP2	y¹w¹¹¹⁸+сверхэкспрессия Top2	вектора	2053	150	80	3	–

Полученные после инъекции эмбрионы F0 без cверхэкспрессии trf2 имели низкий уровень выживаемости. При этом экспрессия репортера mCherry в развивающихся особях варьировала по интенсивности от места инъекции по всему телу. Эмбрионы с наиболее ярким свечением mCherry погибали на последующих стадиях развития. В результате после скрещивания F0 с мухами дикого типа нами была получена только одна линия, которая имела вставку attP-сайта и репортерного гена mCherry по 5`-разрыву без удаления кодирующей части trf2.

Для того чтобы нивелировать эффект, связанный с высокой летальностью при делеции trf2, мы создали линию со сверхэкспрессией trf2 посредством сайт-специфической встройки его короткой изоформы в линию мух, содержащую attP-сайт в локусе 86Fb.

Инъекция смеси плазмид для редактирования не приводила к снижению выживаемости эмбрионов со сверхэкспрессией trf2. В результате нами получено по пять линий со встройкой репортерного гена mCherry как для делеции размером 6.7 т.п.н., так и 1.1 т.п.н.

Дополнительно мы протестировали данный подход на двух других генах, mep-1 и top2.

Белок MEP-1 способствует привлечению комплекса ремоделирования хроматина и деацетилирования гистонов (dNuRD) к значительному числу промоторов [9, 10]. Белок MEP-1 является важным регулятором раннего развития дрозофилы, и инактивация гена mep-1 приводит к эмбриональной летальности.

Как и в случае trf2, мы использовали две пары гРНК, производящих разрывы на расстоянии 5.6 и 2 т.п.н., для полноразмерной делеции и делеции только участка, содержащего старт-кодон, соответственно (рис. 2Б). Результаты, полученные при использовании разных схем замены гена mep-1 с помощью CRISPR/Cas9, представлены в табл. 1.

При инъекции смеси плазмид для редактирования мухи без сверхэкспрессии mep-1 имеют средний уровень летальности в течение развития. После индивидуальных скрещиваний мух F0 получена одна линия для полноразмерной делеции при использовании эмбрионов мух дикого типа и четыре линии на фоне сверхэкспрессии MEP-1. Таким образом, делеция mep-1 не является полностью летальной, однако, поскольку его сверхэкспрессия при делеции увеличивает выживаемость инъецированных эмбрионов, наблюдается увеличение эффективности редактирования.

Топоизомераза 2 (Top2) – фермент, снимающий топологическое напряжение с молекулы ДНК и способствующий поддержанию стабильности генома, участвует в ключевых клеточных процессах, таких, как репликация, транскрипция, рекомбинация [11].

Для замены участка гена top2 на посадочную платформу были выбраны гРНК на расстоянии 2 т.п.н. в интроне 5’-нетранслируемой области и экзоне 3. Смесь векторов для замены гена на платформу инъецировали в эмбрионы линии y¹w¹¹¹⁸. В потомстве от индивидуальных скрещиваний мух F0 с мухами дикого типа трансформантов не обнаружено. Однако при редактировании после встройки последовательности, кодирующей Тор2, в локус 86Fb получены три линии (табл. 1).

Использование Cas9 для редактирования генома часто приводит к возникновению дополнительных мутаций в других генах. В этом случае экспрессия ГИ на другой хромосоме позволяет оценить наличие дополнительных нецелевых мутаций в линии, гомозиготной по делеции ГИ. С помощью такого скрининга можно отобрать линии дрозофилы, которые не содержат дополнительных нецелевых мутаций.

Полученные линии Δtrf2, Δmep-1 или Δtop2 летальны в гомозиготном состоянии без дополнительной введенной копии ГИ, что свидетельствует о необходимости продуктов этих генов для выживания и дает первичное подтверждение успешной замены гена на attP-платформу. Встройка восстанавливающих конструкций (кодирующих нативные варианты генов) в линии с соответствующими посадочными платформами с дальнейшим удалением репортерных генов приводила к восстановлению жизнеспособности мух в гомозиготном состоянии. Таким образом, получены платформы для трех генов дрозофилы, которые позволяют детально исследовать ключевые белки TRF2, Top2 и MEP-1.

***

Работа выполнена при поддержке Российского научного фонда, грант № 19-74-30026.